Un modello di romanzo In Vitro di ferita di cervello traumatica di scoppio

Riepilogo

Questo articolo descrive un nuovo modello di ferita di cervello traumatica esplosione primaria. Un tubo di aria compressa guidato d'urto viene utilizzato per esporre in vitro culture hippocampal fetta di mouse per una singola onda d'urto. Si tratta di un protocollo semplice e rapido, generando una lesione del tessuto di cervello riproducibile con un throughput elevato.

Abstract

Ferita di cervello traumatica è delle cause principali di decesso e invalidità in popolazioni militari e civili. Risultati di ferita di cervello traumatica esplosione dalla detonazione di ordigni esplosivi, tuttavia, i meccanismi che sottendono il danno cerebrale derivando dall'esposizione di sovrapressione di esplosione interamente non sono capiti e sono creduti per essere unico per questo tipo di lesione cerebrale. Modelli preclinici sono strumenti fondamentali che contribuiscono a comprendere meglio la lesione cerebrale indotta da esplosione. Un modello TBI del blast romanzo in vitro è stato sviluppato utilizzando un tubo d'urto a tempo indeterminato per simulare le onde di vita reale campo aperto blast modellate dalla forma d'onda di Friedlander. Su colture organotipiche hippocampal fetta del mouse C57BL/6N sono stati esposti a onde d'urto singole e lo sviluppo della lesione è stato caratterizzato fino a 72 h utilizzando ioduro di propidio, un marcatore fluorescente consolidato di danno delle cellule che solo penetra le cellule con compromesse le membrane cellulari. Fluorescenza di ioduro di propidio era significativamente più alta nelle fette esposte a un'onda d'urto quando confrontato con fette di sham per tutta la durata del protocollo. La ferita del tessuto di cervello è molto riproducibile e proporzionale per la sovrappressione di picco dell'onda shock applicato.

Introduzione

Ferita di cervello traumatica di scoppio (TBI) è un tipo complesso del trauma cranico che deriva dalla detonazione di ordigni esplosivi^1,2. Blast TBI è emersa come un importante problema di salute negli ultimi 15 anni con i recenti conflitti militari in Iraq e Afghanistan^2,3. Nel complesso, si stima che tra il 4,4% e 22,8% dei soldati di ritorno da Iraq e Afghanistan hanno sofferto TBI delicato, una grande percentuale di questi che sono correlate a scoppio, con un più alto tasso segnalato di blast TBI in forze statunitensi rispetto con le forze di UK^{4 ,5}.

L'uso di dispositivi esplosivi improvvisati è stato responsabile per la maggior parte del trauma blast-collegato, tra cui esplosione TBI, sopportato il⁶di forze militari. La detonazione di una carica esplosiva si traduce in un rapidissimo — ma transitoria — aumento della pressione, che si verificano in millisecondi. L'onda di sovrapressione risultante da un'esplosione di vita reale campo libero è modellata dalla funzione Friedlander, con un aumento improvviso per la sovrappressione di picco, seguita da un decadimento esponenziale^7,8. La gamma di forze estreme e loro corso rapido tempo visto in un evento di esplosione sono solitamente non esperti nel non-blast traumi^1,9. La sovrappressione di picco, che è la pressione massima della forma d'onda e la durata dell'onda positiva sono creduti per essere contributori importanti alla ferita di cervello di scoppio e questi dipendono la carica esplosiva e la distanza dalla detonazione^{10, 11}.

Il trauma che risultati da un'esplosione è classificata come quattro componenti discreti, designati come primario, secondario, terziario e Quaternario esplosione ferita^10,12,13,14. Ciascuno di questi componenti è associata con meccanismi specifici della ferita. Ferita di scoppio primario deriva dall'azione diretta dell'onda di sovrapressione su organi e tessuti^2,13. Risultati di lesioni di scoppio secondario dall'impatto dei frammenti di proiettile, causando penetrante e non-penetrante ferite^2,15. Ferita di scoppio terziario si verifica quando il corpo della vittima è spostato contro la terra o di oggetti circostanti ed è associato con le forze di accelerazione/decelerazione^1,10,13. Ferita di scoppio quaternario descrive un gruppo eterogeneo di lesioni direttamente collegate all'esplosione non rientrano le prime tre lesioni meccanismi descritti^12,13. Esso include (ma non è limitato a) lesioni termiche, inalazione di fumo, radiazioni, onde elettromagnetiche e gli effetti psicologici negativi^13,15. Maggior parte blast-collegata TBI risultati direttamente dai primi tre meccanismi della ferita, mentre i meccanismi quaternari della ferita di scoppio sono associati solitamente con lesioni sistemiche¹³. Gli effetti delle forze di accelerazione/decelerazione (ad es., colpo di frusta), smussare e penetrante lesioni cerebrali traumatiche sono stati ampiamente studiati in relazione ad altri tipi di trauma cranico (ad es., incidenti automobilistici, cadute, balistica ferita). Tuttavia, l'onda di sovrapressione di esplosione primaria è univoco per ferita di scoppio e i suoi effetti sul tessuto cerebrale sono molto meno ben compreso¹⁶. I meccanismi di lesione primaria blast, connessi con un'onda di sovrapressione, sono i primi delle forze meccaniche di interagire con il cervello.

Numerosi modelli preclinici di TBI sono stati sviluppati negli ultimi decenni che sono stati preziosi per comprendere meccanismi TBI scoppio della ferita e della patofisiologia e indagare su potenziali nuovi trattamenti, che altrimenti sarebbero impossibili da fare esclusivamente nel clinico impostazione^17,18,19. Sebbene nessun singolo modello preclinico in grado di riprodurre la complessità del trauma del cervello clinico blast, in genere diversi modelli preclinici di TBI replicano aspetti distinti di TBI umano. L'azione dannosa delle forze connesso con un'esplosione di esplosione può essere studiato isolatamente o in combinazione in modelli esplosione TBI sia in vitro che in vivo . Modelli in vitro hanno il vantaggio di consentire uno stretto controllo dell'ambiente sperimentale (condizioni fisiologiche dei tessuti e biomeccanica lesioni), che riduce la variabilità biologica e migliora la riproducibilità, permettendo lo studio di senza i confounders presenti nell'animale modelli²⁰cascate molecolari specifici. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello in vitro per studiare gli effetti di esplosione primaria sul tessuto cerebrale. Abbiamo mirato a sviluppare un modello con un'onda d'urto supersonico con un rappresentante di forma d'onda di Friedlander di un'esplosione di campo libero come quello prodotto da un ordigno esplosivo improvvisato (IED).

Protocollo

Gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati fatti in conformità con il Regno Unito animali (procedure scientifiche) Act del 1986 e sono stati approvati dalla Animal Welfare & etica recensione corpo dell'Imperial College London. Cura degli animali era in conformità con le linee guida istituzionali dell'Imperial College di Londra.

1. cultura e preparazione hippocampal Organotypic fetta

Nota: Questo protocollo permette la produzione di fette hippocampal organotypic secondo il metodo di interfaccia descritta da Stoppini e colleghi con modifiche minori^21,22,23. Idealmente, non più di tre animali dovrebbero essere euthanized e sezionati in una sola sessione per garantire che ogni passaggio è fatto rapidamente e per evitare di compromettere la qualità delle fette. Usare una tecnica asettica in tutto.

1. Garantire che i seguenti passi prima di iniziare il protocollo di dissezione.
   1. Preparare e filtro sterilizzare tutte le soluzioni in anticipo, utilizzando un filtro di 0,22 µm.
   2. Mantenere le soluzioni a 4 ° C durante lo stoccaggio e durante la dissezione cerebrale e la preparazione di fettine di ippocampo mantenendo i contenitori di stoccaggio e di Petri su un dissipatore di calore del metallo che si siede sul ghiaccio bagnato a tutte le ore.
   3. Autoclave tutti i metalli, strumenti, anelli e fazzoletti di carta.
   4. Garantire a tutti gli strumenti e materiale da utilizzare per ogni passaggio del protocollo sono pronti all'uso, strutturate in anticipo e spruzzato con etanolo al 70%. Garantire che essi sono autorizzati a raffreddare e asciugare.
2. Eutanasia di un giorno di 5 – 7-vecchio C57BL/6N mouse pup di dislocazione cervicale e brevemente pulire la superficie di tutta la pelle con fazzoletto di carta sterile imbevuto di etanolo al 70%. Picchiettare la pelle secca e decapitare il cucciolo usando le forbici Mayo.
3. Tagliare la pelle del cuoio capelluto con forbici iris lungo la linea mediana della testa a partire nella regione occipitale e termina vicino al muso e ritirarlo lateralmente.
4. Inserire la punta delle forbici di Allerød nel foramen magnum e fare due piccoli tagli laterali sull'osso lungo i seni trasversali, poi tagliare il cranio lungo la linea mediana fino a bulbo olfattivo e fare due piccoli tagli perpendicolarmente alla linea mediana in questa regione.
5. Utilizzando bene scegliere forcipe curvo, ritrarre i lembi dell'osso lateralmente dalla linea mediana, con attenzione rimuovere il cervello con una spatolina e trasferirlo su un 90 mm in silicone rivestito di elastomero di Petri contenenti "dissezione mezzo".
   Nota: Supporto di dissezione è che Gey equilibrata soluzione di sale (5 mg/mL D-glucosio, 1% soluzione antibiotico antimicotico, con 10.000 unità/mL penicillina, 10 mg/mL di streptomicina e 25 µ g/mL di amfotericina B).
6. Rimuovere il cervelletto e separare gli emisferi cerebrali lungo il midline usando una lama di rasoio. Utilizzare una spatola per trasferire gli emisferi cerebrali a un nuovo silicone 90 mm rivestite con elastomero di Petri riempito con medium fresco dissezione ghiacciata. Se più di un animale deve essere utilizzato in un'unica sessione, ripetere i passaggi da 1,2 – 1,6.
7. Sotto un microscopio stereoscopico, tagliare il bulbo olfattivo e la punta della corteccia frontale con una lama di rasoio e corteccia cerebrale di separato dal resto del tessuto cerebrale usando il forcipe punta fine. Questo passaggio lascia l'ippocampo esposto sulla superficie mediale del tessuto corticale. Da questo punto in poi, utilizzare una cappa a flusso laminare coltura tissutale (ultravioletto sterilizzati e puliti con etanolo al 70% soluzione).
8. Applicare liquido di dissezione ghiacciata un disco taglio in plastica piatta e, utilizzando una spatola, posizionare il tessuto cerebrale sul disco in modo tale che la superficie mediale della corteccia è rivolto verso l'alto e l'asse dell'ippocampo è perpendicolare all'asse della lama per tritare.
9. Rimuovere per quanto possibile del mezzo dissezione dal taglio disco utilizzando una punta fine pipetta Pasteur.
10. Tagliate a fette 400 µm utilizzando un elicottero del tessuto ad una velocità di taglio del 50% del cervello e forza.
    Nota: È molto importante che questo passaggio avvenga più velocemente possibile come il tessuto cerebrale non è sommerso nel mezzo di dissezione.
11. Sostituire il mezzo di dissezione nella capsula di Petri rivestite con elastomero in silicone con medium fresco ghiacciato.
12. Una volta terminata l'elicottero di tessuto, accuratamente immergere il tessuto cerebrale in mezzo fresco dissezione e trasferire il tessuto tagliato indietro di 90 mm in silicone rivestito di elastomero Petri un bisturi a lama dritta.
13. Sotto un microscopio stereoscopico, separare con cura le fette corticali usando il forcipe punta fine. Per ogni fetta, ispezionare l'ippocampo per morfologia e potenziale danno di tessuto risultante dalla dissezione o affettare.
14. Dalla corteccia entorinale e da fimbria utilizzando pinze a punta fine e piccole forbici di Allerød, separate ippocampi. In genere, circa 6-8 fette hippocampal sono generati per emisfero.
15. Trasferimento fino a 6 fette hippocampal da un inserto di cultura del tessuto utilizzando un taglio pipetta Pasteur e posto all'interno di un 35mm Petri dish. Garantire che le fette siano diffusi pochi millimetri apart (questo garantirà che ogni fetta può essere imaged individualmente).
16. Aggiungere immediatamente ghiacciata "coltura" alla parte inferiore di ogni capsula di Petri, sotto l'inserto di coltura del tessuto, appena sotto la cima della coltura del tessuto inserisce rim.
    Nota: Crescita medio contiene 50% minimo essenziale medio Eagle, 25% Hanks' equilibrata soluzione salina, 25% di siero equino, 5 mg/mL D-glucosio, 2 mmol/L L-Glutammina, 1% soluzione antibiotico antimicotico e 10 mmol/L HEPES, titolato a pH 7,2 con idrossido di sodio.
17. Cambiare il mezzo di crescita il giorno dopo la dissezione e poi ogni 2 o 3 giorni da allora in poi (uso medio di crescita a 37 ° C). Assicurarsi che il terreno di coltura viene aggiunto in quantità sufficiente, ma non tanto che supera sopra la membrana di inserto di coltura del tessuto, che poteva compromettere la vitalità delle fette del tessuto.
18. Tenere le fette di tessuto in un incubatore a 37 ° C con 5% di anidride carbonica nell'aria per 12-14 giorni prima di essere utilizzati negli esperimenti.

2. preparazione delle fette Hippocampal Organotypic per il protocollo TBI sperimentale Blast

Nota: Tutti i passaggi di questa sezione, ad eccezione di imaging, si svolgono in una cappa a flusso laminare coltura del tessuto.

1. Inserire gli anelli in acciaio inox su misura in un piatto ben 6 (uno per pozzetto).
   Note: Gli anelli hanno un cerchio con una tacca (che dovrebbe sedersi in posizione 12) e adattarsi comodamente all'interno dei pozzi, mentre la coltura del tessuto inserti adattano facilmente in questo cerchio. Assicurarsi che gli anelli sono lavati con un disinfettante battericida, accuratamente risciacquati con acqua purificata, in autoclave e lasciare raffreddare in anticipo.
2. Riempire il pozzetto della piastra 6-pozzetti con pre-riscaldata (37 ° C) senza siero "medio sperimentale" con ioduro di propidio.
   Nota: Supporto sperimentale con ioduro di propidio è: 75% minimo essenziale medio Eagle, 25% Hanks' equilibrata soluzione salina, 5 mg/mL D-glucosio, 2 mmol/L L-Glutammina, 1% soluzione antibiotico antimicotico, HEPES 10 mmol/L e ioduro di propidio 4,5 µmol/L, pH titolato a 7,2 con idrossido di sodio.
3. Assicurarsi che il livello del mezzo non raggiunge sopra la tacca dell'anello. Trasferire la piastra 6-pozzetti con gli anelli dell'incubatrice per 1 h garantire che il supporto è a 37 ° C immediatamente prima del trasferimento degli inserti di coltura del tessuto.
4. Trasferire gli inserti di coltura del tessuto con le fette di organotipiche dai piatti Petri 35 mm in 6-pozzetti con gli anelli ed il mezzo sperimentale con il forcipe.
5. Fare un punto sul cerchio inserto in posizione 3 con un pennarello permanente.
   Nota: Gli inserti stanno per essere rimossi dalla piastra 6 pozzetti durante l'esperimento e questo passo consente di riportare l'inserto alla posizione originale dopo l'esposizione di onda d'urto e facilmente tenere traccia di ogni fetta in tutto il protocollo.
6. Etichettare ogni piatto 6-pozzetti con una data e un nome univoco e fare una mappa dei pozzi di ogni piatto, ogni pozzetto di denominazione (ad es., A, B, C, ecc.) e ogni fetta in ogni pozzetto (ad es., 1, 2, 3, ecc.), in modo che ogni fetta ha un identificatore univoco ( ad esempio., A1, A2, A3, ecc.).
7. Trasferire la piastra a 6 pozzetti nell'incubatore per 1 h garantire che le fette sono a 37 ° C immediatamente prima di formazione immagine.
   Nota: Evitare l'overflow del mezzo o inserire eventuali bolle d'aria sotto la coltura del tessuto della membrana, che poteva compromettere la vitalità delle fette.
8. 1 h dopo il trasferimento a medio sperimentale, immagine ogni fetta singolarmente utilizzando un microscopio a fluorescenza (2 obiettivo X, NA 0,06) dotato di un'adeguata eccitazione (BP 535/50 nm) e il filtro di emissione (LP 610 nm) per valutare la salute di fetta prima della lesione protocollo è effettuato.
   Note: Le fette che presentano aree di fitta rosso colorazione in questa fase dovrebbero essere considerate di presentare viabilità compromessa e dovrebbero essere esclusi da un'ulteriore analisi (questi in genere rappresentano meno del 10% del numero totale di fette generato). Garantire che la formazione immagine viene eseguita in modo sequenziale e più rapidamente possibile per ridurre al minimo il tempo che le fette sono all'esterno dell'incubatrice (in genere 6 pozzi dovrebbero prendere poco meno 30 min per immagine).
9. Tenere il coperchio della piastra 6 pozzetti in ogni momento. Formazione di condensa possono accumularsi all'interno del coperchio. Se questo accade, brevemente di usare un asciugacapelli a bassa definizione.
10. Garantire che tutte le condizioni di formazione immagine sono identiche in giorni diversi e fra gli esperimenti.
    Nota: L'obiettivo di formazione immagine è quello di quantificare la fluorescenza del tessuto, quindi questo passaggio è importante per garantire la riproducibilità dei risultati e consentire il confronto dei dati ottenuti.

3. immersione e trasporto della coltura del tessuto inserti con le fette Hippocampal Organotypic

1. Immediatamente dopo, la formazione immagine in una cappa a flusso laminare, prendere una coltura tissutale inserto dalla piastra 6 pozzetti usando il forcipe.
2. Attentamente il trasferimento l'inserto in un sacchetto di polietilene sterile (3 "x 5") pre-riempita con 20 mL di terreno sperimentale tiepida (37 ° C) appena gorgogliare con 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica.
   Nota: Assicurarsi che il terreno sperimentale arricchito ossigeno e anidride carbonica è stato gorgogliare per almeno 40 min con 95% di ossigeno e 5% anidride carbonica usando un gorgogliatore scintered-vetro all'interno di una bottiglia di Dreschel e trasferito nei sacchi in polietilene sterile all'interno un coltura del tessuto cappa a flusso laminare usando una siringa da 20 mL con un filtro antibatterico e un tubo di riempimento in condizioni sterili (127 mm) attaccato. Sigillare i sacchetti immediatamente e trasferirli in un incubatore a 37 ° C per almeno 1 h prima di inserire la coltura tissutale trasferimento.
3. Garantire che ogni sacchetto sterile sia correttamente etichettato (con la piastra e l'identificazione ben). Ripetere questo passaggio per ogni inserimento di coltura del tessuto. Escludere le bolle d'aria con attenzione al momento di sigillatura sacchetti sterili (fatto saldamente ruotando la parte superiore delle borse e applicando una fascetta in plastica).
4. Restituire i sacchetti sterili con gli inserti di coltura del tessuto e la piastra 6-pozzetti con terreno sperimentale in incubatore 37 ° C.
5. Dopo 1 h, imballare accuratamente i sacchetti sterili con gli inserti di coltura del tessuto in scatole di plastica dentro una scatola di termo-regolazione riempito con acqua deionizzata a 37 ° C al fine di mantenere le fette organotipiche alla temperatura fisiologica durante l'esposizione di onda d'urto protocollo.

4. preparazione del tubo d'urto e l'esposizione di Hippocampal Organotypic fetta onda d'urto

1. Indossare stivali protettivi in acciaio-punta, un camice da laboratorio e guanti durante la preparazione del tubo di scossa e l'esposizione di onda d'urto.
2. Il telaio reggi sacchetto sterile del bullone alla flangia distale scossa tubo, assicurando che il foro centrale sia allineato con la presa di tubo shock (utilizzando un'asta di chiusura).
3. Montare due trasduttori di pressione radiale: sensore 1, nella parte centrale della sezione guidata e sensore 2 nella flangia distale del tubo ammortizzatore (Figura 1A). Collegare i trasduttori di pressione ad un oscilloscopio attraverso un'unità di alimentazione di origine corrente.
4. Assicurarsi che tutte le valvole di uscita tubo di scossa e controlli di flusso sono chiuse.
5. Aprire la linea esterna di aria compressa e addebitare l'elettrovalvola a 2,5 bar.
6. Aprire la valvola di sicurezza del cilindro ad aria compressa e aprire lentamente il regolatore di pressione per aumentare la pressione a circa 5 bar.
   Nota: La pressione impostata per questo regolatore dovrebbe essere leggermente sopra il diaframma più alto pressione di scoppio.
7. Preparare i diaframmi di 23 fogli di poliestere µm di spessore taglio in quadrati di 10 x 10 cm² . Preparare le maniglie utilizzando nastro autoclave e attaccarle alla parte superiore e inferiore di ogni diaframma.
8. Posizionare uno diaframma (singolo slot della doppia culatta - configurazione diaframma singolo) o due diaframmi (entrambi gli slot della culatta doppia - configurazione a doppia membrana) in culatta (Figura 1B).
9. Centrare i diaframmi e serrare utilizzando quattro M24 bulloni e dadi, fissarli in modo sequenziale in modo diagonale simmetrico e garantire che i diaframmi sono senza rughe.
10. Bloccare ogni sacchetto sterile individualmente in posizione verticale sul telaio titolare, assicurando che la superficie degli inserti di coltura del tessuto con le fette hippocampal organotypic è rivolta verso lo sbocco del tubo di scossa e l'inserto di coltura del tessuto è centrato all'interno della sterile sacchetto (Figura 1). Assicurarsi che il sacchetto sterile sia saldamente fissato tutto intorno affinché immobilizzazione decisa e costante.
11. Indossare cuffie antirumore e occhiali di sicurezza quando sotto pressione il tubo d'urto. Inserire l'unità di potenza attuale sorgente e oscilloscopio per acquisire i dati di onde d'urto (tasso di acquisizione di 50 mega-campioni/s, record di lunghezza 20 ms, 1 milione di punti) e chiudere la valvola a solenoide.
12. Utilizzando la manopola di controllo di flusso sul pannello di controllo del tubo di scossa, pressurizzare lentamente sezione driver volume del tubo ammortizzatore per configurazione a membrana unica o la sezione del volume di driver sia la sezione doppia culatta del tubo ammortizzatore a doppia membrana configurazione.
    Nota: Per la configurazione a membrana unica, la pressione di scoppio dipenderà solo il materiale della membrana e lo spessore e il diaframma rompe spontaneamente una volta raggiunta il pressione di scoppio di materiale. Per la configurazione a doppia membrana, la pressione di scoppio dipenderà anche la pressione del gas differenziale sia il driver che le camere doppie culatta e, per i diaframmi scoppiare in modo controllato, la culatta doppia valvola di sicurezza viene aperta manualmente una volta le pressioni di destinazione sono raggiungibili.
13. Non appena la membrana si rompe (producendo un forte rumore), rapidamente chiudere il flusso di aria compressa tramite la manopola di flusso e aprire la valvola solenoide.
    Nota: Il volume totale della sezione driver può essere modificato mediante l'inserimento di tranciatura segmenti, consentendo una più ampia gamma di sovrappressione di picco di onda d'urto e le durate di ottenere. La combinazione ideale di onda d'urto parametri dovrebbe essere sufficiente a causare la lesione del tessuto, ma non così in alto che causa coltura tissutale insert o distorsione sacchetto sterile o rottura.
14. Ogni sacchetto sterile con un inserimento di coltura del tessuto in un singolo tubo onda d'urto di esporre e tornare immediatamente alla casella di termo-regolazione prima un nuovo sacchetto sterile è preso dalla scatola e bloccato sul telaio della porta. Garantire che passaggi 4.10 – 4,14 vengono eseguiti come uniformemente e rapidamente possibile (entro pochi minuti) per evitare il raffreddamento medio sperimentale verso il basso, come temperature inferiori a 37 ° C possono interferire con lo sviluppo di lesioni.
15. Una volta che tutti gli inserti di coltura del tessuto sono stati esposti a un onda d'urto (o protocollo di sham), restituire gli inserti di coltura del tessuto alla piastra originale 6 pozzetti e ai rispettivi bene (all'interno di una cappa a flusso laminare coltura tissutale) e restituire nell'incubatore.
16. Tenere la piastra a 6 pozzetti in incubatrice con 5% di anidride carbonica nell'aria a 37 ° C fino a ulteriori di formazione immagine.
17. Sono comandi finti per ogni esperimento, insieme con l'esposizione di onda d'urto di fetta.
    Nota: Fette di Sham sono trattati in modo identico per le fette esposte a un'onda d'urto (sigillati in sacchetti sterili con medio sperimentale, trasportati al laboratorio del tubo di scossa nella stessa casella di termo-regolazione e sospeso sul telaio metallico per un periodo equivalente di tempo), ma lo shock tube non viene generata.

5. hippocampal Organotypic fetta lesioni quantificazione

1. A 24h, 48h e 72 h, immagine le fette come descritto nella procedura 2.8 e 2.9.
2. Dopo formazione immagine a 72 h post onda d'urto-esposizione, scartare il tessuto biologico locale seguente protocolli di rifiuti e disinfettare e autoclave il metallo anelli.

Risultati

Il tubo d'urto utilizzato in questo metodo consente la generazione di transienti di sovrapressione che simulare esplosioni di vita reale campo aperto modellati da Friedlander funzione^7,8. Onde d'urto supersonico con una velocità di 440 m/s (Mach 1.3) sono stati ottenuti (Figura 2A). I dati di forma d'onda segnalati sono dal sensore 2, posizionato radialmente alla fine della sezione guidata del tubo di scossa.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, colture hippocampal fetta organotipiche esposti a una singola onda d'urto (Figura 2A) sviluppano ferita significativa quantificato utilizzando ioduro di propidio, una tintura fluorescente altamente polare che penetra solo le celle con compromesse le membrane cellulari^24,25 (Figura 2B, C).

Anche in condizioni ottimali e coerente per altri OHSC pubblicato modelli^21,22, c'è un basso livello di fluorescenza di ioduro di propidio fondo dovuta, in parte, ai danni di lieve entità derivanti dal tessuto inerente le manipolazioni ( quali i cambiamenti di media durante il periodo di cultura o la rimozione dall'incubatrice per l'imaging). Questa esplosione protocollo TBI comporta la sostanziale manipolazione che include la sommersione delle fette in mezzo all'interno di sacchetti sterili e un notevole grado di manipolazione durante il protocollo di esposizione di onde d'urto (ad es., bloccaggio i sacchetti sterili per la telaio). Tuttavia, se tutti i passaggi sono eseguiti con cura, questa ulteriore manipolazione non avere un impatto sulla salute sottostante il OHSC come nessuna differenza significativa è stata veduta fra un gruppo di controllo di fette tenute nelle piastre 6 pozzetti in ogni momento (cioè., gli inserti non sono state sommerse o gestiti) e il gruppo finto, che comprendeva le sezioni sono stati sommersi dentro sacchetti sterili fissate al tubo della scossa (Figura 2B).

Le due onde d'urto scelte, a 50 kPa e 55 kPa sovrappressione di picco, prodotto significativo (p < 0,05 e p < 0,0001, rispettivamente) e riproducibile lesioni rispetto alla sham illeso fette a tutti i punti di tempo dopo l'esposizione di scoppio protocollo (Figura 2B) senza causare alcun danno per gli inserti di coltura del tessuto o sacchetti sterili. Al fine di determinare la sensibilità del modello per piccole differenze nel picco-sovrapressione, abbiamo deciso di selezionare i valori che erano diversi da ~ 10%. Questi risultati mostrano anche che, come previsto, il pregiudizio derivante da 55 kPa è superiore a quello dopo un'onda d'urto di 50 kPa.

I dati sono espressi come media ± errore standard della media. Significato è stato valutato utilizzando un 2 vie misure ripetute analisi della varianza utilizzando test post hoc, Holm-Sidak. Fattore 1 era il gruppo (controllo, sham, blast) e fattore 2 era tempo dopo la lesione (h-1, 24h, 48h e 72 h), dove il fattore 1 era il fattore ripetuto. La regolazione del valore di p per i confronti multipli è stata usata. Valori di P di meno di 0,05 sono stati presi per indicare una differenza significativa tra i gruppi. Test statistici sono state implementate utilizzando un pacchetto di software grafici e statistiche.

Figura 1: schema del dispositivo tubo ammortizzatore con il telaio reggi sacchetto sterile. (A). il tubo d'urto è un tubo di acciaio inox lungo 3,8 m, fatto di tre lunghe sezioni di 1,22 m, collegati da guarnizioni e flange, con un diametro interno di 59 mm. Inset (B) Mostra il montaggio doppia culatta. Uno o due diaframmi di Mylar possono essere fissati nell'assembly con guarnizione fornita da o-rings in gomma. (C) telaio sacchetto Sterile. Il corpo del telaio è costituito da due piastre di metallo con un foro circolare centrato (59 mm di diametro) che si allinea con lo sbocco del tubo di scossa. Due fogli sottili (4 mm) di elastomero di silicone sono inseriti fra le due piastre di metallo. Lo scopo di questi fogli è quello di fornire una superficie piana e non scivolosa per bloccare i sacchetti sterili. La distanza tra la borsa e l'uscita del tubo di scossa è 7 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: tipico shockwave e lesione risultante in organotipiche hippocampal fetta culture. (A) esempio rappresentativo di onda d'urto, ottenuta utilizzando 23 µm di spessore pellicola di poliestere, 2.16 bar pressione di scoppio, 55 kPa picco sovrapressione, 0,4 ms di durata onda positiva, 10,1 kPa·ms impulso. Dati di forma d'onda sono stati ottenuti dal sensore 2 montati radialmente sulla flangia del tubo ammortizzatore guidato sezione distale. La velocità di onda d'urto era 440 m/s (Mach 1.3). (B) lo sviluppo di lesioni è proporzionale all'intensità dell'onda d'urto. Sia 50 kPa 55 kPa picco sovrapressione onde d'urto causate ferita significativa che ha sviluppato in tutto il protocollo di 72 h se confrontato con il gruppo finto. Il danno risultante da un'esposizione di onda 55 kPa sovrappressione di picco era significativamente superiore dopo 50 kPa a 48 h e fette di Sham 72 h. sono stati trattati in modo identico a fette esplosione ma tubo d'urto non è stato licenziato. Fette di controllo sono stati mantenuti in ben 6 piastre in un incubatore senza alcuna manipolazione. Barre rappresentano valori medi e barre di errore sono errori standard (n = 7, controlli; n = 48, falsità; n = 30, scoppio 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = numero di sezioni, da 6 esperimenti separati). * p < 0,05, *p < 0,0001 rispetto con la falsità. ^# p < 0,05, ^#p < 0.01 confrontato con esplosione 55 kPa. (C) immagini di fluorescenza di ioduro di propidio rappresentante organotipiche fette da sham (mi), (ii) scoppio 50 kPa e (iii) scoppio 55 kPa gruppi a 72 h dopo la lesione. La fetta di sham Mostra bassi livelli di fluorescenza, cioè., lesioni e l'esplosione fette esposte mostrano alti livelli di ferita diffusa, più pronunciato sulla fetta di sovrapressione esposti picco 55 kPa (barra della scala = 500 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Fra tutti i meccanismi della ferita si è associata con blast TBI (meccanismi di ferita di scoppio primario, secondario e terziario), primario ferita di scoppio è unico al trauma di scoppio ed è la meno compresa del meccanismi di esplosione-collegata^1,2 . Il romanzo protocollo descritto qui è stato sviluppato per studiare esplosione primaria TBI utilizzando un tubo d'urto a tempo indeterminato per esporre in vitro culture hippocampal fetta di mouse a un'onda d'urto singola utilizzando un protocollo semplice e rapido che permette la creazione di un riproducibile esplosione primaria TBI con un throughput elevato.

I primi modelli TBI in vitro esplosione primaria applicato onde di pressione idrostatica a cellule^26,27. Tuttavia, la pressione di uscita non modello la funzione Friedlander come la durata di un impulso di pressione idrostatica era molto più lungo nell'aria blast sovrapressione onde¹³. La caratteristica funzione di Friedlander può essere facilmente modellata in laboratorio utilizzando una scossa tubo^1,8. Il tubo d'urto in grado di produrre onde d'urto che simulare esplosioni di campo aperto di vita reale in un ambiente di laboratorio convenzionali, pur consentendo il controllo preciso dei parametri di onda, come sovrappressione di picco, durata onda positiva e impulso, variando la diaframma materiale e spessore e il driver volume^8,28,29.

Modelli semplici in vitro come colture cellulari in genere mancano l'eterogeneità dei tipi cellulari e connettività sinaptica³⁰. Recentemente, l'effetto di scoppio su in vitro cellula cerebrale 'sferoidi' che incorporano diversi tipi di cellule è stato studiato³¹. L'indagine successiva di queste preparazioni interessanti è meritato; Tuttavia, non è chiaro come la loro organizzazione cellulare e connettività specchi cervello intatto. OHSC sono una ben consolidata in vitro sperimentale modello^23,32, sono facili da cultura e loro citoarchitettura tridimensionale del tessuto, la differenziazione cellulare e la connettività sinaptica sono ben conservati e molto simile a quello in vivo^33,34,35,36. OHSCs rappresentano un livello intermedio di complessità tra coltura cellulare e una in vivo modello^23,32. OHSCs sono stati dimostrati per riprodurre in vitro patologiche neurodegenerative cascades visto in modelli in vivo e sono stati molto utili nello screening di potenziali farmaci neuroprotettivi e nella comprensione dei loro meccanismi di azione^{17,21,22,37,38}. Infine, l'area anatomica studiata, l'ippocampo, è altamente rilevante in studi traslazionali di TBI, poiché questa regione è danneggiata frequentemente in pazienti TBI^39,40,41. OHSC sono stati utilizzati a scoppio modello TBI^28,42,43,44, tuttavia, il nostro modello è relativamente semplice e può essere adattato a shock-tubi esistenti in orizzontale o verticale configurazioni senza complessi adattamenti.

OHSC possono essere tenute in coltura per molti giorni, che facilita lo studio dei processi biologici nel corso tempo³⁴. In questo modello, la lesione del tessuto che è derivato dall'esposizione di onda d'urto è stata misurata ogni giorno per tre giorni, dopo l'esposizione di scoppio con ioduro di propidio, un indicatore ben consolidato di danno delle cellule. Ioduro di propidio è un colorante non tossico altamente polare che penetra le cellule con compromessi delle membrane cellulari, dove si lega agli acidi nucleici ed esibisce una caratteristica fluorescenza rosso brillante^24,25,45. La fluorescenza misurata con ioduro di propidio ha dimostrata di avere una buona correlazione con conta cellulare danneggiato utilizzando^46,47di colorazione di Nissl.

Dato che la lesione prodotta in questo modello era diffusa (Figura 2), la fluorescenza della fetta intera è stata misurata durante l'esecuzione dell'analisi, simile al lavoro precedentemente pubblicato in altri cervello lesioni paradigmi^21,22 , invece di utilizzare specifiche regioni, come è stato fatto in altri in vitro blast TBI modelli^28,43,44,48. L'approccio globale utilizzato nel modello descritto in questo articolo, inoltre, Elimina la variabilità potenziale che è stato introdotto quando delineare regioni di interesse definite e fornisce un quadro più completo della ferita correlate a scoppio. Sia le sovrapressioni di picco di onda d'urto, 50 kPa e 55 kPa, prodotto significativo (p < 0,05 e p < 0,0001, rispettivamente) lesioni rispetto alle fette di sham (Figura 2B). Come anticipato, l'onda d'urto con la sovrappressione di picco più alta, 55 kPa, prodotto più lesione che l'onda di 50 kPa. In un modello in vitro con cervello isolato tessuto esposto direttamente a un'onda d'urto, come scalare con precisione a tutto l'organismo o un essere umano non è semplice. Tuttavia, l'onda d'urto che abbiamo usato è all'interno della gamma di sovrapressioni di picco osservato nel campo, in genere 50-1.000 kPa^8,49.

Al fine di mantenere il OHSC esposto alla temperatura fisiologica e livelli di ossigeno e anidride carbonica, garantendo nel contempo che erano liberi da contaminazione in tutto il protocollo di esposizione di onda d'urto, gli inserti di coltura del tessuto sono stati sigillati in sterile sacchi in polietilene seguendo una tecnica asettica, sommersa in mezzo sperimentale riscaldato a 37 ° C e appena fatto gorgogliare con 95% di ossigeno e 5% anidride carbonica, analogamente al lavoro precedentemente pubblicato^{28,43,44 ,48}. Contrariamente a questi modelli dove sono stati utilizzati dispositivi complessi per tenere i sacchetti sterili durante l'esposizione di onda d'urto, in questo protocollo, un metodo semplice e veloce è stato utilizzato per sospendere gli inserti di coltura del tessuto OHSC davanti alla presa del tubo di scossa (Figura 1A, C ). Il modello descritto in questa carta consente un'elaborazione rapida e una portata elevata, riducendo al minimo il rischio di ipotermia. Questi aspetti sono particolarmente rilevanti per gli studi di neuroprotezione, dato che alcuni interventi terapeutici possono avere una finestra di tempo molto limitato potenziale applicazione dopo TBI. Questo protocollo di esposizione romanzo shock wave permette 6 a 9 coltura tissutale inserisce (in genere 36 a 54 hippocampal organotypic fettine di tessuto) per essere esposti a un'onda d'urto in un breve intervallo di tempo (circa 1 h).

Il OHSCs richiede buona asettiche. È importante utilizzare una cappa a flusso laminare asettica durante la messa in coltura e durante il trasferimento i sacchetti sterili per blast. Al fine di effettuare l'imaging fetta in condizioni asettiche con i coperchi delle piastre 6 pozzetti in luogo, utilizziamo anelli di metallo su misura per sollevare gli inserti di cultura delle cellule per il piano focale del microscopio. Una parte importante del nostro protocollo è che includiamo fette sham illeso in ogni esperimento. Sham fette sono trattati in modo identico a fette di esplosione con l'eccezione che il tubo d'urto non è licenziato; un altro passo importante è che tutte le fette sono Imaging 1h prima ferita o trattamento sham, per garantire che la salute della popolazione di fette utilizzati sono identici (Figura 2B).

Oltre a quantificare la lesione delle cellule nelle fette nel corso del tempo, il tessuto può essere fissato alla fine dell'esperimento per immunohistochemistry convenzionali⁵⁰. Abbiamo sviluppato e valutato il metodo utilizzando fette hippocampal del topo. Tuttavia, la nostra tecnica potrebbe essere facilmente adattata a utilizzare altri tessuti che possono essere coltivati in cultura, come il midollo spinale, retina, del polmone o del tessuto epiteliale. In questa carta e il nostro lavoro precedente con il modello, abbiamo studiato solo l'effetto dell'esposizione ad una singola esplosione. Tuttavia, il modello sarebbe adatto per studiare gli effetti di basso livello ripetuti scoppi il cervello o di altri tessuti. OHSCs possono essere tenute in coltura per molte settimane o addirittura mesi, consentendo effetti cronici di essere studiato.

Modelli in vitro , di essere più semplice rispetto ai modelli in vivo , hanno un throughput più elevato, sono meno costosi ed esperimenti di solito possono essere completati su un più breve tempo scala¹⁷. Tuttavia, i risultati ottenuti utilizzando modelli in vitro devono essere convalidati in modelli animali come tessuti in vitro coltivate sono conservati in un ambiente artificiale e possono rispondere a un danno in modo diverso da quello che farebbero in vivo¹⁷. Ciò nonostante, modelli in vitro sono stati estremamente utili per aumentare la nostra comprensione delle cascate di ferita di cervello e nello screening droghe neuroprotective prima l'uso di più complesse in vivo modelli^{17,22 , 51 , 52}. nonostante i numerosi vantaggi offerti da questo modello, è importante notare che in vitro modelli mancano la chiave caratteristiche di TBI presentano in animali e modelli in vivo , quali gli effetti sul sistema vascolare, aumentato intracranico pressione, risposta immunitaria sistemica e compromissione funzionale del comportamento, che evidenzia la necessità di convalidare i risultati trovati in modelli in vitro nell'animale intero. Tuttavia, in vitro modelli come il modello descritto in questa carta sono estremamente utili traduzionalmente pertinenti strumenti scientifici.

In conclusione, questo lavoro descrive un nuovo metodo semplice e diretto dove mouse organotipiche colture hippocampal sono esposti a strettamente controllate e riproducibile reali pertinenti onde d'urto utilizzando un tubo di scossa di laboratorio. La ferita globale risultante, che è stata quantificata utilizzando ioduro di propidio, un indicatore ben consolidato di danno cellulare, è molto riproducibile ed è proporzionale la sovrappressione di picco delle onde shock applicati.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geys balanced salt solution	Sigma UK	G9779
D- glucose	Sigma UK	G8270
Antibiotic/antimycotic	Sigma UK	A5955
Minimum essential medium Eagle	Sigma UK	M4655
Hanks balanced salt solution	Sigma UK	H9269
Horse serum	Sigma UK	H1138
L-glutamine	Sigma UK	G7513
HEPES	VWR Prolabo, Belgium	441476L
Sodium hydroxide	Sigma UK	S-0945
Tissue culture inserts	Millicell CM 30 mm low height Millipore	PICM ORG 50
6-well plates	NUNC, Denmark	140675
Propidium iodide	Sigma UK	P4864
Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags	Fisherbrand	01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm)	Smiths Medical Supplies	E910
Epifluorescence microscope	NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective	Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter	Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm	RS Components UK	785-0782
Pressure transducer	Dytran Instruments Inc.	2300V1
Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.	Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184
Graphing & statistics software	GraphPad Software, USA	Prism 7.0