Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד את המוח גרעינים במוח עכברוש neonatal בשיתוף עם האכלה קולוסטרום הראשון. טכניקה זו מאפשרת המחקר של אי ספיקה מזין הלחץ במוח מווסת על ידי enterocyte איתות.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד אוקסיטוצין-קולטן במוח עשיר גרעינים במוח neonatal לפני ואחרי האכלה קולוסטרום הראשון. הביטוי של חלבונים ידוע להגיב על מתח מטבולית נמדדה בהמוח-גרעינים מבודד באמצעות סופג המערבי. זה נעשה כדי להעריך אם חילוף החומרים מפגינות מזין אי ספיקה בגוף עורר מתח עצביים. בעבר הראו כי אי ספיקה התזונתי ב neonates מעורר מתח מטבולית בבטן. יתר על כן, אוקסיטוצין קולוסטרום ממיקרו סמני תגובת דלקת, autophagy מתח סלולארית villi בטן עכברוש היילוד לפני ואחרי ההזנה הראשונה. איתות סמני חלבונים הקשורים עם הלחץ רשתית תוך-פלזמית [אר המלווה מחייב בנוגדנים חלבון (ביפ), תרגום האיקריוטים חניכה גורם 2A (eIF2a), ו eIF2a קינאז קינאז R (p-PKR)], כמו גם שני דלקת איתות חלבונים [הפקטור הגרעיני-κB (NF-kB) ולא מעכב κB (IkB)], נמדדו ב גרעינים במוח היילוד [גרעין של דרכי בודד (NTS), הגרעין paraventricular (PVN), הגרעין העל-אופטיים (הבן), קליפת המוח (CX), גרעינים סטריאטום (STR), ו גרעין preoptic המדיאלי (MPO)] לפני השידור הראשון (unprimed על ידי קולוסטרום) ואחרי תחילת ההנקה (טענתי על ידי קולוסטרום). ביטוי של ביפ/GRP78 ו- p-eIF2a היו upregulated ב unprimed downregulated ברקמות NTS כאשר הבחינה. NF-kB נשמר (גבוהה) CX, STR ו- MPO הציטופלסמה, ואילו NF-kB היה נמוך ב- NTS, PVN, והבן לא השתנה בתוך שני התנאים. ביפ קולקטיבית של p-eIF2 ממצאים עקביים עם תגובת הלחץ. eIf2a היה phosphorylated על ידי dsRNA קינאז תלוי (p-PKR) הבן, CX, STR ו MPO. עם זאת, את NTS (ולא פחותה ב- PVN), eIf2a היה phosphorylated על ידי אחר קינאז, בקרה כלליים nonderepressible-2 קינאז (GCN2). מנגנוני הכוח ויסות מתח שנצפתה בעבר בטן היילוד enterocytes מופיעים כדי לבצע שיקוף של אזורים מסוימים במוח OTR-עשיר. NTS PVN עשויה לנצל את מנגנון זירחון שונים (תחת מחסור תזונתי) מאזורים אחרים, להיות עקשן ההשפעה של מחסור של מזון. באופן קולקטיבי, נתונים אלה עולה כי המוח תגובות סטרס אי-ספיקת מסתם מזין יוסטו על-ידי איתות מן קולוסטרום-איפה זה מונח enterocytes.

Introduction

בניגוד ההבנה שלנו של התפתחות המוח מוקדם המתרחשים במהלך ימים לשבועות לאחר לידה, יחסית מעט מאוד ידוע על עצום של שינויים דינמיים המתרחשים השעות הראשונות של החיים אצל חולדות. אתגר מפתח כבר גודל קטן של המוח עכברוש neonatal, דרישה עבור ההיי-טק כלים לבודד אזורים במוח דיסקרטית או תאים בודדים. מחקרים להעריך לעיתים קרובות ג'ין תמלול ותרגום לא1,2, אשר לא נותן הבנה מוצקה של רמות פונקציונלי של מולקולות איתות מופעל. אחרים לבחון את הביטוי תוך שימוש אימונוהיסטוכימיה לאזורים במוח הפניה, אשר אינה מאפשרת כימות של רמות הביטוי3. אף מחקר לתאריך בחן את הפעלת איתות מסלולים הקשורים קולוסטרום הראשון של חולדות להאכיל באזורים במוח דיסקרטית, המחייב בידוד מהיר, הקרבה, מדידה של זירחון חלבונים באמצעות ווסטרן וביטוי חלבונים סופג. בעוד microdissection במוח מתבצעת על המוח גדולים יותר ושנמצאת, לא איתרנו הפניה מבצע אגרוף מוח P0 שאינם חד-תאים במוח. מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד אזורים מוגבלים של המוח neonatal באמצעות טכניקה אגרוף יחסית low-tech ומערבון סופג הליך למדוד חלבון ביטוי בדגימות קטן יחסית. פרוטוקול זה עשוי להיות מתאים עבור שאלות המחקר הדורשים את ההערכה של ביטוי חלבונים ושינויים post-translational (למשל., זרחון) באזורים מוגבלים יחסית של מוח קטן של כל מין, ובלבד המשתמש יכול לזהות ויזואלית האזור במוח עניין עם אטלס וציוני לזיהוי.

שיטה זו פותחה כדי להבין את השינויים המתרחשים במוח כתוצאה קולוסטרום של החולדות neonatal הראשון להאכיל, אשר הינה עשירה אוקסיטוצין (OT). OT ידוע זמן רב בשל יכולתו לעורר ההתכווצות אכזבה, הרחם חלב. עם זאת, OT ידוע עכשיו לנגן מגוון רחב של תפקידים בוויסות תפקודים גופניים רבים, התנהגויות4. לדוגמה, OT מתנגדת מתח ודלקת בשיתוף עם התנהגויות affiliative מסתגלת5מעכב ריקון הקיבה, מאט את המעבר במעיים. OT קולטנים (OTR) זוהו העצבים המעית, אפיתל המעי-6,-7,-8. השפעת מערכת העיכול OT חשובים במיוחד הפעוטה במהלך התקופה לאחר הלידה המוקדמת. למשל, הנקה קשורה עם מסירת כמויות משמעותיות של OT9,הבטן neonatal10, הנתונים מראים כי OTR הוא בכבדות overexpressed ב- villi תריסריון במהלך החלב בהנקת התקופה8.

במבחנה ניסויים באמצעות קו תא הבטן הפגינו ברמה התאית שאוקסיטוצין ממיקרו חשוב המולקולות של הלחץ איתות לשביל11,12 , ממלא תפקיד רגולטורי בתרגום של חלבונים 12. מחקרים אלה מראים כי מרכיבי חלב, כולל אוקסיטוצין אקסוגני מהאמא חשובים תגובת חלבונים פרש ב- neonates כדי להפחית מתח הסלולרית13.

In vivo ו- ex-vivo מחקרים הראו כי קולוסטרום OT שמחליש את מתח סלולארית תגובת דלקת, autophagy סמני עכבר היילוד בטן villi. Enterocytes היילוד לסבול משמעותי הסלולר הלחץ בצד luminal שלהם כאשר הבטן חשוף בו זמנית microbiota מהאם קולוסטרום14,15 , חלבונים רבים, כולל הורמונים כגון OT9 , 10 , 16.

ההשפעות של OT על המוח כבר למדה17. עם זאת, מנגנוני איתות OT הפגינו בבטן במהלך התקופה לאחר הלידה המוקדמת לא נחקרו במוח. בנייר זה, שיטה אנליטית גרעינים במוח דיסקרטית עכברוש neonatal גזע המוח ואת ההיפותלמוס באמצעות אלקטרופורזה משמש פרופיל אזורי המוח מבודדים. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא ללכוד את המצב של התא איתות באזורים במוח קרוב ככל האפשר ללידה, לפני ואחרי את החלב הראשון מצויירת, ברקמת המוח עם גליה/עצביים המדד הנמוך. הרציונל לפיתוח של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת בידוד מהיר של אזורים במוח מוגבלת, מיקרוסקופיים הגורים neonatal עם אוסף יותר הומוגנית של נוירונים עבור ex-vivo מחקרים באמצעות סופג המערבי אוטומטיות מתודולוגיה, המציעה תוצאות עקביות מאוד על דגימות ביתור קטן יחסית. חסרונה של עבודה מוקדמת כולל יותר מגעיל לנתיחה (פרוסות המוח או כל המוח), בעלי חיים בוגרים18,19. המוח של הגורים הצעירים הם מאוד דינמי, ובו גלים של גליה הבידול לאחר הלידה. על מנת ללמוד שינויים במוח מושפע מאכילה הראשון של הגורים, לומד מוגבלת עצביים גרעינים עם ניתוח לשחזור הכרחי.

הזנה חלב בדרך כלל ניתוח ההשפעה שלה חיסוניות, תזונה בריאות או גנים ביטוי (לדוגמה, ב- enterocytes20,21), ואילו השפעתו על אזורים במוח במהלך התפתחות המוח הוא למד רק לעתים רחוקות. השפעת חלב המעבר בבטן על תפקוד המוח נותחו ביחס בטן כוליציסטוקינין קולטנים vagal ממסר גרעינים בגזע המוח, אך לא תאיים איתות המסלולים22. יש ספרות עצומה על פגיעות של המוח המתפתח neonate תזונה של אמהות במהלך ההריון23, אבל אותות מתח ודלקת שאינן מטופלות. חשוב, השיטה הנוכחית מנצלת תופעה ילודים יום-האפס עכברוש שמבודד הגירויים קולוסטרום דם-נולד מן vagal ממסר של גירויים מהבטן. זו התקופה היפו-תגובתיות מתח כביכול מאופיין על ידי גרעין לא בוגר tractus solitarius (NTS)-מעגל היפותלמי מיד לאחר הלידה24,25 המגבילה NTS, גרעין paraventricular (PVN), ו גרעין supraoptic (הבן) אותות לגירויים דם-נולד.

שיטה זו שימושית עבור ניתוח של מספר איתות המסלולים, יחסית מוגבלת תאים עצביים, ובלבד רקמת המוח הוא נקצרו יום לאחר הלידה-0 בחולדות, בנוסף אם יש לדו-קרב אמהות או לא על ידי כל סוג של טיפול במהלך ההריון. המלטות ניתן לנתח על ההשפעות של קולוסטרום להאכיל לעומת מראש האכלה איתות. בעת השוואה בין אותות בין אזורי המוח עם עניים לעומת התשואה עשירים בחלבון, שיטה זו מאפשרת קביעת בנים של חלבון הכולל של להקות מפוליפפטיד ב נימים עוברים במקביל החיסון-כימות של חלבונים אנטיגניים. שיטה זו מאפשרת השוואה כמותית, באמצעות יחידות שרירותי, התוצאות המתקבלות על ידי הנוגדן אותו בלי רגיל עקומות כמותיים על ידי התייחסות חלבונים הכולל בכל נימי. השוואת התוצאות המתקבלות באמצעות נוגדנים שונים אפשרי רק באמצעות עקומות סטנדרט כמותי.

שיטה זו איפשרה ההערכה של דו-כיווניות איתות המתרחשים בין הבטן, המוח יכול להשפיע פונקציה בשני האיברים26. הקשר בין צריכת אוקסיטוצין ומזון, אשר יש נחקרו בהרחבה בשנים האחרונות27, תומך קישור בין אוקסיטוצין מוגברת איתות זמינות חומרי הזנה. מחקרים אלה תומכים גם המושג הנגד אנרגיה גירעונות נמצאים ביחד עם הפחתות אוקסיטוצין היפותלמי איתות.

מחקרים מוקדמים יותר של השפעת בתנ ך על פעילות מוחית הראה כי דלקת מעיים המושרה elicited cFos שעתוק של קליפת PVN, האמיגדלה, מתוכנות piriform ההיפותלמוס אשר היה עקשן vagotomy28. עם זאת, אינפוזיה מערכתית וויבר עם סקרטין ירד התגובה cFos המוח תגובה דלקתית שעורר הבטן28. זה הציע כי ההשפעה של OT אקסוגני בוצע על ידי מסלולים חוץ ממסרי vagal, ואולי דרך מולקולות איתות נישא בדם מועבר6,postrema29אזור.

במחקר זה, הלחץ הסלולר איתות המסלולים אשר מקיימות בעבר בבטן היו העריכו במוח. ההשערה היתה כי רכיבי חלב עשויה להגן או דחה את ההשפעה של דלקת על הבטן חדירות כדי מטבוליטים מיקרוביאלי ואחרים, בתורו, ההשפעות על תפקוד המוח. הבדלי IkB ברורה עוינת נגד ביפ איתות נמצאו villi, לפני ואחרי לקרקע על ידי קולוסטרום13, הציע כי המוח של neonates, עדיין בתהליך של פיתוח, עשויים לחוש אותות אלה בטן קולוסטרום-induced.

איתות סמני חלבונים המשמשים הקודם ניסויים בטן הקשורים ללחץ תוך-פלזמית נמדדו. הם כוללים המלווה ER ביפ, תרגום חניכה פקטור eIF2a (המשמש כאמצעי לחץ התגובה אינטגרטור30), eIF2a קינאז p-PKR, ואת שני חלבונים איתות דלקת (NF-kB, מעכב שלה, IkB).

ששת אזורי המוח בהתבסס על יכולתם במבוגרים כדי להפריש או להגיב OT נבחרו. NTS, הממוקמת לשד העליון, הממסר הראשונה של הקלט מהבטן, מקבל איתות ישירה מן vagal החישה הניריונים בטן31 ו ציטוקינים וייתכן שנולד דם, רעלים, וכן הורמונים דרך האזור הסמוך-postrema32. PVN, supraoptic גרעין (הבן), גרעינים סטריאטום (STR), קליפת המוח (CX) וגרעין preoptic המדיאלי (MPO) לקבל איתות מהבטן דרך NTS.

תוצאות המחקר הראו כי את תגובת המתח הסלולר במהלך תקופת כמחנכת מיידית לפני קולוסטרום לקרקע, מיד לאחר האכלה הראשון שונה ב- NTS בהשוואה PVN ובנו. איתות ב- CX, STR ו MPO נבדל מזה של PVN ובנו, גם כן. הפונקציות מגן ברורים של OT שהוצג קודם לכן כדי לווסת את מתח התא ודלקת בבטן הם חשו סביר לפי אזורים מסוימים במוח. באופן קולקטיבי, הנתונים מצביעים על כי ברמה התאית, במהלך השעות הראשונות לאחר הלידה, המוח מגיב ללחץ מטבולית הקשורים עם אי ספיקה התזונתי. הנתונים גם מראים כי במידה ואת הכיוון של השפעות קולוסטרום להאכיל modulating הם תלויי האזור כי באזורים מסוימים, ראי תופעות OT הראו בעבר בבטן.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות באוניברסיטת קולומביה, מכון פסיכיאטרי של מדינת ניו יורק.

1. רקמות הכנה

  1. סדר חולדות הרות מתוזמן מן הספק.
  2. בצע מתוזמן חולדות בהריון על ידי התבוננות שלהם הבטן הגדלה השבועות לאחר הגעתם, לאחר מכן מחפש הגורים על תאריך המסירה הצפוי באמצעות בדיקת הכלוב כל שעתיים עד הלידה מתחילה.
  3. להסיר את הגורים עם יד בכפפה על ידי הזנב שלהם לפני המזון הראשון עבור הגורים unprimed (אין בטן חלב לבן הוא לכאורה בעת הצגת הבטן) או לאחר ההזנה הראשונה עבור הגורים כאשר הבחינה (ובשלב בטן לבנה יהיה גלוי על הבטן שלהם) כפי שמתואר את timeli ne (איור S1).
    הערה: ההזנה קולוסטרום הראשונה נקראת כמו הטרמה הכלבלב; לכן, גור הוא unprimed עד ההזנה הראשונה, לאחר מכן הם קולוסטרום-איפה זה מונח.
  4. במהירות לערוף הכלבלב unanesthetized באמצעות מספריים חדות, נקי כירורגי.
  5. מסירים את המוח על ידי חיתוך העור את קו האמצע ואת השטח העליון של הגולגולת האף. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, בעדינות לחטט משם העצם כדי לחשוף את המוח (איור 1 א') לשפה bregma, סימונו עם עט כמו הלוחות עצם מוסרות (איור 1B).
  6. במהירות מקום במוח כל תבנית המוח polymethyl methacrylate בטמפרטורת החדר במשך הפרונטליים עם פרוסות בטמפרטורת החדר (איור 1C).
  7. ללא דיחוי, להפוך 500 פרוסות בעובי מ מ בעזרת סכין גילוח טריים. להניח את פרוסות rostral כדי סימטרית בצלחת פטרי כדי לשמור על הכיוון של מקטעים (איור 2).
  8. להוסיף מלאכותי השדרתי (כלנית חדד; 1.0 מ מ ח'2PO4, 26 מ מ NaHCO3, 118.6 מ"מ NaCl, 3.0 מ"מ, אשלגן כלורי 203.3 מ מ-6 H2MgCl2O) ללא גלוקוז ובמהירות את הפרוסות במשך 60 דקות ב- 28-30 מעלות צלזיוס, זע ללא הרף על דגירה שאכר מסלולית לאתגר סמויה, באופן שונה את unprimed לעומת קולוסטרום-איפה זה מונח ברקמות.
  9. מזהים הגרעינים במוח הדרושים לתת אגרוף באמצעות אטלס של המוח33 וציוני אנטומי על סעיף הרקמה. המקום הזה פרוסה עם הגרעינים עניין בצלחת פטרי, להזיז את המיקרוסקופ ויבתר.
  10. פעם דמיינו, אגרוף במהירות 4 של 6 גרעינים שונים בעזרת כלי הקידוח, בחירת גודל אגרוף בצורה הטובה ביותר את הגרעין המדובר ועקבי בין דגימות (איור 2).
    הערה: הפרוסה המוח שנותרה כעת יש חור איפה רקמת המוח הוסר. במחקר זה, שאנחנו טוחנות האטומים הבאים באמצעות מתחת קואורדינטות. כל הקדמי/אחוריים (A / P) הקואורדינטות הן מ- Bregma (למעט NTS, אשר הוא ביחס Scriptorius Calamus). כל הגבי/הגחוני / (D/V) הקואורדינטות הן מפני השטח של קליפת המוח (למעט NTS, וזה מפני השטח של לשד). קואורדינאטות הבאות כוללות A / P, המדיאלי/לרוחב (M/L), ו- D/V במ מ: 1) בדרכי בודד גרעין (NTS, A / P, 0.4 ל 0.8; L, ± 0.2; D/V, 0.3 (מפני השטח של לשד), 2) גרעין paraventricular (PVN,-0.8; ± 0.2; 0), 3) הגרעין העל-אופטיים (בן,-1.1; ± 1.4; 4.3), 4) בקליפת המוח (CX, קליפת חלקית אזור 1,-2.8; ± 1.5; 0.6), 5) סטריאטום גרעינים (STR,-0.0; ± 1.6; 1.8), ו-6) preoptic המדיאלי גרעין (MPO,-0.6; ± 0.2; 4.2).
  11. במהירות לטבול גרעינים מנוקב ב 0.06 גרם חלבון קר כקרח, חילוץ מאגר המכיל מעכבי פרוטאז ו פוספטאז מעכבי על 60 דקות (ראה שלב 2.3).

2. חלבון החילוץ

  1. להכין את הפתרון החילוץ חלבון באמצעות ערכת פירוק חלבון (טבלה של חומרים) ביום שלפני מסירת הגור הצפוי.
  2. להפשיר (בקירור) הפתרון מימית קפואים (-20 ° C) של מעכבי פרוטאז, פוספטאז של ערכת מאגר פירוק ולמקם את פירוק מאגר ואת דימתיל סולפוקסיד פתרון של מעכבי פרוטאזות/phosphatases על קרח.
  3. הוסף 1.85 מ של פירוק מאגר לתוך צינור נקי, קר כקרח 15 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 0.1 מ ל תמיסה מימית של מעכבי ו 0.05 מ של מעכבי דימתיל סולפוקסיד התפרקה. לבסוף, והמעיל בקצרה מערבולת הצינור ולשמור אותו ב-20 ° C עד השימוש.
  4. תווית צינורות נקיים microcentrifuge 24 (0.5 מ ל כל אחד) עבור הליך פירוק. צינורות 12 המיועד לכל המוח עבור קבוצה קולוסטרום-unprimed (U) [6 (L) על ימין ועל שמאל 6 גרעינים במוח (R) נכון] וכן על פי ראשי התיבות של גרעינים, צד, תנאי (למשל-NTS-L-U, NTS-R-U, וכדומה). תווית הקבוצה השנייה של צינורות 12 עבור דגימות קולוסטרום-איפה זה מונח.
  5. תווית שתי סדרות נוספות של הצינורות כפי שנעשה צעד 2.4 תמציות חלבונים מניות (באמצעות צינורות 1.5 mL גלאים בסגנון) ועבור הקבוצה הראשונה של הכנת הדוגמא (באמצעות צינורות 0.5 מ"ל). שמור הצינורות האלה שתי נפרד, שכותרתו מקפיא תיבות (כל אחד מיועד צינורות 100). קופסא אחת ישמש עבור הדגימות unprimed והשני עבור הדגימות כאשר הבחינה.
  6. להפשיר את הפתרון פירוק על קרח ביום בו הגורים יימסרו, ובזמן המקננת פרוסות המוח כלנית חדד, aliquot 0.06 mL פתרון פירוק לתוך הצינורות הליך פירוק (מתוך שלב 2.4) להוסיף גרעינים אגרופים, דגירה קרח למשך 60 דקות.
  7. Centrifuge גרעינים lysed incubated למשך 30 דקות ומפרידה מיני מקורר-14000 סל ד (10,000 x g), בזהירות תשאף 0.055 גרם של תגובת שיקוע עם פיפטה להגדיר כראוי. להעביר את תגובת שיקוע לתוך הצינורות מניות mL 1.5 טרום מקורר (מתוך שלב 2.5) ולשים אותם על קרח. לפני הקפאת (ב-20 ° C) הצינורות מניות חלבון, להעביר 0.012 מ של תגובת שיקוע לתוך הצינורות טרום מקורר 0.5 mL לשם הכנת המדגם הראשון (מתוך שלב 2.5) ולהשאיר אותם על קרח.

3. משאבות למדידה חלבון בנים

  1. להשתמש ערכת ולהתכונן ריאגנטים את ההפרדה על פי הוראות היצרן. להוסיף כל הדגימות 12 ב 0.5 mL שכותרתו צינורות (מתוך שלב 2.5) על הקרח המכילים 0.012 מ של תמציות חלבונים 0.003 מ"ל של ריאגנט מאסטר-מיקס.
  2. להפעיל את הבלוק חימום עד 95 ° C ולהוסיף mL 0.004 מהתרכובת המבושלות צעד 3.1 בסולם (MW) משקל מולקולרי biotinylated בשפופרת עם 0.016 מ ל מים יונים. Denature את הסולם ודוגמאות, למקם את הצינור הסולם והדוגמאות 12 של תמציות חלבונים unprimed בגוש החום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לאחסן אותם ב 4 ° C עד השימוש.
  3. חזור על הצעדים 2.0 ל 3.2, בין חלבון החילוץ כדי הכנת הדוגמא, גרעינים אגרוף של חולדות קולוסטרום-איפה זה מונח.

4. אלקטרופורזה הכנה

  1. להפשיר את ביוטין תיוג ריאגנט (המאוחסן במקפיא עמוק ב-80 oC) על הספסל ולהכין ערכת זיהוי חלבונים על הקרח ב 4 ° C בעקבות הוראות היצרן.
  2. לערבב מ 0.15 ל הלומינול 0.15 מ של מי חמצן, לטעון 0.01 mL לתוך בארות 25 (שורה E, בארות 1-25) של הצלחת למכונת המערבי אוטומטית. לטעון 0.008 מ של Streptavidin-HRP הערכה לתוך בארות D1 D25
  3. לטעון 0.01 מ של הפתרון diluent נוגדנים לתוך בארות C1 C25, B1.
  4. ספין הסולם צינורות בקצרה (2-3 שניות) ודוגמאות חלבון 24 ב minicentrifuge למאגר במורד המים המתאיידים מ הפקקים שפופרת.
  5. לטעון 0.003 מ"ל של 12 דגימות unprimed לתוך בארות A2 A13, 0.003 מ"ל של 12 דגימות קולוסטרום-איפה זה מונח לתוך בארות A14 כדי A25 של mL 0.005 של הסולם biotinylated לתוך A1 היטב.
  6. להשאיר את השורה F ריק וטען mL 0.45 שטיפת מאגר לתוך כל אחד 5 תאים בכל השורות 3 מתחת לשורה פ כיסוי לצלחת עם מכסה פלסטיק כדי למנוע התאיידות במהלך ההליכים הנותרים.
  7. בקצרה מערבולת ביוטין המופשרים תיוג ריאגנט ולהוסיף mL 0.15 מהתרכובת צינור המיועד שלה; ואז להוסיף אליו 0.15 מ של הסוכן שיחזור חלבון הכולל ומערבבים אותם עד הומוגניות.
  8. הסר את המכסה הצלחת וטען 0.01 מיליליטר סוכני 1 ו- 2 לתוך בארות B2 כדי B25. מכסה את הצלחת, centrifuge זה 10 דקות ב 1000 g x כדי להסיר את כל בועות האוויר מן הפתרונות השונים. השתמש צלחת ריקה בצנטריפוגה לאיזון.

5. אלקטרופורזה

  1. בעוד הלוח מסתובב, לפתוח קובץ ריצה אוטומטית מערבי מכונת-attached במחשב המציין בעמוד הנפתחת מתוך "קובץ" כדי להפעיל שיטת הכולל ולחיצה על המקום המתאים.
  2. הוספת ביאורים הדגימות מאת טוב במחשב. לאחר מכן, הסר את הלוחית של צנטריפוגה הסר הכיסוי, לקלף בזהירות את מכסה אלומיניום מן התאים פתרון ההפרדה.
  3. למקם את הצלחת המכשיר המערבי אוטומטיות לקלף את הכיסוי מהתיבה מחסנית נימי, הכנס את מיכל הדיו במקומו המיועד, סגור את הדלת.
  4. לחץ על "RUN" הלחצן ולאחר כשתתבקש עם הסוג של וזמינותו ("חלבון הכולל"), הקלד את השם הדגימות (לדוגמה, "unprimed 2-13 ו קולוסטרום-איפה זה מונח 14-25"). לחץ על "אישור" ולאחר כאשר תתבקש על ידי תאריך ריצה מופעל מספר מזהה של קובץ הפעלה, עליך לרשום הזמן כאשר הפעולה תסתיים.
  5. בסוף המרוץ (170 דקות לאחר ההתחלה), פתח את הדלת כלי להסיר את מחסנית נימי, למחוק אותו לתוך לרשות שרפ. למחוק את הצלחת ב לרשות החומר הביולוגי.
  6. לחץ על הסמל ' עקומות ' הפרדה בדף ניתוח של קובץ ריצה ובדוק כי כל הדגימות לרוץ כמו שצריך, מופיעים מספר עקומות חלבון בכל נימי הדם.

6. ניתוח של איתות חלבונים

  1. בשפופרת mL 1.5 שכותרתו, להוסיף 0.003 מ"ל של ארנב אנטי-נוגדן פוספו-eIF2a (p-eIF2a) וכן להשעות אותו ב- mL 0.3 (דילול מטריים) בנוגדן diluent הערכה זיהוי מתאימים. לאחר מכן, לשמור את זה על קרח.
  2. תווית צינור הלומינול להוסיף 0.15 מ של הלומינול ו- 0.15 מ ל מי חמצן זו ערכת מודול זיהוי, מדבקות/ברקודים 0.01 mL לתוך בארות E1 כדי E25 של צלחת במערב רעננה, אוטומטית.
  3. לוותר על 0.01 מ של המשני אנטי-נוגדן ארנב לתוך בארות D2 כדי D25, ולהוסיף 0.01 מ של streptavidin-HRP הערכה D1 היטב.
  4. לוותר על 0.01 מ של הנוגדן הראשי (מתוך שלב 6.1) לתוך בארות C2 כדי C25, ולהוסיף 0.01 מ של נוגדן פתרון 2 diluent בארות C1 ו- B1 ועד B25.
  5. השאר הבארות F שורה ריקה ולמלא mL 0.45 שטיפת מאגר לתוך 5 תאים של 3 שורות מתחת לשורת F.
  6. בקצרה לסובב את הדגימות בקירור 3 s, ולהוסיף 0.003 מ"ל של כל מדגם row A באותו סדר הוספתם עבור וזמינותו חלבון מוחלט, החל מ- A2 ל A25. הוסף mL 0.005 של הסולם MW biotinylated טוב A1 ולאטום את הצלחת.
  7. Centrifuge את הצלחת כפי שנעשה צעד 4.8. בעוד הלוח מסתובב, פתח (ב תוכנה אוטומטיות המערבי-הקשורים והמחשב) קובץ ריצה חדש ולציין בעמוד הנפתחת מתוך "קובץ" לרוץ assay גודל מולקולרי על ידי לחיצה על המקום המתאים.
  8. בעמוד assay, להקליד את שמות דוגמת בכל נימי ולאחר מכן הקלד את השם של נוגדן ראשוני המקום שהוקצה, נוגדן אנטי-ארנב משני מתחתיו.
  9. בסוף צנטריפוגה, חזור על השלבים 5.3 – 5.5, אלא על השם נתן קובץ ריצה הפעם להיות "p-eIF2a-unprimed 2-13 ו- 14 – 25 קולוסטרום-איפה זה מונח".
  10. לאחר ההפרדה אלקטרופורזה, בדוק את קובץ ריצה על החיסון-תגובתיות הפסגות של אנטיגנים בגדלים של 40 – 43 kDa. איפה מגוואט של פסגות גודל זה חסרים, לחץ לחיצה ימנית על מתחת העקומה ולציין בתוך הרשימה הנפתחת כדי להוסיף MW הפסגה, אשר מבטיח הגודל והכמות שרירותי מתחת העקומה נרשמים.

7. עיבוד התוצאות

  1. פתח קובץ הגיליון האלקטרוני עבור חלבון הכולל לרוץ המערב אוטומטיים הפעל קובץ ולספק מספר זהות.
  2. פתח את קובץ ההפעלה של וזמינותו חלבון הכולל בדף ניתוח בכל מצב עקומת ולסמן את כל הפסגות של נימים בודדים. לאחר מכן, להעתיק, להדביק אותם לתוך הגיליון, לסכם את האזורים תחת עקומת כל הפסגות טלקוה את נימי כולו.
  3. בעמודה נפרדת, לארגן את הסכום הכולל של חלבון עבור כל עמודה עם נימי מספרים, שמות של הגרעינים במוח בהתאמה, את מספרי הזיהוי של קבצי הפעלה.
  4. פתח את גיליון אלקטרוני עבור אנטיגן p-eIF2a, בעמודה בודדת, להקליט את האזור מתחת העקומה של כל נימי side-by-side שלה מספר נימי בהתאמה, שם גרעין המוח, ואת מספר מזהה של קובץ הפעלה.
  5. להעתיק את העמודה הכוללת חלבון (במקביל הכמויות עקומת p-eIF2a) לתוך גיליון אלקטרוני השלישי ולחישוב p-eIF2a:total יחס חלבון בעמודה השלישית.
  6. איסוף תוצאות שלבים 4 עד 6 עבור כל גרעין המוח, לארגן אותם בקבוצות של גרעינים ולהפיק גרף עמודות.

תוצאות

הלהקות נציג של immunoreactivity ביחס חלבון הכולל להראות כי קיימים גרעינים במוח עם חלבון שנקטפו נמוך מאוד. פעולה זו דורשת שימוש הטכניקה תספיג אוטומטיות, אשר היא רגישה מאוד בהשוואה את תספיג הקנוני. גישה זו ניתן להפעיל עם פחות fortyfold חלבון לכל נימי בהשוואה לכל-השביל בין שהכלים המערבי...

Discussion

טכניקה עבור microdissection של בדידה, OTR-עשיר המוח גרעינים במוח neonatal העכברוש מוצג בעיתון הזה. הוא מוכר היטב כי הנוירונים הם מאוד מיוחדים, אפילו בתוך הגרעינים מאופיין היטב במוח. זו גישה מאוד לשחזור לבודד את הגרעינים OTR-עשיר מסוים מאפשרת בדיקת השערות חזקים. באמצעות סופג המערבי אוטומטיות, העקביות והע?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה מאנון הפקחים אלכסנדרה שולץ לסיוע שלהם בהכנת פרוטוקול זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bradford solutionBio Rad
Protein lysis kitProtein simpleCBS403Bicine/CHAPS
WES kitsProtein simpleWES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugateProtein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2aCell Signaling technologySER51, 9721
mouse mAb anti-PKRCell Signaling technology2103
Rabbit anti-phospho-PKRMilliporeThr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKRCell Signaling technology12297
rabbit mAb anti-GAPDHCell Signaling technology2118
mouse mAb anti-phospho-IKBCell Signaling technology9246
mouse mAb anti-IKBCell Signaling technology4814
rabbit anti-BiPCell Signaling technology3183
Rabbit anti GCN2Cell Signaling technology3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2BIORBYTT899
pregnant Sprague-Dawley ratsCharles River Laboratories
Punch deviceWellTech Rapid Core or Harris Uni-Core0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?. Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141tractus solitarius NTSnonderepressible 2 GCN2kB NF kB2A eIF2a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved