نموذج رواية في المختبر للانفجار إصابات الدماغ الرضية

Summary

وتصف هذه الورقة نموذج رواية من إصابات الدماغ الرضية الانفجار الرئيسي. يتم استخدام أنبوب الهواء المضغوط صدمة مدفوعة لفضح في المختبر الماوس شريحة هيبوكامبال الثقافات إلى موجه صدمة واحدة. هذا بروتوكول بسيط وسريع توليد إصابة في أنسجة الدماغ استنساخه مع إنتاجية عالية.

Abstract

إصابات الدماغ الرضية سبب الرئيسي للوفاة والعجز في العسكرية والسكان المدنيين. انفجار الدماغ الإصابة نتيجة تفجير الأجهزة المتفجرة، إلا أن الآليات التي تكمن وراء تلف المخ الناجم عن التعرض يركب الانفجار ليست مفهومة تماما ويعتقد أنها فريدة من نوعها لهذا النوع من إصابة في الدماغ. النماذج السريرية هي الأدوات الحاسمة التي تسهم في فهم أفضل لإصابة في الدماغ الناجم عن الانفجار. تم وضع نموذج تبي انفجار رواية في المختبر استخدام أنبوب صدمة مفتوحة لمحاكاة موجات الانفجار فتح مجال الحياة الحقيقية على غرار طريق الموجي فريدلاندر. ماوس C57BL/6N أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات قد تعرضت لموجات صدمية واحدة واتسم وضع إصابة ما يصل إلى 72 ح استخدام يوديد propidium، علامة نيون راسخة من تلف الخلايا إلا أن تخترق الخلايا مع اختراق الأغشية الخلوية. يوديد Propidium الأسفار كان أعلى بكثير في شرائح تتعرض لموجة انفجار عند المقارنة مع شرائح شام طوال المدة البروتوكول. إصابة أنسجة المخ استنساخه جداً وبما يتناسب مع وسيلة ذروة موجه صدمة تطبيقها.

Introduction

إصابات الدماغ الرضية الانفجار (تبي) هو نوع معقد من إصابة في الدماغ ناجم عن تفجير الأجهزة المتفجرة^1،2. برز الانفجار تبي قضية صحية رئيسية في السنوات ال 15 الماضية بالصراعات العسكرية الأخيرة في العراق وأفغانستان^2،3. وإجمالا، يقدر أن بين 4.4 في المائة و 22.8 في المائة من الجنود العائدين من العراق وأفغانستان قد عانى خفيف تبي، نسبة كبيرة من هذه يجري المتصلة بالانفجار، مع ارتفاع معدل الإبلاغ عن انفجار تبي في القوات الأمريكية بالمقارنة مع قوات المملكة المتحدة^{4 ،5}.

استخدام الأجهزة المتفجرة المرتجلة كانت مسؤولة عن معظم من الصدمة النفسية المرتبطة بالانفجار، بما في ذلك انفجار تبي، التي يعاني منها القوات العسكرية⁶. أسفر تفجير عبوة ناسفة سريعة جداً – لكن عابرة – زيادة في الضغط، التي تحدث في ميلي ثانية. هو على غرار موجه يركب الناتجة من انفجار حقل تحرير الحياة الحقيقية بواسطة الدالة فريدلاندر، مع ارتفاع مفاجئ لَيَرْكَبُ ذروة متبوعاً تحلل أسي^7،8. عادة هي لم تشهد مجموعة القوى المتطرفة ودورتهم الوقت السريع ينظر في حدث انفجار في صدمات غير انفجار^1،9. وسيلة الذروة، وهو أقصى ضغط للموجي، ومدة موجه إيجابية ويعتقد أن الهامة المساهمة في الانفجار إصابة في الدماغ، وهذه تعتمد على شحنة ناسفة والمسافة من تفجير^{10، 11}.

الصدمة أن تصنف النتائج من انفجار متفجرات أربعة مكونات منفصلة، عينت كانفجار الابتدائي والثانوي، والتعليم العالي ورباعي إصابة^10،12،،من¹³¹⁴. كل عنصر من هذه العناصر يرتبط مع آليات محددة للإصابة. الإصابة الأولية انفجار ناجم عن العمل المباشر لَيَرْكَبُ موجه للأعضاء والأنسجة^2،13. انفجار ثانوي نتائج الأثر إصابة من شظايا قذيفة، مما تسبب في اختراق واختراق غير الجروح^2،15. عند إصابة الانفجار الثالث جثة الضحية مشردون ضد الأرض أو الأجسام المحيطة بها، ويرتبط بالتسارع/التباطؤ القوى^1،،من¹⁰¹³. إصابة الانفجار رباعي يصف مجموعة غير متجانسة من الإصابات المتصلة مباشرة بالانفجار غير مشمولة بأول إصابة ثلاث آليات وصف^12،13. أنها تشمل (ولكن لا تقتصر على) الإصابة الحرارية واستنشاق الدخان، والإشعاع، والموجات الكهرومغناطيسية، والآثار النفسية السلبية^13،15. تبي المرتبطة بانفجار معظم النتائج مباشرة من الآليات الثلاث الأولى من الإصابة، بينما آليات الإصابة الانفجار رباعي ترتبط عادة بالإصابة الجهازية¹³. الآثار التسارع/التباطؤ القوى (مثلاً، الإصابة)، بصراحة، واختراق إصابات الدماغ الرضية قد درسنا على نطاق واسع فيما يتعلق بأنواع أخرى من تبي (مثلاً، حوادث السيارات، السقوط، إصابة القذائف التسيارية). ومع ذلك، يركب موجه الانفجار الرئيسي فريدة من نوعها لإصابات في الانفجار وآثاره على أنسجة المخ مفهومة جيدا أقل بكثير¹⁶. الآليات إصابة الانفجار الرئيسي، المرتبطة بموجة وسيلة، وهي أولى قوي ميكانيكية للتفاعل مع الدماغ.

-تم تطوير نماذج تبي السريرية العديدة على مدى العقود الماضية التي كانت لا تقدر بثمن لفهم آليات تبي الانفجار من الإصابة والفيزيولوجيا المرضية والتحقيق العلاجات الجديدة المحتملة، التي وإلا سيكون من المستحيل القيام به حصرا في السريرية تعيين^17،،من¹⁸¹⁹. على الرغم من أنه لا يوجد نموذج واحد الإكلينيكية يمكن إنتاج الطابع المعقد لصدمات الدماغ الانفجار السريرية، عادة مختلف نماذج تبي السريرية تكرار جوانب متميزة من تبي البشرية. يمكن دراسة عمل ضار القوات المرتبطة بانفجار انفجار في عزلة أو في تركيبة في نماذج تبي الانفجار في المختبر و في فيفو . نماذج في المختبر لها ميزة السماح رقابة صارمة من البيئة التجريبية (الظروف الفسيولوجية الأنسجة وإصابة الميكانيكا الحيوية)، مما يقلل من التنوع البيولوجي، ويحسن من إمكانية تكرار نتائج، تسمح بدراسة تتالي الجزيئية الخاصة دون الإرباك موجودة في الحيوان نماذج²⁰. أن هدفنا وضع نموذج في المختبر للتحقيق في آثار الانفجار الرئيسي على أنسجة المخ. نحن تهدف إلى تطوير نموذج مع shockwave الأسرع من الصوت مع ممثل الموجي فريدلاندر انفجار حقل مجاناً مثل التي تنتجها جهاز متفجر مرتجل (العبوات الناسفة).

Protocol

التجارب الموصوفة في هذه المخطوطة تم القيام به امتثالا لقانون "المملكة المتحدة الحيوانات" (إجراءات علمية) لعام 1986، ووافق عليها بالرفق بالحيوان والأخلاقية استعراض الجسم من امبريال كوليدج لندن. وكان رعاية الحيوان امتثالا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من "امبريال كوليدج لندن".

1-هيبوكامبال أورجانوتيبيك شريحة الإعداد والثقافة

ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول إنتاج شرائح أورجانوتيبيك هيبوكامبال وفقا لأسلوب واجهة وصف ستوبيني والزملاء مع إدخال تعديلات طفيفة عليها^21،،من²²²³. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن euthanized الحيوانات لا يزيد عن ثلاثة، وتشريح في دورة واحدة لضمان كل خطوة يتم سريعاً وتجنب المساس بنوعية الشرائح. استخدام الأسلوب العقيم في جميع أنحاء.

1. ضمان اتخاذ الخطوات التالية قبل بدء تشغيل البروتوكول تشريح.
   1. إعداد وتصفية تعقيم جميع الحلول مسبقاً باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
   2. تبقى الحلول في 4 درجات مئوية أثناء التخزين وطوال تشريح الدماغ وإعداد شريحة هيبوكامبال بإبقاء حاويات التخزين وأطباق بيتري في بالوعة الحرارة معدني يجلس على الجليد الرطب في جميع الأوقات.
   3. اﻷوتوكﻻف معدنية جميع الصكوك وخواتم وأنسجة الورقة.
   4. ضمان جميع الأدوات والمواد لاستخدامها لكل خطوة من البروتوكول جاهزة للاستخدام، المنصوص عليها في وقت مبكر ورش مع الإيثانول 70%. التأكد من أن يسمح لهم بتهدئة والجاف.
2. Euthanize يوم 5-7-C57BL/6N القديمة الماوس ألجرو بخلع عنق الرحم ويمسح سطح الجلد كله بإيجاز مع ورقة العقيمة والأنسجة غارقة في الإيثانول 70%. بات الجلد الجاف وقطع رأس ألجرو استخدام مقص مايو كلينيك.
3. قطع الجلد فروة الرأس مع مقص آيريس على طول خط الوسط الرأس ابتداء من منطقة والقفويه وتنتهي قرب الآنف وأتراجع أفقياً.
4. إدراج غيض مقص فانس في ماغنوم ثقبة وجعل التخفيضات الجانبية الصغيرة اثنين في العظام على طول الجيوب الأنفية عرضية، ثم قطع الجمجمة على طول خط الوسط حتى لمبة شمي وإجراء تخفيضات صغيرة اثنين عمودياً على خط الوسط في هذه المنطقة.
5. استخدام غرامة نقطة منحنى ملقط وسحب اللوحات عظم أفقياً بعيداً عن خط الوسط، بعناية إزالة الدماغ مع ملعقة صغيرة ونقلها إلى 90 ملم سيليكون الاستومر المغلفة بيتري طبق يحتوي على "تشريح المتوسطة".
   ملاحظة: المتوسط تشريح متوازنة في جي الحل الملح (5 ملغ/مل د-الجلوكوز، حل مضاد حيوي فطري 1%، مع 10,000 وحدة/مل البنسلين، ستربتوميسين 10 ملغ/مل و 25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب).
6. إزالة المخيخ وفصل في نصفي الكرة الدماغي على طول خط الوسط باستخدام شفرة حلاقة. استخدام ملعقة لنقل نصفي الكرة الدماغي إلى سيليكون 90 ملم جديدة طبق بيتري المغلفة الاستومر مليئة بتشريح المثلج الطازجة المتوسطة. إذا كان أكثر من الحيوانات لاستخدامها في جلسة عمل واحدة، كرر الخطوات من 1.2 – 1.6.
7. تحت ستيريوميكروسكوبي، قطع لمبة شمي وغيض من القشرة الأمامية مع شفرة حلاقة وفصل قشرة الدماغ عن بقية الأنسجة الدماغية باستخدام الملقط تلميح جيد. يترك هذه الخطوة الحصين مكشوف على السطح الآنسي للأنسجة القشرية. من هذه الخطوة، استخدام غطاء زراعة الأنسجة الاندفاق الصفحي (الأشعة فوق البنفسجية تعقيمها وتنظيفها بمحلول الإيثانول 70%).
8. تطبيق المتوسطة تشريح المثلج إلى قرص تقطيع بلاستيك المسطحة، واستخدام ملعقة، ضع أنسجة المخ على القرص بالسطح الآنسي للقشرة هو مواجهة ومحور الحصين عمودي على المحور بليد تقطيع.
9. إزالة قدر الإمكان المتوسطة تسلخ من تقطيع القرص باستخدام تلميح جيد ماصة باستور.
10. قص الدماغ إلى 400 ميكرون شرائح باستخدام مروحية أنسجة بسرعة تقطيع 50% والقوة.
    ملاحظة: من المهم جداً القيام بهذه الخطوة بسرعة قدر الإمكان كما أنسجة المخ هو عدم غارقة في تشريح المتوسطة.
11. استبدال المتوسطة تسلخ في طبق بيتري سيليكون الاستومر المغلفة بالمتوسطة المثلج الطازجة.
12. بمجرد الانتهاء من المروحية الأنسجة بعناية غمر أنسجة المخ في تشريح الطازجة المتوسطة، ونقل قطع الأنسجة إلى 90 ملم سيليكون الاستومر المغلفة بيتري الطبق باستخدام مشرط بليد مستقيمة.
13. تحت ستيريوميكروسكوبي، بعناية منفصلة الشرائح القشرية استخدام الملقط تلميح جيد. لكل شريحة، تفقد الحصين مورفولوجية واحتمال تلف الأنسجة الناتجة عن التشريح أو تقطيع.
14. فصل في هيبوكامبي من قشرة انتورهينال ومن فيمبريا استخدام الملقط تلميح جيد والمقص فانس الصغيرة. عادة، يتم إنشاء حوالي 6 إلى 8 شرائح هيبوكامبال كل نصف الكرة الأرضية.
15. نقل تصل إلى 6 شرائح هيبوكامبال إلى إدراج زراعة الأنسجة استخدام قطع ماصة باستور ومكان داخل 35 مم بيتري طبق. تأكد من أن الشرائح وتنتشر إلى جانب بضعة ملليمترات (وهذا يضمن يمكن تصويرها كل شريحة على حدة).
16. فور إضافة المثلج "المتوسطة النمو" في الجزء السفلي من كل طبق بيتري، ضمن إدراج زراعة الأنسجة، أسفل الجزء العلوي من زراعة الأنسجة إدراج ريم.
    ملاحظة: النمو المتوسط يحتوي على 50% الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ايجل، 25% هانكس متوازنة الحل الملح ومصل الحصان 25%، 5 ملغ/مل د-الجلوكوز، 2 ملمول/لتر لتر-الجلوتامين، 1% محلول مضاد حيوي فطري و 10 ملمول/لتر حبيس، معاير للرقم الهيدروجيني 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم.
17. تغيير المتوسطة النمو اليوم بعد التشريح و 2 إلى 3 ثم كل يوما بعد ذلك (استخدام متوسط النمو في 37 درجة مئوية). ضمان أن يضاف المتوسطة النمو بقدر كاف، ولكن ليس ذلك بكثير من تجاوزات على الغشاء إدراج زراعة الأنسجة، التي يمكن أن تعرض للخطر بقاء شرائح الأنسجة.
18. تبقى شرائح الأنسجة في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون في الجو لمدة 12 إلى 14 يوما قبل استخدامها في التجارب.

2-إعداد الشرائح أورجانوتيبيك هيبوكامبال للبروتوكول تبي انفجار تجريبي

ملاحظة: جميع الخطوات لهذا القسم، باستثناء التصوير، تجري في غطاء زراعة الأنسجة الاندفاق الصفحي.

1. إدراج حلقات الفولاذ المقاوم للصدأ مصنوعة خصيصا في لوحة جيدا 6 (واحد لكل بئر).
   ملاحظات: الحلقات حافة مع الشق (التي ينبغي الجلوس في 12:00 م) وتناسب شكل مريح داخل الآبار، بينما زراعة الأنسجة بإدراج تناسب بسهولة في هذا ريم. ضمان أن الخواتم تغسل بمطهر جراثيم، ودقة شطفها بالمياه النقية، يعقم والسماح لتبرد مقدما.
2. ملء البئر للوحة 6-جيدا مع حرارة مسبقاً (37 درجة مئوية) خالية من مصل تجريبي المتوسط "مع يوديد propidium.
   ملاحظة: المتوسطة التجريبية مع يوديد propidium: 75% الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ايجل, 25% هانكس متوازنة الحل الملح، 5 ملغ/مل د-الجلوكوز، 2 mmol/لتر لام الجلوتامين، حل مضاد حيوي فطري 1%، 10 ملمول/لتر حبيس ويوديد propidium 4.5 µmol/L، الأس الهيدروجيني معاير إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم.
3. ضمان أن لا تصل إلى مستوى المتوسط أعلى درجة الحلقة. نقل لوحة 6-جيدا مع عصابات مرة أخرى إلى حاضنة ح 1 لضمان أن الوسيطة في حالة في 37 درجة مئوية فورا قبل أن يتم نقل إدراج زراعة الأنسجة.
4. نقل إدراج زراعة الأنسجة مع شرائح أورجانوتيبيك من أطباق بتري 35 ملم في لوحة 6-جيدا مع عصابات والمتوسطة التجريبية بالملقط.
5. جعل نقطة على حافة إدراج في الموضع 03:00 ص بواسطة قلم ماركر دائمة.
   ملاحظة: سوف تدرج المراد إزالتها من لوحة 6-جيدا من خلال التجربة وهذه الخطوة تسهل إعادة الإدراج إلى موضعه الأصلي بعد التعرض موجه الصدمة وعلى سهولة تتبع كل شريحة في جميع أنحاء البروتوكول.
6. قم بتسمية كل لوحة 6-جيدا مع اسم فريد & التاريخ وجعل خارطة آبار كل لوحة، تسمية كل بئر (مثلاً.، أ، ب، ج، إلخ.) وكل شريحة في كل بئر (مثلاً.، 1، 2، 3، إلخ.)، حيث يكون لكل شريحة معرف فريد ( على سبيل المثال.، A1، A2، A3، إلخ.).
7. نقل لوحة 6-جيدا للحاضنة ح 1 ضمان الشرائح في 37 درجة مئوية قبل التصوير مباشرة.
   ملاحظة: تجنب تجاوز السعة المتوسطة أو إدراج أي فقاعات الهواء تحت ثقافة أنسجة الغشاء، الذي يمكن أن يعرض للخطر بقاء الشرائح.
8. 1 ح بعد نقل إلى المتوسطة التجريبية، صورة كل شريحة مفردة استخدام مجهر الأسفار (2 X الهدف، نا 0.06) مزودة الإثارة المناسبة (BP 535/50 nm) وتصفية الانبعاثات (610 ليرة لبنانية nm) لتقييم صحة شريحة قبل الإصابة تنفذ البروتوكول.
   ملاحظات: الشرائح الذي يحمل مناطق حمراء كثيفة تلطيخ في هذه المرحلة ينبغي أن يقدم السلامة الشبهة وينبغي أن تستبعد من مزيد من التحليل (هذه تمثل أقل من 10% العدد الإجمالي للشرائح التي تم إنشاؤها عادة). ضمان أن يتم إجراء تصوير بطريقة متسلسلة، وفي أسرع وقت ممكن تقليل الوقت الذي تكون الشرائح خارج الحاضنة (عادة الآبار 6 ينبغي أن تأخذ فقط تحت 30 دقيقة للصورة).
9. الحفاظ على غطاء لوحة 6-بئر في جميع الأوقات. يمكن بناء بعض التكثيف داخل الغطاء. إذا حدث هذا، بإيجاز استخدام مجفف على إعداد منخفض.
10. التأكد من أن جميع ظروف التصوير متطابقة في أيام مختلفة، وبين التجارب.
    ملاحظة: هدف التصوير بالتحديد الكمي للأسفار الأنسجة، ومن ثم تعد هذه الخطوة مهمة ضمان إمكانية تكرار نتائج النتائج وتسمح مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها.

3-غمر والنقل لزراعة الأنسجة يدرج مع شرائح أورجانوتيبيك هيبوكامبال

1. مباشرة بعد التصوير، في غطاء الاندفاق الصفحي، تأخذ واحد إدراج زراعة الأنسجة خارج لوحة 6-جيدا باستخدام الملقط.
2. عناية bubbled نقل الإدراج بكيس من البولي إيثيلين عقيمة (3 "× 5") المملوء مسبقاً مع 20 مل متوسطة التجريبية الحارة (37 درجة مئوية) طازجة مع 95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون.
   ملاحظة: تأكد من أن bubbled لمدة 40 دقيقة على الأقل مع 95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون باستخدام ببلير سسينتيريد زجاج داخل زجاجة دريشيل المتوسطة التجريبية المخصب بالأوكسجين وثاني أكسيد الكربون ونقلها في أكياس البولي إيثيلين العقيمة داخل تدفق الصفحي هود زراعة الأنسجة استخدام المحاقن 20 مل مع عامل تصفية بكتيرية وأنبوب ملء عقيمة (127 مم) المرفقة. ختم الأكياس فورا ونقلها إلى حاضنة 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح قبل زراعة الأنسجة بإدراج نقل.
3. التأكد من أن كل كيس معقم هو المسمى بشكل صحيح (مع لوحة وكذلك تحديد الهوية). كرر هذه الخطوة لكل إدراج زراعة الأنسجة. تستبعد فقاعات الهواء بعناية عند ختم أكياس معقمة (الذي أنجزه بشكل أمن التواء الجزء العلوي من الحقائب وتطبيق المشبك بلاستيك).
4. العودة في أكياس معقمة مع إدراج زراعة الأنسجة ولوحات 6-جيدا مع المتوسطة التجريبية إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
5. بعد ح 1، حزمة بعناية في أكياس معقمة مع إدراج زراعة الأنسجة في صناديق بلاستيكية داخل مربع الحرارية-وينظم مليئة بالماء المتأين الشطب في 37 درجة مئوية من أجل الحفاظ شرائح أورجانوتيبيك حرارة الفسيولوجية في جميع أنحاء التعرض موجه الصدمة البروتوكول.

4-إعداد أنبوب الصدمة والتعرض موجه الصدمة هيبوكامبال أورجانوتيبيك شريحة

1. ارتداء الصلب-إصبع القدم أحذية واقية ومعطف مختبر وقفازات أثناء إعداد أنبوب الصدمة وتعرض موجه الصدمة.
2. الترباس الإطار حامل حقيبة العقيمة إلى شفة القاصي أنبوب الصدمة، ضمان اتساق ثقب مركزي مع منفذ أنبوب الصدمة (باستخدام قضيب المسح).
3. جبل اثنين من محولات طاقة الضغط إشعاعيا: استشعار 1، في الجزء الأوسط من قسم مدفوعة واستشعار 2 في شفة القاصي من أنبوب الصدمة (الشكل 1A). قم بتوصيل محولات ضغط الذبذبات عن طريق وحدة طاقة مصدر الحالي.
4. تأكد من أن يتم إغلاق جميع الصمامات الإفراج عن أنبوب الصدمة وتدفق عناصر التحكم.
5. فتح الخط الخارجي الهواء المضغوط وتهمة صمام الملف اللولبي إلى 2.5 بار.
6. فتح صمام الأمان اسطوانة الهواء المضغوط وفتح ببطء منظم للضغط زيادة الضغط إلى حوالي 5 بار.
   ملاحظة: ينبغي أن يكون الضغط لمنظم هذا قليلاً فوق الحاجز أعلى ضغط الانفجار.
7. إعداد في أغشية من قطع 23 ميكرون سميكة البوليستر أوراق إلى مربعات 10 × 10 سم² . إعداد مقابض باستخدام شريط اﻷوتوكﻻف والتمسك أعلى وأسفل كل الأغشية.
8. موقف واحد الحجاب الحاجز (فتحه واحدة للمغلاق مزدوجة-تكوين غشاء مفرد) أو أغشية اثنين (على حد سواء فتحات المغلاق مزدوجة-تكوين غشاء مزدوج) في المؤخرة (الشكل 1B).
9. مركز الحواجز، والمشبك لهم باستخدام أربعة مسامير M24 والمكسرات، ابزيم لهم تسلسلياً بشكل متماثل قطرياً، وضمان الموجودة أغشية خالية من التجاعيد.
10. المشبك كل كيس معقم منفردة في الموضع العمودي في الإطار حامل، وضمان أن يواجه سطح إدراج زراعة الأنسجة مع شرائح هيبوكامبال أورجانوتيبيك مأخذ أنبوب الصدمة وإدراج زراعة الأنسجة يتركز داخل معقم حقيبة (الشكل 1). تأكد من أن الحقيبة عقيمة بشكل أمن فرضت جميع أنحاء لضمان التثبيت الراسخ وحتى.
11. ارتداء المدافعين عن الإذن ونظارات السلامة عند الضغط على أنبوب الصدمة. التبديل على وحدة الطاقة المصدر الحالي والذبذبات للحصول على البيانات من موجه الصدمة (حيازة معدل 50 ميجا-عينات/s، وسجل طول 20 مللي ثانية، النقاط 1 مليون) وإغلاق صمام الملف اللولبي.
12. استخدام مفتاح التحكم في التدفق على لوحة التحكم أنبوب الصدمة، الضغط ببطء المقطع حجم برنامج تشغيل الأنبوب صدمة لتكوين غشاء مفرد أو المقطع حجم برنامج التشغيل والقسم المغلاق مزدوجة من الأنبوب صدمة لغشاء مزدوج التكوين.
    ملاحظة: لتكوين غشاء واحد، ضغط الانفجار سوف تعتمد فقط على المواد الحجاب الحاجز وسمك والحجاب الحاجز سوف تمزق تلقائياً حالما يتم التوصل إلى المواد التي تتضاعف الضغوط. لتكوين غشاء مزدوج، ضغط انفجار سيتوقف أيضا على ضغط الغاز التفاضلية في كل من السائق والدوائر المغلاق مزدوجة، لأغشية لتنفجر في طريقة التي تسيطر عليها، يتم فتح صمام أمان مزدوج المغلاق يدوياً مرة واحدة الضغوط الهدف التي يتم التوصل إليها.
13. بمجرد أن الحجاب الحاجز تصدعات (المنتجة ضجيج مرتفع)، بسرعة إغلاق تدفق الهواء المضغوط باستخدام مقبض تدفق وفتح صمام الملف اللولبي.
    ملاحظة: يمكن تعديل الحجم الإجمالي للمقطع برنامج التشغيل بواسطة الإدراج لتقطيع شرائح، والسماح لمجموعة أوسع من يركب ذروة موجه الصدمة والمدد الزمنية الحصول عليها. مزيج مثالي من معلمات موجه الصدمة ينبغي أن تكون كافية للتسبب في إصابة نسيج ولكن ليست عالية حتى أنه يسبب إدراج زراعة الأنسجة أو تشويه حقيبة العقيمة أو تمزق.
14. فضح كل كيس العقيمة مع إدراج زراعة الأنسجة لموجة أنبوب صدمة واحدة والعودة فورا إلى مربع الحرارية-وينظم قبل حقيبة عقيمة جديدة مأخوذة من المربع وفرضت على الإطار حامل. تكفل الخطوات 4.10 – 4.14 أداء بسلاسة وسرعة قدر الإمكان (في غضون بضع دقائق) لمنع تبريد المتوسطة التجريبية إلى أسفل، درجات الحرارة أقل من 37 درجة مئوية قد تتداخل مع التنمية الإصابة.
15. بعد إدراج زراعة الأنسجة كافة قد تعرضوا إلى موجه الصدمة (أو بروتوكول الشام)، العودة إدراج زراعة الأنسجة إلى لوحة 6-جيدا الأصلي ومنها (داخل غطاء زراعة الأنسجة الاندفاق الصفحي) والعودة إلى الحاضنة.
16. تبقى لوحة 6-جيدا في الحاضنة مع 5% ثاني أكسيد الكربون في الجو عند 37 درجة مئوية حتى التصوير كذلك.
17. وتشمل الضوابط الشام لكل تجربة، جنبا إلى جنب مع التعرض موجه الصدمة شريحة.
    ملاحظة: شرائح شام تعامل مطابق تماما لشرائح تتعرض لموجة الصدمة (مختومة في أكياس معقمة مع المتوسطة التجريبية ونقلها إلى مختبر أنبوب الصدمة في مربع الحرارية-وينظم نفسه وعلقت على الإطار المعدني لفترة مماثلة من الوقت) لكن الصدمة لا أطلق الأنبوبة.

5-هيبوكامبال أورجانوتيبيك شريحة إصابة الكمي

1. في ح 24، ح 48 و 72 ح، صورة الشرائح كما هو موضح في الخطوات 2.8 و 2.9.
2. وبعد التصوير في ح 72 وظيفة موجه صدمة التعرض، تجاهل الأنسجة البيولوجية المحلية التالية النفايات البروتوكولات وتعقيمها والاوتوكلاف المعدن الخواتم.

النتائج

أنبوب الصدمة المستخدمة في هذا الأسلوب يتيح توليد العابرين وسيلة تحاكي الحياة الحقيقية فتح الحقل التفجيرات على غرار^7،الدالة فريدلاندر⁸. وتم الحصول على صدمة الأسرع من الصوت مع سرعة 440 m/s (1.3 ماخ) (الشكل 2 أ). الموجي البيانات المبلغ عنها من أجهزة الاستشعار 2، المتمركزون إشعاعيا في نهاية المقطع مدفوعة من أنبوب الصدمة.

استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، تطوير الثقافات شريحة هيبوكامبال أورجانوتيبيك تعرضت لموجة صدمة واحدة (الشكل 2A) ضرر ذي شأن كمياً باستخدام يوديد propidium، صبغة فلورسنت قطبية العالية التي تخترق فقط الخلايا مع اختراق الأغشية الخلوية^24،25 (الشكل 2، ج).

حتى في ظل الظروف المثلى، ومتسقة لغيرها أوهسك نشرت نماذج^21،22، هناك مستوى منخفض من الأسفار يوديد propidium الخلفية يرجع، جزئيا، إلى أضرار طفيفة الناتجة (التلاعب في الأنسجة الكامنة مثل الوسائط التغييرات أثناء فترة الثقافة أو إزالة من الحاضنة للتصوير). ينطوي هذا الانفجار البروتوكول تبي التلاعب الكبير الذي يشمل غمر الشرائح المتوسطة داخل أكياس معقمة ودرجة كبيرة من التعامل خلال بروتوكول موجه صدمة التعرض (مثلاً.، لقط في أكياس معقمة حامل الإطار). ومع ذلك، إذا كان يتم تنفيذ جميع الخطوات بعناية، هذا التلاعب إضافية لا تؤثر على صحة الكامنة أوهسك كما شوهدت لا توجد اختلافات كبيرة بين مجموعة مراقبة من شرائح أبقى في لوحات 6-جيدا في جميع الأوقات (أي.، لم تدرج مغمورة أو التعامل معها) ومجموعة شام، التي شملت الشرائح التي كانت مغمورة داخل أكياس العقيمة التي فرضت على أنبوب الصدمة (الشكل 2).

موجات الصدمة اثنين اختار، في 50 كيلو باسكال ويركب ذروة 55 الجيش الشعبي الكوري، أنتجت كبيرة (ف < 0.05 و p < 0.0001، على التوالي) وشرائح إصابة استنساخه بالمقارنة مع الشام يصب في جميع النقاط الزمنية بعد التعرض الانفجار بروتوكول (الشكل 2) دون التسبب في أي ضرر لإدراج زراعة الأنسجة أو أكياس معقمة. من أجل تحديد حساسية النموذج للفروق الصغيرة في ذروة يركب، قررنا أن حدد القيم التي كانت مختلفة بواسطة ~ 10%. هذه النتائج أيضا تبين أن، كما هو متوقع، الضرر الناجم عن 55 الجيش الشعبي الكوري أعلى بعد موجه صدمة 50 كيلو باسكال.

هي التعبير عن البيانات يعني ± الخطأ المعياري للوسط. وكان تقييم أهمية استخدام تباين من تحليل 2-طريقة تدابير متكررة باستخدام اختبار وظيفة المخصص هولم-صداق. عامل 1 المجموعة (التحكم، والشام، والانفجار) وكان عامل 2 الوقت بعد الإصابة (ح-1، ح 24، ح 48 وح 72)، حيث كان معامل 1 عامل المتكررة. وقد استخدم تعديل قيمة p لمقارنات متعددة. واتخذت ف قيم أقل من 0.05 للإشارة إلى فارق كبير بين المجموعات. وقد نفذت الاختبارات الإحصائية باستخدام حزمة برامج الرسوم البيانية والإحصاءات.

رقم 1: التخطيطي للجهاز أنبوب الصدمة مع الإطار حامل حقيبة العقيمة. (أ)-أنبوب الصدمة 3.8 متر أنبوب فولاذ المقاوم للصدأ منذ وقت طويل، مصنوعة من ثلاثة أقسام 1.22 م طويلة، متصلة بواسطة أطواق منع التسرب والشفاه، مع قطرها داخلي من 59 مم. يظهر اقحم (ب) الجمعية المغلاق مزدوجة. يمكن فرضت أغشية مايلر واحداً أو اثنين في الجمعية العامة بختم المقدمة من المطاط سين بين عصابات. (ج) الإطار حامل حقيبة العقيمة. جسم الإطار يتكون من اثنين من لوحات معدنية مع حفرة دائرية توسيط (59 مم) التي تؤيد مع منفذ أنبوب الصدمة. وهي مزودة ورقتين (4 ملم) رقيقة سيليكون الاستومر بين لوحات معدنية اثنين. والغرض من هذه الأوراق توفير سطح غير زلق وحتى المشبك في أكياس معقمة. المسافة بين الكيس ومنفذ لأنبوب الصدمة هو 7 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: shockwave نموذجية والضرر الناجم عن ذلك في أورجانوتيبيك هيبوكامبال شريحة الثقافات. (أ) مثال من موجه الصدمة التي تم الحصول عليها باستخدام 23 ميكرون سميكة البوليستر الفيلم، 2.16 بار ضغط الانفجار، 55 يركب ذروة الجيش الشعبي الكوري، ومدة موجه إيجابية 0.4 مرض التصلب العصبي المتعدد، دفعة 10.1 kPa·ms. تم الحصول على البيانات الموجي من أجهزة الاستشعار 2 إشعاعيا شنت على شفة القاصي أنبوب الصدمة مدفوعة القسم. وكانت سرعة موجه الصدمة 440 m/s (1.3 ماخ). (ب) تطوير الإصابة يتناسب مع شدة موجه الصدمة. الجيش الشعبي الكوري 50 و 55 الجيش الشعبي الكوري ذروة يركب موجات الصدمة تسبب الإصابة الكبيرة التي وضعت في جميع أنحاء البروتوكول ح 72 عند مقارنة مع مجموعة الشام. الضرر الناجم على 55 الجيش الشعبي الكوري ذروة يركب موجه تعرض كان أعلى بكثير من بعد 50 كيلو باسكال في ح 48 وشرائح شام 72 h. يعاملون مطابق تماما لشرائح الانفجار لكن أنبوب الصدمة لم أطلق. وأبقى على شرائح التحكم في 6 لوحات جيدا في حاضنة دون أي تلاعب. أشرطة وتمثل القيم الوسطية وأشرطة خطأ الأخطاء المعيارية (n = 7، الضوابط؛ ن = 48، الشام؛ ن = 30، انفجار 50 كيلو باسكال؛ ن = 51، الجيش الشعبي الكوري الانفجار 55؛ ن = عدد الشرائح، من 6 تجارب منفصلة). * ف < 0.05، *ف < 0.0001 بالمقارنة مع الشام. ^# ف < 0.05، ^#ف < 0.01 بالمقارنة مع انفجار 55 الجيش الشعبي الكوري. (ج) الصور fluorescence يوديد propidium الممثل شرائح أورجانوتيبيك من الشام (أنا)، (ثانيا) انفجار 50 الجيش الشعبي الكوري و (ثالثا) انفجار 55 الجيش الشعبي الكوري الفئات في 72 ساعة بعد الإصابة. شريحة الشام يظهر مستويات منخفضة من الأسفار، أي.، الإصابات، والانفجار شرائح مكشوفة تظهر مستويات مرتفعة من الإصابة منتشر، أكثر وضوحاً على الشريحة يركب يتعرض الذروة 55 الجيش الشعبي الكوري (شريط مقياس = 500 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

بين جميع آليات الإصابات المرتبطة بانفجار تبي (الابتدائي والثانوي والعالي الانفجار إصابة آليات)، الأولية إصابة الانفجار فريدة من نوعها لصدمة الانفجار ويفهم الأقل من الآليات المرتبطة بانفجار^1،2 . ووضعت البروتوكول رواية الموصوفة هنا لدراسة الانفجار الرئيسي تبي استخدام أنبوب صدمة مفتوح باب العضوية لفضح في المختبر الماوس شريحة هيبوكامبال الثقافات إلى موجه صدمة واحد باستخدام بروتوكول بسيط وسريع يسمح بإنشاء استنساخه الأولية أن الانفجار تبي مع إنتاجية عالية.

تطبيق الأولى في المختبر انفجار الابتدائي تبي نماذج موجات الضغط الهيدروليكي للخلايا^26،27. بيد الإخراج الضغط لا نموذج الدالة فريدلاندر كما كانت أطول بكثير من انفجار المحمولة جوا يركب الأمواج¹³مدة نبض الضغط الهيدروليكي. يمكن أن تكون السمة الدالة فريدلاندر نموذج بسهولة في المختبر باستخدام^1،أنبوب صدمة⁸. يمكن أن تنتج أنبوب صدمة موجات الصدمة التي محاكاة الانفجارات حقل مفتوح واقع الحياة في بيئة المعامل تقليدية، بينما تسمح مراقبة دقيقة للمعلمات الموجه، مثل يركب الذروة ومدة موجه إيجابية والدافع، باختلاف المواد الحجاب الحاجز وسمك وسائق حجم^8،،من²⁸²⁹.

نماذج بسيطة في المختبر مثل الثقافات خلية تفتقر عادة إلى تباين أنواع الخلايا واتصال متشابك³⁰. أثر الانفجار على في المختبر خلايا الدماغ 'الماغنيسيوم' دمج أنواع مختلفة من الخلايا في الآونة الأخيرة التحقيق³¹. هو يستحق مزيدا من التحقيق لهذه الاستعدادات للاهتمام؛ ومع ذلك، ليس واضح كيفية تنظيمها الخلوية واتصال مرايا الدماغ سليمة. أوهسك هي راسخة في المختبر تجريبي نموذجي^23،32، سهلة للثقافة وعلى سيتوارتشيتيكتوري الأنسجة الثلاثية الأبعاد، وتمايز الخلية والاتصال متشابك جيدا جداً والحفاظ عليها مشابهة لذلك في فيفو^{33،34،35،36}. أوهسكس تمثل مستوى متوسط من التعقيد بين الثقافة الخلية و في فيفو نموذجي^23،32. لقد ثبت أوهسكس لإعادة إنتاج المختبر في الأعصاب المرضية الشلالات ينظر في نماذج في فيفو وكانت مفيدة جداً في فحص المخدرات محصن المحتملة وفي فهم آلياتها من العمل^17،،من^2122،،من³⁷³⁸. وأخيراً، منطقة التشريحية درس، في قرن آمون، ارتباطاً وثيقا في دراسات تبي متعدية الجنسيات، كما تلف هذه المنطقة كثيرا ما تبي المرضى^39،،من⁴⁰⁴¹. وقد استخدمت أوهسك لنموذج الانفجار تبي^28،42،،من⁴³⁴⁴، ومع ذلك، لدينا نموذج بسيط نسبيا ويمكن تكييفها لأنابيب صدمة الموجودة في أما أفقي أو عمودي تكوينات دون تعديلات معقدة.

يمكن الاحتفاظ أوهسك في الثقافة لعدة أيام، مما يسهل التحقيق في العمليات البيولوجية على مر الوقت³⁴. في هذا النموذج، وتم قياس الضرر الأنسجة التي نتجت عن التعرض لموجة الصدمة يوميا على مدى ثلاثة أيام، عقب التعرض للانفجار استخدام يوديد propidium، علامة راسخة من تلف الخلايا. يوديد Propidium هو صبغة غير سام قطبية العالية التي تخترق الخلايا مع الأغشية الخلوية الشبهة، حيث أنه يربط بالأحماض النووية والمعارض مميزة ومضان أحمر مشرق^24،25،45. الأسفار تقاس يوديد propidium ثبت لدينا علاقة جيدة مع عدد الخلايا المضرورة استخدام نسل تلطيخ^46،47.

نظراً لأن الضرر الذي ينتج في هذا النموذج هو منتشر (الشكل 2)، وتم قياس الأسفار شريحة كاملة عند إجراء التحليل، مشابهة للأعمال المنشورة سابقا في غيرها الدماغ إصابة نماذج^21،22 ، بدلاً من استخدام مناطق معينة، كما فعلت في غيرها في المختبر انفجار تبي نماذج^28،43،،من⁴⁴⁴⁸. يلغي النهج العالمي المستخدمة في نموذج الموضحة في هذه المقالة أيضا التقلبات المحتملة التي يتم تقديمها عندما يحدد تعريف المناطق ذات الاهتمام ويقدم صورة أكثر شمولاً للإصابات المتعلقة بالانفجار. كلا أوفيربريسوريس ذروة موجه الصدمة والكوري 50 55 الجيش الشعبي الكوري، أنتجت كبيرة (ف < 0.05 و p < 0.0001، على التوالي) الإصابة بالمقارنة مع شرائح شام (الشكل 2ب). وكما كان متوقعا، موجه الصدمة مع يركب ذروة أعلى، أنتجت 55 الجيش الشعبي الكوري، إصابة أكثر من 50 كيلو باسكال الموجه. في نموذج في المختبر مع الدماغ معزولة تتعرض الأنسجة مباشرة الصدمة، كيفية مقياس دقيق للكائن الحي كله أو إنسان ليست واضحة. ومع ذلك فصدمه استخدمنا داخل نطاق الذروة أوفيربريسوريس الملاحظة في الميدان، عادة 50 – 1,000 الجيش الشعبي الكوري^8،49.

من أجل الحفاظ على أوهسك تتعرض لدرجة حرارة الفسيولوجية ومستويات الأوكسجين وثاني أكسيد الكربون، مع ضمان أن كانت خالية من التلوث في جميع أنحاء البروتوكول موجه الصدمة، والتعرض مختوم إدراج زراعة الأنسجة إلى العقيمة أكياس البولي إثيلين اتباع أسلوب العقيم، غارقة في المتوسطة التجريبية ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية، وظهر حديثا مع 95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون، وبالمثل للأعمال المنشورة سابقا^28،،من^{4344 ،48}. خلافا لهذه النماذج التي استخدمت فيها أجهزة معقدة لعقد في أكياس معقمة أثناء التعرض لموجة الصدمة، في هذا البروتوكول، استخدمت طريقة بسيطة وسريعة لوقف إدراج زراعة الأنسجة أوهسك أمام مأخذ أنبوب الصدمة (الشكل 1A، ج ). يسمح النموذج المبين في هذه الورقة معالجة سريعة وعالية الإنتاجية، مع التقليل من خطر انخفاض حرارة الجسم. هذه الجوانب ذات أهمية خاصة للدراسات نيوروبروتيكشن نظراً لأن بعض التدخلات العلاجية قد يكون إطار زمني محدود للغاية من إمكانية تطبيقها بعد تبي. يسمح هذا البروتوكول التعرض موجه الصدمة رواية 6 إلى 9 إدراج زراعة الأنسجة (شرائح الأنسجة أورجانوتيبيك هيبوكامبال عادة من 36 إلى 54) يتعرضون لموجة الصدمة في فترة قصيرة من الوقت (حوالي 1 ح).

أوهسكس تتطلب تقنية معقمة جيدة في جميع أنحاء. من المهم استخدام غطاء الاندفاق الصفحي العقيم طوال استزراع وعند نقل لأكياس معقمة للانفجار. بغية القيام بتصوير شريحة تحت ظروف معقمة مع الأغطية لوحات 6-جيدا في المكان، ونحن استخدام حلقات معدنية مصنوعة خصيصا لرفع إدراج ثقافة الخلية إلى المستوى البؤري المجهر. جزءا هاما من جهودنا البروتوكول أن نقوم بتضمين شرائح شام يصب في كل تجربة. شرائح شام تعامل مطابق تماما لشرائح الانفجار مع الاستثناء أن لا أطلق الصدمة-الأنبوبة؛ خطوة هامة أخرى أن كل الشرائح يتم تصويرها ح 1 قبل الإصابة أو العلاج الشام، لضمان صحة سكان الشرائح المستخدمة متطابقة (الشكل 2).

بالإضافة إلى التحديد الكمي لإصابة الخلية في الشرائح مع مرور الوقت، يمكن أن تكون ثابتة الأنسجة في نهاية التجربة بالنسبة إيمونوهيستوتشيميستري التقليدية⁵⁰. تطوير وتقييم طريقة استخدام الماوس هيبوكامبال الشرائح. ومع ذلك، لدينا تقنية يمكن تكييفها بسهولة لاستخدام الأنسجة الأخرى التي يمكن زراعتها في الثقافة، مثل الحبل الشوكي، والشبكية، والرئة أو الأنسجة الظهارية. في هذه الورقة، وعملنا السابق مع النموذج، نحن التحقيق في تأثير التعرض لانفجار واحد فقط. ومع ذلك، سيكون النموذج مناسب تماما للتحقيق في آثار الانفجارات المتكررة ذات المستوى المنخفض في الدماغ أو الأنسجة الأخرى. أوهسكس يمكن أن يوضع في الثقافة لعدة أسابيع أو حتى أشهر، السماح للآثار المزمنة التحقيق فيها.

نماذج في المختبر ، ويجري أبسط من نماذج في فيفو ، أعلى من الناتج، وهي أقل تكلفة وتجارب يمكن أن تكتمل عادة في مقياس وقت أقصر¹⁷. ومع ذلك، النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نماذج في المختبر بحاجة إلى يتم التحقق من صحة في نماذج حيوانية في المختبر استزراع الأنسجة يتم الاحتفاظ بها في بيئة مصطنعة، وقد يستجيب للإصابة بشكل مختلف عن ما يفعلون في فيفو¹⁷. ومع ذلك، كانت قيمة للغاية في زيادة فهمنا للدماغ إصابة الشلالات نماذج في المختبر وفي فحص المخدرات محصن قبل استخدام أكثر تعقيداً في فيفو النماذج^{17،22 , 51 , 52}-على الرغم من العديد من المزايا التي يتيحها هذا النموذج، فإنه من المهم ملاحظة أن نماذج في المختبر تفتقر إلى مفتاح ميزات تبي موجودة في الحيوانات، و في فيفو النماذج، مثل آثار على الأوعية الدموية، زيادة داخل الجمجمة الضغط والاستجابة المناعية النظمية والعاهات السلوكية الوظيفية، مما يبرز الحاجة إلى التحقق من صحة النتائج الموجودة في نماذج في المختبر في الحيوان كله. ومع ذلك، نماذج في المختبر مثل النموذج المبين في هذه الورقة هي مفيدة للغاية من الأدوات العلمية ذات الصلة ترانسلاتيونالي.

وفي الختام، يصف هذا العمل طريقة جديدة بسيطة ومباشرة حيث يتعرض الماوس أورجانوتيبيك هيبوكامبال زرع الأنسجة لأحكام الرقابة واستنساخه بواقع الحياة ذات الصلة موجات الصدمة استخدام أنبوب صدمة مختبر. هو جداً استنساخه الضرر العالمي الناجم عن ذلك، الذي كان كمياً باستخدام يوديد propidium، علامة راسخة من تلف الخلايا، ويكون متناسباً مع يركب ذروة موجات الصدمة تطبيقها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geys balanced salt solution	Sigma UK	G9779
D- glucose	Sigma UK	G8270
Antibiotic/antimycotic	Sigma UK	A5955
Minimum essential medium Eagle	Sigma UK	M4655
Hanks balanced salt solution	Sigma UK	H9269
Horse serum	Sigma UK	H1138
L-glutamine	Sigma UK	G7513
HEPES	VWR Prolabo, Belgium	441476L
Sodium hydroxide	Sigma UK	S-0945
Tissue culture inserts	Millicell CM 30 mm low height Millipore	PICM ORG 50
6-well plates	NUNC, Denmark	140675
Propidium iodide	Sigma UK	P4864
Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags	Fisherbrand	01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm)	Smiths Medical Supplies	E910
Epifluorescence microscope	NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective	Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter	Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm	RS Components UK	785-0782
Pressure transducer	Dytran Instruments Inc.	2300V1
Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.	Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184
Graphing & statistics software	GraphPad Software, USA	Prism 7.0