Patlama travmatik beyin hasarı roman Vitro modeli

Özet

Bu kağıt birincil patlama travmatik beyin hasarı roman modeli açıklar. Sıkıştırılmış hava tahrikli şok tüpü vitro fare hipokampal dilim kültürler için tek bir şok dalgası ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu tekrarlanabilir beyin doku hasarı ile yüksek üretilen iş üreten bir basit ve hızlı bir protokoldür.

Özet

Travmatik beyin hasarı ölüm ve sakatlık askeri ve sivil nüfus önde gelen nedenidir. Patlama travmatik beyin hasarı sonuçlarından patlayıcı, patlama ancak, patlama aşırı basınç maruz kalma sonucu beyin hasarı altında yatan mekanizmaları tamamen anlaşılmadı ve beyin hasarı bu tür benzersiz olduğuna inanılmaktadır. Preklinik modelleri patlama kaynaklı beyin hasarı daha iyi anlamak için katkıda çok önemli araçlardır. Bir roman vitro patlama TBY modeli gerçek açık alanlı patlama dalgaları Friedlander dalga tarafından modellenmiş benzetimini yapmak için bir açık uçlu şok tüpü kullanarak geliştirilmiştir. C57BL/6N fare organotypic hipokampal dilim kültürler için tek şok dalgaları maruz kaldılar ve yaralanma gelişimi 72 propidium iyodür, hücre hasarı sadece iyi kurulmuş bir floresan işaretleyici kullanarak hücreleri ile nüfuz s kadar karakterize edildi hücresel zarları ele geçirildi. Propidium iyodür floresans protokolün süresi boyunca sahte dilimleri ile karşılaştırıldığında bir patlama dalgası maruz dilimleri içinde anlamlı olarak daha yüksek. Beyin doku hasarı çok tekrarlanabilir ve uygulanan şok dalgasının en yüksek aşırı basınç ile orantılı olduğunu.

Giriş

Patlama travmatik beyin hasarı (TBY) patlayıcı^1,2patlama sonuçlar beyin hasarı karmaşık bir türüdür. Patlama TBY önemli bir sağlık sorunu Irak ve Afganistan^2,3' te son askeri çatışmalar ile son 15 yıl içinde ortaya çıkmıştır. Genel olarak, bu % 4.4 ve %22,8 askerlerinin Irak ve Afganistan arasında hafif TBY, bu patlama ile ilgili,^{4 UK güçleri ile karşılaştırıldığında Amerikan kuvvetleri TBY patlamada bildirilen daha yüksek oranda ile olmak büyük bir kısmı uğramış tahmin edilmektedir ,5}.

Doğaçlama patlayıcı cihazların kullanımı çoğu tarafından askeri kuvvetleri⁶katlandığımız patlama TBY, dahil olmak üzere patlama ilişkili travma için sorumlu olmuştur. Bir patlayıcı patlaması sonucu bir çok hızlı — ama geçici — basınç, milisaniye cinsinden meydana gelen artış. Gerçek ücretsiz alan patlama ortaya çıkan aşırı basınç dalgadan bir üstel çürüğü^7,8tarafından takip en yüksek aşırı basınç için ani bir artış Friedlander işlevi tarafından türetilmiştir. Aşırı kuvvet ve bir patlama olayı gördüm onların hızlı zamanlı kurs aralığı genellikle değil deneyimlidir sigara-şok travmalar^1,9'. Dalga maksimum basınç ve olumlu dalga süre tepe aşırı basınç önemli katkıda bulunan patlama beyin hasarı olduğuna inanılır ve bunlar patlayıcı patlama^{10mesafelerine bağlı, 11}.

Bir patlayıcı patlama sonuçlarından gizli olduğunu birincil, ikincil, üçüncül ve Kuvaterner patlama yaralanma^10,12,13,14olarak belirlenmiş dört ayrı bileşenler olarak travma. Bu bileşenlerin her biri belirli yaralanma mekanizmaları ile ilişkilidir. Birincil patlama yaralanma doğrudan eylem organ ve dokulara^2,13aşırı basınç dalgasının kaynaklanır. İkincil patlama yaralanma sonuçlarından etkisi, mermi parçacıkları, delici ve delici olmayan neden^2,15yaralar. Tersiyer patlama yaralanma kurbanın cesedinin yere veya çevredeki nesneleri karşı yerinden ve hızlanma/yavaşlama kuvvetleri^1,10,13ile ilişkili oluşur. Kuvaterner patlama yaralanma doğrudan ilk üç yaralanma mekanizmaları açıklanan^12,13tarafından kapsanmayan patlama ile ilgili yaralanmalar heterojen bir grup açıklar. Bunu içerir (ancak sınırlı değildir) termal yaralanma, dumandan, radyasyon, elektromanyetik dalgalar ve olumsuz psikolojik etkiler^13,15. Patlama yaralanma Kuvaterner mekanizmaları genellikle sistemik yaralanma¹³ile ilişkili olmakla birlikte çoğu patlama ilişkili TBY doğrudan yaralanma, ilk üç mekanizma sonuçlanır. Etkileri hızlanma/yavaşlama güçleri (Örneğin, whiplash), künt ve travmatik beyin hasarı penetran adamları kapsamlı bir şekilde inceledik TBY (Örneğin, motorlu araçlar için çöküyor, falls, balistik yaralanma) diğer türleri ile ilgili olarak. Ancak, birincil patlama aşırı basınç dalgası patlama yaralanma için benzersizdir ve beyin dokusu üzerindeki etkileri daha az iyi anlaşılan¹⁶. Bir aşırı basınç dalgası ile ilişkili birincil patlama yaralanma mekanizmaları ile beyin etkileşimine mekanik Kuvvetleri ilk sırada.

Patlama TBY mekanizmaları yaralanma ve patofizyolojisi anlamak ve aksi sadece yapmak imkansız potansiyel yeni tedaviler araştırmak için çok değerli olan son on yıl içinde çok sayıda preklinik TBY modelleri geliştirilmiştir klinik^17,18,19ayarlama. Genellikle tek preklinik modeli klinik patlama beyin travması karmaşıklığı üretebilir rağmen farklı preklinik TBY modelleri insan TBY farklı yönlerini çoğaltmak. Bir patlama patlama ile ilişkili güçlerinin zarar verici eylem yalıtım veya birlikte vitro ve in vivo patlama TBY modellerindeki okudu olabilir. Vitro modelleri biyolojik değişkenliği azaltır ve tekrarlanabilirlik, çalışma izin artırır deneysel çevre (doku fizyolojik koşullar ve yaralanma biyomekanik), sıkı bir kontrol sağlayan avantajı var. kaynaklanan hayvan mevcut modeller olmadan²⁰özel moleküler basamaklandırır. Amacımız beyin dokusu birincil patlama etkilerini araştırmak için bir vitro modeli geliştirmekti. Bir model ile bir süpersonik shockwave doğaçlama patlayıcı aygıtı (IED) tarafından üretilen gibi ücretsiz alan patlama Friedlander dalga temsilcisi ile geliştirmek amaçlanmıştır.

Protokol

Bu el yazması açıklanan deneyleri 1986 İngiltere hayvanlar (bilimsel yordamlar) Yasası ile uyumlu yapıldı ve hayvan refahı ve etik İnceleme vücut, Imperial College London tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı Imperial College London kurumsal yönergelere uygun olarak yapıldı.

1. hipokampal Organotypic dilim hazırlık ve kültür

Not: Bu protokol organotypic hipokampal dilimler Stoppini ve meslektaşları ile küçük değişiklikler^21,22,23tarafından açıklanan arabirim yöntemine göre üretimi sağlar. İdeal olarak, en fazla üç hayvan euthanized ve tek oturumda her adım hızla yapılır, dilimleri kalitesinden ödün önlemek üzere disseke gerekir. Aseptik teknik boyunca kullanın.

1. Diseksiyon Protokolü başlamadan önce aşağıdaki adımları alınır emin olun.
   1. Hazırlamak ve filtre sterilize önceden 0,22 µm filtre kullanarak tüm çözümler.
   2. 4 ° C depolama sırasında ve beyin diseksiyon ve saklama kapları ve Petri yemekler metal bir soğutucu üzerinde tutarak hipokampal dilim hazırlık boyunca Solutions'da her zaman ıslak buz üzerinde oturmaya devam.
   3. Otoklav tüm metal aletler, halkalar ve kağıt mendil.
   4. Tüm enstrümanlar ve protokol her adım için kullanılacak malzeme kullanıma hazır önceden ortaya konulan ve % 70 etanol ile püskürtülür olduğundan emin olun. Onlar serin ve kuru izin emin olun.
2. 5-7 gün ötenazi-eski C57BL/6N tarafından servikal çıkığı yavru fare ve kısaca %70 etanol batırılmış steril kağıt doku tüm cilt yüzeyi silin. Cilt kuru pat ve Mayo makas kullanarak yavru başını kesmek.
3. Kafa derisi deri kafa oksipital bölgede başlayıp burun orta çizgi boyunca Iris makas ile ve yanal geri çek.
4. Deliği magnum kenasen makas ucu yerleştirin ve transvers sinüsler boyunca kemikte iki küçük yan kesim yapmak sonra kafatası olfaktör ampul kadar orta çizgi boyunca kesmek ve iki küçük kesikler dik bu bölgedeki orta hat için yapabilirsiniz.
5. İyi kullanarak eğri forseps işaret kemik yanal orta hat uzak flep geri çek, dikkatle beynin küçük bir spatula ile kaldırmak ve bir 90 mm silikon elastomer kaplı "diseksiyon orta" içeren Petri için transfer.
   Not: Diseksiyon Gey'nın dengeli tuz solüsyonu (5 mg/mL D-glikoz, 10.000 adet/mL penisilin, 10 mg/mL streptomisin ve 25 µg/mL Amfoterisin B ile % 1 antibiyotik antimycotic çözüm) ortamıdır.
6. Beyincik kaldırmak ve serebral hemisferlerin jilet kullanarak orta çizgi boyunca ayrı. Yeni bir 90 mm silikon elastomer kaplı Petri kabına taze buz gibi diseksiyon orta ile dolu serebral hemisferlerin aktarmak amacıyla bir spatula kullanın. Tek bir oturumda kullanılmak üzere birden fazla hayvandır, 1.2-1.6 yineleyin.
7. Bir stereomicroscope altında olfaktör ampul ve frontal korteks bir tıraş bıçağı ile ucu kesilmiş ve serebral korteks ince uç forseps kullanarak beyin doku geri kalanından ayırmak. Bu adımı hipokampus kortikal doku medial yüzeye maruz bırakır. Bu adım ileriye, laminar akış doku kültürü hood (sterilize ve % 70 etanol solüsyonla temizlenir ultraviyole) kullanın.
8. Buz gibi diseksiyon orta düz plastik doğrama diske uygulamak ve bir spatula kullanarak beyin dokusu diskte korteksin medial yüzeye karşı karşıya olduğunu ve hipokampus doğrama bıçağı eksenine dikey eksendir öyle ki getirin.
9. İyi bahşiş Pasteur pipet kullanarak doğrama diski diseksiyon ortamından, mümkün olduğu kadar kaldırın.
10. Beyin dokusu helikopter bir % 50 doğrama hızda kullanarak 400 µm dilimler halinde kesilmiş ve kuvvet.
    Not: Bu adım en kısa zamanda beyin dokusu diseksiyon ortamda batık değil gibi yapılırsa çok önemlidir.
11. Silikon elastomer kaplı Petri kabına diseksiyon ortamda ile taze buz gibi orta yerine.
12. Doku helikopter tamamlandıktan sonra dikkatli bir şekilde taze diseksiyon orta beyin dokusunda daldırın ve kesme doku geri 90 mm silikon elastomer kaplı Petri düz bıçak neşter kullanarak yemek için transfer.
13. Bir stereomicroscope altında dikkatle iyi ipucu forseps kullanarak kortikal dilimleri ayırın. Her dilim için hipokampus diseksiyon kaynaklanan veya Dilimleme Morfoloji ve potansiyel doku hasarı için kontrol edin.
14. Hippocampi entorhinal korteks ve iyi ipucu forseps ve küçük kenasen makas kullanarak Pilus ayrı. Genellikle, yaklaşık 6-8 hipokampal dilimleri Yarımküre oluşturulur.
15. 6 hipokampal dilimleri bir kesim kullanarak bir doku kültürü eklemek için aktarım Pasteur pipet ve yer 35 mm Petri içinde yemek. Dilimleri (Bu her dilimi tek tek yansıma sağlayacaktır) birkaç milimetre yayılır emin olun.
16. Hemen buz gibi eklemek "büyüme ortamına" her Petri dish, alt doku kültürü Ekle altında hemen üstündeki doku kültürü altında Ekle RIM.
    Not: Büyüme orta % 50 en az gerekli ortam kartal içeren, tuz solüsyonu, % 25 at serum, 5 mg/mL D-glikoz, 2 mmol/L L-glutamine, % 1 antibiyotik antimycotic çözüm ve 10 mmol/pH 7.2 Sodyum hidroksit ile titre L HEPES, % 25 Hanks dengeli.
17. Büyüme orta diseksiyon ertesi gün ve daha sonra her 2-3 gün sonra (kullanım büyüme orta 37 ° C'de) değiştirin. Büyüme orta yeterli miktarda, ama o kadar çok dokusu dilimlerin canlılığı tehlikeye atabilecek doku kültürü Ekle membran üzerinde taşıyor eklendiğine dikkat emin olun.
18. Dokusu dilimlerin deneylerde kullanılan önce 12 ila 14 gün için % 5 karbon dioksit hava ile 37 ° C'de oksijen bir kuluçka makinesine tutun.

2. deneysel patlama TBY protokolü için hipokampal Organotypic dilimleri hazırlanması

Not: Görüntüleme dışında bu bölümün tüm adımları bir laminar akış doku kültürü hood gerçekleşecek.

1. Özel yapım paslanmaz çelik halkalar bir 6 iyi plaka (bir şey başına) takın.
   Notlar: Yüzüklerin bir RIM ile (ki 12 yönünde pozisyonda oturmak gerekir) bir çentik var ve uygun snugly wells, doku kültürü ekler süre içinde hastalık nöbeti kolayca bu RIM. Yüzüklerin bakteri yok edici bir dezenfektan ile yıkanmış, iyice autoclaved, arıtılmış su ile durulanır ve önceden soğutmak için izin emin olun.
2. 6-şey plaka kuyusu önceden ısıtılmış (37 ° C de) serum ücretsiz doldurmak propidium iyodür ile "deneysel orta".
   Not: Propidium iyodür ile deneysel ortamıdır: %75 en az gerekli orta kartal, % 25 Hanks dengeli tuz solüsyonu, 5 mg/mL D-glikoz, 2 mmol/L-glutamine, % 1 antibiyotik antimycotic çözüm, M 10 mmol/L HEPES ve 4,5 µmol/L propidium iyodür, titre pH Sodyum hidroksit ile 7,2 için.
3. Orta düzeyde yüzüğü çentik ulaşmak değil emin olun. 6-şey plaka halkalar ile geri hemen doku kültürü ekler aktarılmadan önce Orta 37 ° C'de olması 1 h için kuluçka aktarın.
4. Doku kültürü ekler organotypic dilimleri ile gelen 35 mm Petri yemekler Yüzüklerin 6-şey plakalı ve forseps ile deneysel orta içine aktarın.
5. Bir nokta Ekle RIM saat 3 pozisyonda kalıcı marker kalemle yapmak.
   Not: Ekler 6-şey plaka deneme sırasında kaldırılması olacak ve bu adımı ekle özgün konumuna geri dönen şok dalgası maruz kaldıktan sonra ve kolayca izlemek protokol boyunca her dilim için kolaylaştırır.
6. Her 6-şey plaka bir benzersiz adı ve tarihi ile etiketleyin ve her şey adlandırma her plaka Wells bir harita yapmak (Örneğin., A, B, C, vs.) ve her şey her dilimi (e.g., 1, 2, 3, vb.), böylece her dilim bir benzersiz tanımlayıcı ( e.g., A1, A2, A3, vs.).
7. 6-şey plaka dilimleri görüntüleme hemen önce 37 ° C'de sağlamak 1 h için kuluçka aktarın.
   Not: taşma orta önlemek veya herhangi bir doku kültürü altında hava kabarcıkları dilimleri canlılığı uzlaşma olabilir membran takın.
8. Deneysel ortamına aktarılması sonra 1 h, görüntü her dilim dilim sağlık yaralanma önce değerlendirmek için bir uygun uyarma (BP 535/50 nm) ve emisyon (LP 610 nm) filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop (2 X amaç, NA 0.06) kullanarak tek tek iletişim kuralı gerçekleştirilir.
   Notlar: yoğun kırmızı bu aşamada boyama alanlarında sergi dilimleri güvenliği aşılan canlılığı sunmak için düşünülmesi gereken ve daha fazla analiz (bunlar genellikle oluşturulan dilimler toplam sayısı az % 10 temsil) çıkarılmalıdır. Görüntüleme sıralı bir şekilde ve dilimleri inkübatör dışında çoğu zaman en aza indirmek için mümkün olduğunca hızla gerçekleştirilir emin olun (genellikle 6 kuyu hemen altında 30 dk görüntü için almak).
9. 6-şey plaka kapak her zaman devam et. Bazı yoğunlaşma kapağın iç tarafında inşa edebilir. Kısaca bu durumda düşük ayarda bir saç kurutma makinesi kullanın.
10. Tüm görüntüleme koşulları farklı günlerde ve deneyler arasında aynı olduğundan emin olun.
    Not: Görüntüleme amacı doku floresans ölçmek için bu nedenle bu adım sonuçları tekrarlanabilirlik sağlamak ve elde edilen veri karşılaştırma sağlamak önemlidir.

3. su ve doku kültürü taşımacılığının ekler hipokampal Organotypic dilimleri ile

1. Hemen görüntüleme sonra bir laminar akış başlık, forseps kullanarak 6-şey plaka dışında bir doku kültürü Ekle al.
2. Dikkatli bir şekilde Ekle'nin üzerine steril bir poşette (3 "x 5") ile 20 mL sıcak (37 ° C) deneysel orta taze önceden doldurulmuş transferi ile % 95 oksijen ve % 5 karbon dioksit bubbled.
   Not: oksijen ve karbon dioksit zenginleştirilmiş deneysel orta % 95 oksijen ve % 5 scintered-cam bubbler Dreschel şişe içinde kullanarak karbondioksit ile en az 40 dk bubbled ve steril polietilen torbalar içinde içine transfer olun bir laminar akış doku kültürü hood bakteriyel filtre ve bağlı bir steril dolgu tüp (127 mm) ile 20 mL şırınga kullanarak. Çantayı hemen kapatın ve doku kültürü eklemeden önce transfer için en az 1 h 37 ° C kuluçka için aktarabilirsiniz.
3. Her steril torba (plaka ve iyi kimlik ile) düzgün etiketli bir olun. Her doku kültürü eklemek için bu adımı yineleyin. Dikkatle üzerine (güvenli bir şekilde çantaları üst büküm ve bir plastik kelepçe uygulayarak yapılır) steril sızdırmazlık hava kabarcıkları hariç.
4. Doku kültürü ekler ile steril torbalar ve deneysel orta 6-şey pilakalar 37 ° C kuluçka makinesi dönün.
5. 1 saat sonra dikkatli bir şekilde organotypic dilimleri boyunca şok dalgası pozlama fizyolojik sıcaklığında tutmak için 37 ° c de-iyonize su ile dolu bir termo düzenlenir kutusunun içindeki Plastik kutular içinde doku kültürü ekler ile steril çanta paketi iletişim kuralı.

4. şok tüpü ve hipokampal Organotypic dilim şok dalgası pozlama hazırlanması

1. Çelik-ayak koruyucu çizmeler, bir laboratuvar kat ve eldiven şok tüpü ve şok dalgası pozlama hazırlanması sırasında giymek.
2. Steril torba tutucu çerçeve merkez delik (körleme bir çubuk kullanarak) şok tüpü çıkış ile hizalanır sağlanması şok tüp distal flanş cıvata.
3. İki basınç güç çeviriciler radyal monte: Sensör 1, tahrik bölüm ve sensör (Şekil 1A) şok tüp distal flanş 2 orta kısmında. Basınç güç çeviriciler bir osiloskop geçerli bir kaynak güç ünitesi ile bağlayın.
4. Tüm şok tüp yayın valfleri ve akış denetimleri kapalı olun.
5. Dış basınçlı hava satırı açın ve 2.5 bar solenoid vana şarj edin.
6. Basınçlı hava silindir emniyet valfi açın ve yavaş yavaş yaklaşık 5 bar basınç artırmak için basınç regülatörü açın.
   Not: bu regülatörü için ayarla basınç biraz basınç patlama en yüksek diyafram olmalıdır.
7. Zarlar kesme 23 µm kalınlığında polyester sayfaları tarafından 10 x 10 cm² kareler halinde hazırlayın. Otoklav bandı kullanarak ve onları üst ve alt kısımlarında her diyafram yapışmasını tutamaçları hazırlayın.
8. Bir diyafram (Çift Kişilik makat - tek diyafram yapılandırma tek slot) konumlandırın veya iki diyaframlar (Çift Kişilik makat - her iki yuvaları çift diyafram yapılandırma) makat (Şekil 1B).
9. Diyaframlar merkezi ve kelepçe onları dört M24 somunlar kullanarak, onları sırayla çapraz olarak simetrik bir şekilde tespit etmek ve diyaframlar olan sağlanması bedava.
10. Doku kültürü ekler organotypic hipokampal dilimleri ile yüzeyi şok tüpü çıkış karşı karşıya olduğunu ve doku kültürü Ekle steril içinde ortalanır sağlanması ve tutucu çerçeveye dikey pozisyonda tek tek her steril torba kelepçe çanta (Şekil 1 c). Steril torba güvenli bir şekilde her yerde sıkı ve eşit immobilizasyon sağlamak için sabitlenmiş olduğunu emin olun.
11. Şok tüp baskı kulak savunucuları ve emanet gözlük giymek. Şok dalgası verilerini (50 mega-örnekleri/s, kayıt uzunluğu 20 ms alım oranı, 1 milyon puan) elde etmek ve solenoid valfi kapatmak için geçerli kaynak güç ünitesi ve osiloskop geçiş yapar.
12. Akış kontrol düğmesi şok tüpü denetim masasını kullanarak, yavaş yavaş tek diyafram yapılandırma için şok tüp sürücü birim bölümünü veya sürücü birimi bölümü ve şok tüpü çift diyafram için çift makat bölümünde basınç yapılandırma.
    Not: tek diyafram yapılandırma için sadece diyafram malzeme üzerinde patlama basınç bağlıdır ve basınç patlama malzeme ulaşıldığında kalınlığı ve diyafram spontan rüptürü. Çift Diyaframlı yapılandırması patlama basıncı da gaz basıncı hem sürücü hem de Çift Kişilik makat chambers fark göre değişir ve diyaframlar kontrollü bir şekilde patlak el ile bir kez Çift Kişilik makat emniyet valfi açıldığında hedef baskılar rahatça ulaşabilirsiniz.
13. En kısa zamanda diyafram (bir gürültü üreten), hızlı bir şekilde yırtığı akışı topuzu kullanarak sıkıştırılmış hava akışı kapatın ve solenoid vanayı aç.
    Not: Sürücü bölümü toplam hacmi şok dalgası tepe aşırı basınç ve elde edilecek süreler daha geniş izin kesimleri, blanking ekleme tarafından değiştirilebilir. Şok dalgası parametreleri ideal bileşimi doku yaralanmalara neden yeterli olacaktır ancak yüksek değil yani öyle doku kültürü INSERT veya steril torba bozulma veya yırtılması neden olur.
14. Her steril torba doku kültürü eklemek için bir tek şok tüpü dalgası ile ortaya çıkarmak ve yeni bir steril torba kutusundan alınan ve tutucu çerçevede klempe önce hemen termo düzenlenir kutusuna geri dönün. Olarak 37 ° C'den düşük sıcaklıklarda yaralanma geliştirme ile engelleyebilir adımları 4.10-4.14 sorunsuz ve mümkün olduğunca hızlı olarak (bir kaç dakika içinde) aşağı, deneysel orta soğutma önlemek için gerçekleştirilmesini sağlamak.
15. Bir kez tüm doku kültürü ekler maruz bir şok dalgası (veya sahte Protokolü), doku kültürü ekler orijinal 6-şey plaka ve onların anılan sıraya göre (içinde bir laminar akış doku kültürü hood) dönmek ve kuluçka makinesi için dönün.
16. 6-şey plaka kuluçka % 5 karbon dioksit hava ile daha fazla Imaging kadar 37 ° C'de tutun.
17. Her deneme için dilim şok dalgası pozlama ile birlikte sahte denetimler içerir.
    Not: Sahte dilimleri aynı şekilde bir şok dalgası (deneysel orta ile steril torbalarda mühürlü, şok tüpü laboratuvar aynı termo düzenlenir kutusunda taşınan ve metal çerçeve üzerinde eşdeğer bir süre için askıya maruz dilimlere kabul edilir zaman) şok ama tüp ateş.

5. hipokampal Organotypic dilim yaralanma miktar

1. 24 h, 48 h ve 72 h, dilimleri adımları 2.8 ve 2.9 bölümünde açıklandığı gibi görüntü.
2. Aşağıdaki yerel biyolojik atık protokolleri ve dezenfekte doku ve basınçlı kap metal 72 h sonrası şok dalgası pozda görüntüleme sonra atmak yüzük.

Sonuçlar

Bu yöntemde kullanılan şok tüpü Friedlander işlev^7,8tarafından modellenmiş gerçek açık alan patlamalar taklit aşırı basınç geçişler nesil sağlar. Süpersonik shockwaves hızı 440 m/s (Mach 1.3) (Şekil 2A) elde edilmiştir. Rapor dalga biçimi veri sensörü 2, radyal şok tüpü tahrik bölümünün sonunda konumlandırılmış değil.

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, bir tek şok dalgası için (Şekil 2A) maruz organotypic hipokampal dilim kültürleri önemli yaralanma propidium iyodür, yalnızca hücre ile nüfuz son derece polar bir floresan boya kullanarak sayısal geliştirmek hücresel zarları^24,25 (Şekil 2B, C) ele geçirildi.

Hatta en uygun koşullarda ve diğer OHSC için tutarlı modelleri^21,22yayınlandı, orada arka plan propidium iyodür floresans düşük düzeyde nedeniyle, kısmen, ufak hasar sonucu doğal doku manipülasyonlar (için) ortam değişiklikleri gibi kültür nokta veya görüntüleme için kuluçka kaldırılması sırasında). Steril torbalar ve işleme sırasında şok dalgası pozlama protokol derecesi önemli iç ortamda batma dilimleri içerir önemli manipülasyon Bu patlama TBY Protokolü içerir (Örn., steril çanta sıkma tutucu çerçeve). Tüm adımları dikkatlice gerçekleştirilmesi durumunda hiçbir önemli farklılıklar bir kontrol grubu 6-şey levhalar yaylıdır her zaman muhafaza dilimleri arasında görüldü gibi ancak, bu ek işleme bir etki OHSC temel sağlığı üzerinde sahip değil (i.e., ekler batık veya ele) ve sabitlenmiş steril torbalar içinde şok tüpü (Şekil 2B) batık dilimleri dahil sham grubu.

İki şok dalgaları, seçilmiş 50 kPa ve 55 kPa tepe aşırı basınç, üretilen önemli (p < 0,05 ve p < 0,0001, sırasıyla) ve zarar görmemiş sham karşılaştırıldığında tekrarlanabilir yaralanma dilimler her zaman-puan patlama maruz kaldıktan sonra doku kültürü ekler veya steril torbalar herhangi bir zarar olmadan (Şekil 2B) iletişim kuralı. Küçük tepe aşırı basınç farklılıkları modele duyarlılığını belirlemek için ~ 10 oranında farklı değerler seçmek karar verdik. Bu sonuçlar da beklendiği gibi 55 kPa kaynaklanan yaralanma sonra 50 kPa şok dalgası daha da yüksek, gösteriyor ki.

Verileri ortalama ± standart hata ortalamaya ifade edilir. Önemi bir 2 yönlü tekrarlanan ölçüler Holm-Sidak post hoc testi kullanılarak varyans analizi kullanılarak değerlendirildi. Faktör 1 Grup (kontrol, sham, patlama) ve faktör 1 tekrarlanan faktör neredeydi süre sonra yaralanma (-1 h, 24 h, 48 h ve 72 h), faktör 2 oldu. P değeri birden fazla karşılaştırmalar için düzeltilmesi kullanıldı. Daha az 0,05 P değerleri gruplar arasında anlamlı bir fark belirtmek için alınmıştır. İstatistiksel testler bir grafik ve istatistik yazılım paketi kullanılarak uygulanan edildi.

Şekil 1: şok tüpü cihazın steril torba tutucu çerçeve ile şematik. (A). şok tüpü contalar ve flanşlar tarafından bağlı üç 1.22 m uzun bölüm yapılmış bir 3.8 m uzun paslanmaz çelik boru, bir iç çapı 59 mm. ile (B) iç metin Çift Kişilik makat derleme gösterir. Bir ya da iki Mylar diyaframlar derlemede kauçuk o-halkaları tarafından sağlanan mühür ile sabitlenmiş. (C) steril torba tutucu çerçeve. Şok tüpü çıkışı ile hizalar ortalanmış dairesel delik (59 mm çap) olan iki metal plakalar, çerçeve gövdesi oluşur. Silikon elastomer iki ince (4 mm) yaprak iki metal plakalar arasında donatılmıştır. Bu çarşafları amacı steril torbalar kelepçe için hatta ve kaygan olmayan bir yüzey sağlamaktır. Çanta ve şok tüpü çıkışı arasındaki mesafe 7 cm. kadar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: tipik shockwave ve organotypic hipokampal elde edilen yaralanma dilim kültürler. (A)23 µm kalınlığında polyester film, 2,16 patlama basıncı, 55 kPa tepe aşırı basınç, 0.4 ms olumlu dalga süre, 10.1 kPa·ms dürtü bar kullanarak elde edilen şok dalgasının temsilcisi örnek. Dalga biçimi veri bölümü tahrik şok Boru flanş distal radyal monte sensörü 2 elde. Şok dalgası hız 440 m/s (Mach 1.3) yapıldı. (B) yaralanma gelişimi şok dalgası yoğunluğunu orantılıdır. 50 kPa ve 55 kPa tepe aşırı basınç şok dalgaları sham grubuyla karşılaştırıldığında 72 h Protokolü boyunca geliştirilen önemli yaralanma. 55 kPa tepe aşırı basınç dalgası maruz kalma sonucu yaralanma, 48 h 50 kPa sonra önemli ölçüde daha yüksek ve 72 h. Sham dilimleri aynı şekilde patlama dilimlere tedavi edildi ama şok tüp değil ateş edildi. Denetim dilimleri bir kuluçka herhangi bir manipülasyon olmadan 6 iyi levha saklanır. Barlar ortalama değerleri hem de hata çubukları olan standart hataları (n = 7, denetimleri; n = 48, sham; n = 30, patlama 50 kPa; n = 51, patlama 55 kPa; n 6 ayrı deneyler üzerinden dilim sayısı =). * p < 0,05, *p < 0,0001 sahte ile karşılaştırıldığında. ^# p < 0,05, ^#p < 0,01 patlama 55 kPa ile karşılaştırıldığında. (C) temsilcisi propidium iyodür floresans görüntülerini organotypic dilimleri üzerinden sahte (ben), (II) patlama 50 kPa ve (III) patlama 55 kPa grupları yaralanma sonra 72 saat. Sham dilim floresan, yanidüşük düzeyini göstermektedir:., yaralanma ve maruz dilimleri göster diffüz yaralanma, 55 kPa tepe maruz aşırı basınç dilim üzerinde daha belirgin yüksek düzeyde patlama (ölçek çubuğu 500 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Yaralanma patlama TBY (birincil, ikincil ve üçüncül patlama yaralanma mekanizmaları), patlama yaralanma patlama travma için benzersiz ve en az anlaşılan patlama ilişkili mekanizmaları^{1,2 birincil ile ilişkili tüm mekanizmaları arasında} . Burada açıklanan roman Protokolü birincil patlama TBY vitro fare hipokampal dilim kültürler için bir tekrarlanabilir oluşturulmasına izin verir bir basit ve hızlı bir iletişim kuralı kullanılarak tek bir şok dalgası ortaya çıkarmak için bir açık uçlu şok tüpü kullanarak eğitim için geliştirilmiştir yüksek işlem hacmi ile birincil patlama TBY.

İlk vitro birincil patlama TBY modelleri hidrostatik basınç dalgaları hücreleri^26,27için uygulanan. Süre bir hidrostatik basınç darbe hava patlama aşırı basınç dalgaları¹³daha fazla olduğu gibi ancak, baskı çıktıyı Friedlander işlev model değil. Karakteristik Friedlander işlevi kolayca bir şok tüpü^1,8kullanarak laboratuvarda örnek alınarak. Şok tüpü değiştirerek dalga parametreleri, tepe aşırı basınç, olumlu dalga süre ve itici, gibi hassas kontrol izin verirken gerçek açık alan patlamalar bir geleneksel laboratuvar ortamında simüle şok dalgaları üretebilir diyafram malzeme ve kalınlık ve sürücü birim^8,28,29.

Hücre kültürleri gibi basit vitro modeller genellikle hücre tipleri ve sinaptik bağlantı³⁰heterojen eksikliği. Son zamanlarda, patlama etkisi vitro beyin hücresi 'farklı hücre tipleri birleşmeyle pulcuklarının' incelenen³¹olmuştur. Daha fazla araştırma bu ilginç hazırlıkların merited olduğunu; Ancak, bu nasıl onların hücresel organizasyon ve bağlantı olduğu gibi beyin aynalar açık değil. OHSC bir iyi kurulmuş vitro deneysel model^23,32, kültür için kolay ve iyi korunmuş ve çok onların üç boyutlu doku cytoarchitecture, hücre farklılaşma ve sinaptik bağlantı vardır o vivo içinde^33,34,35,36. benzer OHSCs bir orta seviye hücre kültür ve in vivo model^23,32arasındaki karmaşıklık temsil eder. OHSCs içinde vitro patolojik nörodejeneratif cascades içinde vivo modellerinde görülen çoğaltmak ve potansiyel nöroprotektif uyuşturucu testi ile taranması ve onların mekanizmaları anlama çok yararlı olmuştur göstermiştir Eylem^{17,21,22,37,38}. Son olarak, anatomik alan okudu, hipokampus, bu bölgede sık TBY hastaların^39,40,41yılında zarar olarak translasyonel TBY çalışmalarda son derece alakalı. OHSC modeli patlama TBY^28,42,43,44için kullanılan, ancak modelimiz oldukça kolaydır ve adapte varolan şok-tüplerde ya yatay veya dikey olabilir yapılandırmaları karmaşık uyarlamalar olmadan.

OHSC biyolojik süreçlerin incelenmesi zaman³⁴üzerinde kolaylaştıran kültür birçok gün tutulabilir. Bu modelde, günlük şok dalgası maruz kalma sonuçlandı doku yaralanması ölçüldü üç gün, propidium iyodür, hücre hasarı köklü bir işaretleyici kullanarak patlama pozlama takip. Propidium iyodür nerede nükleik asitler için bağlar ve karakteristik parlak kırmızı floresans^24,25,45sergileyen güvenliği aşılan hücresel zarları hücrelerle nüfuz toksik olmayan bir son derece kutup boya var. Propidium iyodür ile ölçülen floresans^46,47boyama Nisl kullanan yaralı hücre sayısı ile iyi bir ilişki var olduğu gösterilmiştir.

Bu modelde üretilen yaralanma yaygın (Şekil 2C) olduğu göz önüne alındığında, tüm dilim floresans analizi, benzer diğer beyin yaralanması paradigmalar^21,22 , daha önce yayımlanan eser gerçekleştirirken ölçüldü , diğer vitro yaptığı gibi belirli bölgeler, kullanmak yerine patlama TBY^28,43,44,48modeller. Bu makalede açıklanan modelinde kullanılan genel yaklaşım da anahat bölgeleri ilgi tanımlanan ve patlama ile ilgili yaralanma, daha kapsamlı bir görünümünü sağlar yükleyen tanıtıldı potansiyel değişkenlik ortadan kaldırır. Şok dalgası tepe overpressures, 50 kPa ve 55 kPa, üretilen önemli (p < 0,05 ve p < 0,0001, sırasıyla) zaman (Şekil 2B) sham dilimlere göre yaralanma. Beklenen en yüksek tepe aşırı basınç ile şok dalgası gibi 55 kPa, üretilen 50 kPa dalga daha daha fazla yaralanma. Vitro modelinde ile izole beyin doku doğrudan bir shockwave bütün organizma veya bir insan için doğru bir şekilde ölçeklemek nasıl basit değildir maruz. Yine de, biz kullanılan shockwaves alanı, genellikle 50-1000 kPa^8,49gözlenen en yüksek overpressures aralığında bulunmaktadır.

Fizyolojik sıcaklık ve oksijen ve karbon dioksit, kirlenme şok dalgası pozlama Protokolü boyunca arınmış olduklarını sağlarken maruz OHSC korumak için doku kültürü ekler içine steril imzalandı Polietilen torbalar için 37 ° C sıcak ve taze %95 oksijen ve % 5 karbon dioksit, benzer şekilde için daha önce yayımlanmış çalışma^{28,43,44 ile bubbled Deneysel ortamda batık bir aseptik teknik takip ,48}. Nerede karmaşık aygıtlar bu protokolü olarak şok dalgası pozlama sırasında steril torbalar tutmak için kullanılan bu modellerin aksine basit ve hızlı bir yöntem OHSC doku kültürü ekler şok tüpü çıkışı (Şekil 1A, C önünde askıya alma için kullanılan ). Bu raporda açıklanan model hızlı işleme ve yüksek işlem hacmi, Hipotermi riskini en aza indirirken sağlar. Bazı tedavi müdahaleler TBY sonra potansiyel uygulama çok sınırlı bir süre pencerenin olabilir verilen bu bu yönleriyle neuroprotection çalışmalar için özellikle uygundur. Bu roman şok dalgası pozlama Protokolü 6 ile 9 saat (yaklaşık 1 h) kısa bir süre içinde bir şok dalgası maruz (genellikle 36-54 hipokampal organotypic dokusu dilimlerin) doku kültürü ekler sağlar.

OHSCs boyunca iyi aseptik teknik gerektirir. Bir aseptik laminar akış hood kültür boyunca ve patlama için steril torbalar aktarırken kullanmak önemlidir. Dilim görüntüleme yerde 6-şey plakaların kapakları ile aseptik koşullar altında gerçekleştirmek için biz özel yapım metal halkalar hücre kültür ekler için mikroskop odak düzlemi artırmak için kullanın. Bizim protokol önemli bir parçası Biz razıyız sham dilimleri her denemeye dahil olduğunu. Sham dilimleri patlama dilimlere şok-tüp ateş istisna ile aynı şekilde kabul edilir; başka bir önemli adım tüm dilimler yaralanma veya sahte tedavi kullanılan dilimleri nüfusa sağlık özdeş (Şekil 2B) olduğundan emin olmak için önce 1 h görüntüsü olduğunu.

Zaman dilimleri içinde hücre yaralanma miktarının yanı sıra, doku geleneksel immünhistokimya⁵⁰denemenin sonunda düzeltilebilir. Geliştirilen ve fare hipokampal dilimleri kullanarak yöntemi değerlendirilir. Ancak, bizim teknik spinal kord, retina, akciğer veya epitel doku kültüründe yetiştirilen diğer doku kullanmak için kolayca adapte olacaktır. Bu kağıt ve önceki iş modeli ile biz sadece tek bir patlama maruz etkisini araştırdık. Ancak, model beyin ya da diğer doku yinelenen alt düzey patlamaların etkilerini araştırmak için uygun olacaktır. OHSCs kültür birçok hafta boyunca devam veya hatta aylar, kronik etkileri araştırılması için izin.

Vitro modelleri, in vivo modeller daha basit olmak daha yüksek üretilen iş sahip, daha az pahalı ve deneyler genellikle bir daha kısa zaman ölçeği¹⁷tarihinde tamamlanabilir. Ancak, vitro modelleri kullanarak elde edilen sonuçları gibi kültürlü vitro doku yapay bir ortamda tutulur ve yaralanma için farklı ne yanıt hayvan modellerinde doğrulanması gerekir vivo içinde¹⁷yaparlardı. Yine de, vitro modelleri beyin yaralanması cascades bizim anlayış artırmada son derece değerli olmuştur ve nöroprotektif uyuşturucu daha karmaşık vivo kullanmadan önce eleme^17,22 modelleri ^{, 51 , 52}. kafa içi artmasına rağmen pek çok avantajı vitro modelleri belgili tanımlık anahtar şekil-in TBY mevcut hayvanlar ve damar sistemi üzerindeki etkileri gibi vivo içinde modeller eksikliği dikkat edilmesi gereken önemli bu modeli tarafından sunulan basınç, sistemik bağışıklık yanıtı ve tüm hayvan modellerinde vitro bulundu sonuçları doğrulamak için ihtiyaç vurgular işlevsel davranış bozukluğu. Yine de, vitro modelleri modeli bu yazıda açıklandığı gibi son derece yararlı hızle ilgili bilimsel araçlar bulunmaktadır.

Sonuç olarak, bu işi nereye fare organotypic hipokampal doku kültürleri sıkıca kontrollü ve tekrarlanabilir gerçek ilgili şok bir laboratuvar şok tüpü kullanarak dalgalar için sunulan basit ve anlaşılır bir roman yöntemi tanımlar. Propidium iyodür, hücre hasarı, köklü bir işaretleyici kullanarak sayısal ortaya çıkan küresel yaralanma çok tekrarlanabilir ve şok dalgaları uygulanan en yüksek aşırı basınç orantılıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geys balanced salt solution	Sigma UK	G9779
D- glucose	Sigma UK	G8270
Antibiotic/antimycotic	Sigma UK	A5955
Minimum essential medium Eagle	Sigma UK	M4655
Hanks balanced salt solution	Sigma UK	H9269
Horse serum	Sigma UK	H1138
L-glutamine	Sigma UK	G7513
HEPES	VWR Prolabo, Belgium	441476L
Sodium hydroxide	Sigma UK	S-0945
Tissue culture inserts	Millicell CM 30 mm low height Millipore	PICM ORG 50
6-well plates	NUNC, Denmark	140675
Propidium iodide	Sigma UK	P4864
Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags	Fisherbrand	01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm)	Smiths Medical Supplies	E910
Epifluorescence microscope	NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective	Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter	Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm	RS Components UK	785-0782
Pressure transducer	Dytran Instruments Inc.	2300V1
Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.	Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184
Graphing & statistics software	GraphPad Software, USA	Prism 7.0