JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتوليد نانوليبوسوميس الأيوني، الذي يستند إلى الأسلوب الجاف-الفيلم ويمكن استخدامها الآمنة وتقديم كفاءة في المختبر نسخها رسول الجيش الملكي النيبالي.

Abstract

وضع الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً)-على أساس المداواة لعلاج الأمراض المختلفة أصبح أكثر وأكثر أهمية بسبب الإيجابية خصائص في المختبر نسخها مرناً (IVT). مع المساعدة من IVT مرناً، يمكن أن يتسبب حيثياته تخليق البروتين المطلوب دون تغيير الحالة الفسيولوجية للخلية الهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن التحكم تخليق البروتين الحيوي بدقة نظراً لتأثير عابر من IVT مرناً.

تعداء كفاءة للخلايا، نانوليبوسوميس (نلبس) قد تمثل وسيلة إيصال آمنة وفعالة مرناً العلاجية. تصف هذه الدراسة وضع بروتوكول لتوليد آمنة وفعالة الموجبة نلبس تتألف من DC-الكوليسترول و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (منشطات) كوسيلة إيصال مرناً IVT. نلبس بعد من معرفة حجم، توزيعاً متجانساً، وقدرة كومبليكسيشن عالية، ويمكن أن تنتج باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم. وعلاوة على ذلك، نقدم نظم اختبار مختلفة لتحليل ما كومبليكسيشن وزيادة بلغت تعداء الاصطناعية باستخدام البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) مرناً، فضلا عن تأثيرها على بقاء الخلية. إجمالاً، ينص البروتوكول على عرض نهج فعالة وآمنة complexation مرناً، التي قد تقدم وتحسين الإدارة مرناً العلاجية.

Introduction

استخدام مرناً معدلة للتطبيقات العلاجية أظهرت إمكانات كبيرة في العامين الماضيين. في أمراض القلب والأوعية الدموية، والالتهابات، ومونوجينيتيك، وكذلك في تطوير اللقاحات، مرناً هو وكيل علاجية واعدة1.

العلاج استبدال البروتين مع مرناً يوفر العديد من المزايا على مدى العلاج الجيني الكلاسيكية، التي تستند إلى تعداء الحمض النووي في الخلايا الهدف2. يبدأ الدالة مرناً في مباشرة سيتوسول. على الرغم من أن بلازميد الحمض النووي (بدنا)، بنية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل، والتعميم الحمض النووي الذي يحتوي على منطقة مروج وتسلسل جينات ترميز البروتين العلاجي3، أيضا من أعمال في سيتوسول، يمكن فقط إدراجها في الخلايا التي تسير من خلال الانقسام في وقت تعداء. وهذا يقلل عدد transfected الخلايا في الأنسجة1،4. على وجه التحديد، هو تعداء للأنسجة مع النشاط الانقسام ضعيفة، مثل خلايا القلب، صعوبة5. على النقيض من بدنا، تحدث تعداء وترجمة مرناً في الخلايا الانقسامية وغير الانقسامية في1،الأنسجة6. قد يأتي اندماج الحمض النووي الفيروسي في جينوم المضيف مع تأثيرات مطفرة أو ردود فعل المناعة7،8، ولكن بعد تعداء الخلايا التي تحتوي على ترميز البروتين مرناً، نوفو دي تخليق البروتين المطلوب يبدأ مستقلة9،10. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل تخليق البروتين تحديداً إلى الحاجة للمريض عن طريق الجرعات الفردية، دون التدخل في الجينوم والمخاطرة بتأثيرات مطفرة11. يمكن خفض إمكانات تنشيط المناعة مرناً ولدت صناعيا هائلا باستخدام أردين الزائفة و 5 '-ميثيلسيتيديني بدلاً من أردين وسيتيديني12. أردين الزائفة كما تبين مرناً معدلة زيادة استقرار البيولوجي وأعلى بكثير قدرات متعدية الجنسيات13.

لتكون قادرة على الاستفادة من خصائص الواعدة للعلاج على أساس مرناً في التطبيقات السريرية، من الضروري إنشاء أداة مناسبة لنقل مرناً في الخلية. يجب أن تحمل خصائص غير سامة في المختبر و في فيفوهذه المركبات وحماية مرناً ضد تدهور نوكلاس وتوفر امتصاص الخلوية كافية لتوافر المطول والترجمة مرناً14.

من بين جميع أنواع الناقل المحتملة في فيفو تسليم المخدرات، مثل الأنابيب النانوية الكربونية، ونقاط الكم، والدهنية، هذا الأخير قد تم درس أكثر من15،16. الدهنية حويصلات تتألف من بلير الدهن10. وهم أمفيفيليك مع مسعور ومقطع ماء، ومن خلال هذا الترتيب الذاتي لهذه الجزيئات، طبقة مزدوجة كروية شكلت17. داخل الدهنية، العوامل العلاجية أو المخدرات يمكن تغليف و، وبالتالي، محمية من تدهور الانزيمية18. الدهنية التي تحتوي على N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium كلوريد (دوتما)19، [1، 2-مكررا (أوليويلوكسي)-3-البروبان (تريميثيلامونيو)] (دوتاب)20، و21من ديوكتاديسيلاميدوجليسيلسبيرميني (الكلاب)، أو الكولسترول DC-22، تتميز جيدا وكثيراً ما تستخدم تعداء الخلوية مع الحمض النووي الريبي أو.

وتتألف الدهنية الموجبة دهن مشحونة بشكل إيجابي ودون توجيه تهمة إليه فسفوليبيد23. تعداء عبر الدهنية الموجبة واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لنقل الأحماض النووية في الخلايا24،25. تشكل جزيئات الدهن الموجبة المجمعات مع مجموعات الفوسفات مشحونة سلبا في العمود الفقري ل جزيئات الحمض النووي26. هذه ليبوبليكسيس ما يسمى نعلق على سطح غشاء الخلية وإدخال الخلية عن طريق الالتقام أو الالتقام-مثل-آليات27.

في عام 1989، مالون وآخرون. ووصف بنجاح الموجبة الدهون بوساطة مرناً تعداء28. ومع ذلك، باستخدام خليط من دوتما و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (المخدر)، وجد الفريق أن دوتما تتجلى الآثار السامة للخلايا28. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت زهرة et al. أن دوتاب (1، 2-ديوليويلوكسي-3-تريميثيلامونيوم-البروبان كلوريد) يمكن أن تستخدم ككاشف تعداء مرناً29. ومع ذلك، تعداء كفاءة للخلايا، ينبغي استخدام دوتاب في تركيبة مع الكواشف الأخرى، مثل فيبرونيكتين29 أو30من المخدر. وحتى الآن، كان دوتما الدهون الموجبة الأولى في السوق المستخدمة ل توصيل الجينات31. الدهون الأخرى تستخدم كناقلات العلاجية أو يجري اختبارها في مراحل مختلفة من التجارب السريرية، (مثلاً، اندوتاج-الأول، الذي يحتوي على دوتاب كناقل دهن)، ويجري التحقيق حاليا في مرحلة الثانية لمحاكمة سريرية32.

يصف هذا العمل وضع بروتوكول لتوليد نلبس المحتوية على DC-الكوليسترول ومخدر. من السهل القيام بهذا الأسلوب ويسمح لتوليد نلبس ذات أحجام مختلفة. الهدف العام لتوليد البرمجة اللغوية العصبية باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم إنشاء الدهنية ل complexation مرناً، مما يتيح تعداء خلية فعالة ومتوافق حيويا في المختبر14،33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-جيل نانوليبوسوميس الأيوني (الشكل 1)

  1. تذوب الدهون DC-الكوليسترول في الدم (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-كاربامويل] الكوليسترول هيدروكلوريد) ومنشطات (ديوليويل فوسفاتيديليثانولاميني)، تسليم كمسحوق، في كلوروفورم لتحقيق تركيز نهائي 25 ملغ/مل.
    ملاحظة: تخزين الدهون المذابة في-20 درجة مئوية.
  2. العمل مع حل الأسهم 25 ملغ/مل من الدهون على حد سواء. 40 مزيج ميليلتر المذاب DC-الكوليسترول وميليلتر 80 من المخدر المذابة في قارورة زجاج.
    ملاحظة: كمية الدهون الإجمالية 3 ملغ. لتجنب التبخر السريع كلوروفورم، ضع الدهون على الجليد خلال بيبيتينج.
  3. تبخير كلوروفورم لمدة 15 دقيقة تحت تدفق غاز أرجون. في وقت لاحق، ملء مجفف مع هلام السليكا، ضع قارورة زجاجية مفتوحة داخل، وتطبيق فراغ بين عشية وضحاها للتأكد من أن يتبخر كلوروفورم المتبقية، ويتم تشكيل فيلم دهن داخل قارورة زجاجية.
    ملاحظة: العمل بسرعة، وتجنب الاتصال2 س لا لزوم لها.
  4. ترطيب الفيلم شكلت المادة الدهنية مع 1 مل من المياه خالية من نوكلاس ودوامه تعليق لمدة 15 دقيقة (الشكل 2A). بعد ذلك، ضع التعليق في حمام سونيكيشن ح 1 (الشكل 2).
    ملاحظة: سيتم التعليق غائم قليلاً.
  5. تجميع الطارد ميني وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وملء المحاقن مع تعليق المادة الدهنية ومكان المحاقن شغلها وحقنه فارغة على كلا الجانبين الطارد. اضغط على تعليق المادة الدهنية عبر الغشاء من حقنه واحدة إلى أخرى، 20 x-x 25، لقذف التعليق (الشكل 2).
    ملاحظة: يتم تحديد الحجم نلبس من الغشاء الذي يستخدم حجم المسام.
  6. تخزين نلبس في قارورة زجاج في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: بعد التخزين فترات طويلة من الزمن، نلبس توضع في حمام سونيكاتيون مرة أخرى لمدة 15 دقيقة قبل 35 كيلو هرتز إلى الالتفاف حول تشكيل معقدة.

2-النسخ في المختبر مرناً الاصطناعية

  1. إعداد اجفب-ترميز نشرت مرناً بعد البروتوكول السابق34.
  2. تضخيم تسلسل اجفب من بلازميد مع 0.7 ميكرومتر قدما (5 '--وافق به GAC CCT CGT هيئة مكافحة الفساد جا بنا صرفة ACG-3') وعكس (5 'تي120 "ضريبة تحويل العملة"ضريبة تحويل العملة قانون كاج بنا نقل واكتساب التكنولوجيا عقاري AAA GAC CA-3') الإشعال وبوليميريز طقم مع بكر.
    1. مزيج 20 ميليلتر الحل التجاري العازلة مما يؤدي إلى تغيير في سلوك ذوبان الحمض النووي (جدول المواد)، فضلا عن 20 ميليلتر من مزيج 5 x من مجموعة بوليميراز. إضافة 7 ميليلتر من كل التمهيدي (الأمامية والعكسية).
    2. إضافة 25 نانوغرام بلازميد اجفب إلى الخليط و 2 ميليلتر من بوليميريز من مجموعة بوليميراز.
      ملاحظة: الاحتفاظ بوليميراز على الجليد قبل بيبيتينج أنه في حل.
    3. إضافة خالية نوكلاس ح2س إلى الخليط، تصل إلى حجم 100 ميليلتر.
    4. تشغيل دورات PCR في ثيرموسيكلير بعد على البروتوكول في الجدول 1.
  3. تنقية تسلسل الحمض النووي اجفب-ترميز مع مجموعة أدوات تنقية PCR.
    1. ولذلك، مزيج PCR الحل مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم من الطقم واستخدامها لملء الأعمدة تنقية.
    2. الطرد المركزي الأعمدة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة وتجاهل في فيلتراتي.
    3. إضافة 750 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي الأول للعمود، مرة أخرى في الحد الأقصى للطرد المركزي بسرعة لمدة 1 دقيقة، وتجاهل filtrate.
    4. كرر الخطوة الطرد المركزي 1 x لإزالة المخزن المؤقت من عامل تصفية العمود.
    5. نقل العمود إلى أنبوب 1.5 مل طازجة.
    6. إضافة 20 ميليلتر من خالية نوكلاس ح2س إلى العمود واحتضان 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة. كرر هذه الخطوة.
    7. قياس تركيز الحمض النووي مع شحني وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    8. إجراء تحليلات نوعية الحمض النووي استخدام هلام التفريد. إضافة 0.5 غرام من [اغروس] في المخزن المؤقت تريس-بورات-يدتا (TBE) وتسخَّن في الميكروويف على حرارة عالية حتى يذوب تماما [اغروس].
    9. إضافة 5 ميليلتر لتلطيخ جل الحل للسائل [اغروس] وملء الحل إلى غرفة جل وانتظر حتى يتم بلمرة الهلام.
    10. ميكس 200 نانوغرام من الحمض النووي مع 2 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ والتعبئة أنها تصل إلى وحدة تخزين نهاية من 12 ميليلتر. "الماصة؛" سلم الحمض النووي، فضلا عن عينات الحمض النووي، في جل الآبار وتشغيل التفريد ح 1 في 100 V.
    11. تحليل هلام استخدام محطة تحليل جل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  4. تشغيل النسخ في المختبر لتوليد مرناً من تسلسل الحمض النووي مع مجموعة في المختبر نسخ مواد تتضمن T7-بوليميريز واستبدال النيوكليوتيدات معدلة UTP والأداء النظري المركب مع Ψ UTP و CTP الميثيل.
    1. للنسخ في المختبر ، مزيج من المكونات التالية في الجدول 2.
      ملاحظة: استبدال 1.5 ميليلتر من الميثيل-CTP مع 01:10 Cy3-CTP المخفف في خالية من نوكلياسي ح2س أثناء النسخ في المختبر من اجفب مرناً لتحقيق وضع العلامات Cy3 من مرناً.
    2. احتضان هذا المزيج IVT رد فعل ح 4 في 37 درجة مئوية.
    3. أضف 1 ميليلتر من الدناز أنا من بوليميريز T7 كيت واحتضان عليه لمدة 15 دقيقة قبل 37 درجة مئوية لهضم الدنا القالب.
  5. لتنقية مرناً، استخدم مجموعة أدوات تنظيف الجيش الملكي النيبالي.
    1. تملأ مزيج IVT لحجم 100 ميليلتر مع خالية نوكلاس ح2o.
    2. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    3. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 100% ويخلط مرة أخرى. "الماصة؛" هذا المزيج في أعمدة تنظيف.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق مبلغ 000 8 × ز وتجاهل فيلتراتي.
    5. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسيل إلى عمود، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 ثانية بواقع 000 8 × ز، وإزالة فيلتراتي.
    6. أغسل العمود 1 x مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في س 8,000 ز.
    7. نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل رد. الوت مرناً 2 x بحضانة 1-دقيقة 20 ميليلتر من ح نوكلاس خالية2س على الغشاء العمود، متبوعاً الطرد المركزي 1-دقيقة بأقصى سرعة ممكنة.
  6. قم بإزالة مجموعات الفوسفات من مرناً باستخدام مجموعة ديفوسفوريليشن. إضافة ميليلتر 4.5 x 10 الفوسفاتيز المخزن المؤقت و 1 ميليلتر من الفوسفاتيز إلى مرناً واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
  7. تنقية مرناً مرة أخرى، في أعقاب الخطوات 2.5.1-2.5.7.
  8. قياس التوافق مرناً مع شحني.
  9. استخدم جل التفريد لتحليل النقاء وحجم مرناً. ولذلك، تعد [اغروس] هلام كما هو موضح في الخطوات 2.3.9-2.3.10.
    1. ميليلتر 3.3 مزيج من ميثلامين، 1 ميليلتر من 37% فورمالدهيد، 1 ميليلتر من 10 x الرجال، و 1.7 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ مع 200 نانوغرام مرناً وملء ما يصل إلى 10 ميليلتر مع خالية نوكلاس ح2س لكل عينة وعلامة الجيش الملكي النيبالي.
    2. احتضان هذا المزيج لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية تمسخ مرناً. تحميل الآبار جل مع مرناً وعلامة الجيش الملكي النيبالي وتشغيل الهلام ح 1 في 100 V.
    3. تحليل الجل باستخدام محطة دوك هلام مع الأشعة فوق البنفسجية.

3-كومبليكسيشن مرناً الاصطناعية

  1. ذوبان الجليد مرناً الاصطناعية على الجليد، ودوامه، وقبل وقت قصير من افتتاح الأنبوب للطرد المركزي.
  2. ميكس 10 ميليلتر من مرناً الاصطناعية (تركيز مرناً 100 نانوغرام/ميليلتر) مع 1 ميليلتر أو ميليلتر 2.5، 5 ميليلتر، ميليلتر 10 أو 20 ميليلتر من تعليق البرمجة اللغوية العصبية (تركيز البرمجة اللغوية العصبية 3 مغ/مل). الطرد المركزي بإيجاز واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتشكيل نانوليبوبليكس.
    ملاحظة: لا تخلط بيبيتينج. وهذا يمكن أن يؤدي إلى فقدان وحدة التخزين. دوامة قريبا لخلط دقيق.
  3. أضف 1 مل من الخلية العادية المتوسطة إلى نانوليبوبليكسيس ومزجها بيبيتينج صعودا وهبوطاً.

4-تحليل كفاءة تغليف نانوليبوسوميس

  1. للقيام بتجارب التغليف، استخدام أدوات القياس الكمي الجيش الملكي النيبالي.
  2. إعداد الحل العامل بتمييع صبغة فلورسنت 1: 200 لمجموعة السامي، و 1:2,000 مقايسة منخفضة-مجموعة.
    ملاحظة: ذوبان الجليد صبغة الفلورسنت على الجليد. إعداد الحل العامل مباشرة قبل الاستخدام.
  3. إعداد المنحنيات القياسية مجموعة عالية ومنخفضة-نطاق استخدام 1 مل حل الأسهم 2 ميكروغرام/مل من اجفب مرناً في خالية نوكلاس ح2o.
    ملاحظة: للمنحنيات القياسية، استخدم مرناً التي سيتم استخدامها في التجارب التغليف.
  4. استخدام الجدول 3 لإعداد مجموعة عالية المعيار (20 نانوغرام/ملليلتر-1 ميكروغرام/مل).
  5. للمعيار النطاق المنخفض، وتمييع اجفب 2 ميكروغرام/مل مرناً حل الأسهم 01:20 لتحقيق تركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر. إعداد معيار النطاق منخفض (1 نانوغرام/ملليلتر-50 نانوغرام/مل) كما هو موضح في الجدول 4.
  6. الجمع بين 1 ميكروغرام من اجفب مرناً (10 ميليلتر) و 7.5 ميكروغرام نلبس (2.5 ميليلتر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: يبقى مرناً على الجليد لتجنب تدهور.
  7. إضافة 1 مل من خالية نوكلاس ح2س بشكل نانوليبوبليكسيس ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  8. أضف 1 مل من محلول العامل 1: 200 أو 1:2,000 صبغة الفلورسنت على الحمض النووي الريبي لعينات مغلفة والمعايير، واحتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
  9. "الماصة؛" المعايير وعينات في التكرارات في لوحة سوداء 96-جيدا وقياس fluorescence في 530 نانومتر على قارئ ميكروسكوبية (الشكل 3).

5-إعداد الخلايا تعداء

  1. لوحة 1.5 × 105 من لوحة كذلك 12 د 1 قبل تعداء A549 الخلايا/جيدا.
  2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في الخلية العادية المتوسطة (الجلوكوز دميم/عالية مع 10% الجنيني البقري المصل [FBS]، 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين) عن 24 ساعة قبل تعداء.

6-تعداء الخلايا

  1. أغسل الذي أعد الخلايا س 1 مع 1 مل/بئر PBS (دون Ca2 +/Mg2 +).
  2. أضف 1 مل خليط نانوليبوبليكس المعدة، يحتوي على 1 ميكروغرام من اجفب مرناً مغلفة في 1 ميليلتر أو ميليلتر 2.5 أو 5 ميليلتر، 10 ميليلتر أو نلبس 20-ميليلتر، إلى بئر واحدة للوحة المعدة مع خلايا A549.
  3. إضافة تعليق نانوليبوبليكس للخلايا واحتضان في الظروف العادية ح 24 لتحليل فعالية تعداء، أو ح 24 و 72 ح لتحليل جدوى الخلية بعد تعداء.
    ملاحظة: تعداء مع نلبس لا تتطلب تغييرا في متوسط.

7-تحليل كفاءة تعداء الخلايا استخدام التدفق الخلوي والفحص المجهري Fluorescence

  1. إزالة المادة طافية وتغسل الخلايا مع 1 مل/وأيضا برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +) لإزالة نلبس المتبقية.
  2. إعداد الخلايا للتدفق الخلوي.
    1. تريبسينيزي الخلايا مع 500 ميليلتر/بئر التربسين/يدتا (0.05%) عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 توقف العملية وإلغاء تنشيط التربسين بإضافة نفس المبلغ (500 ميليلتر في البئر) المتوسطة العادية المحتوية على FBS.
    2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 400 x ز وإزالة المادة طافية بعناية دون لمس بيليه الخلية.
    3. تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +).
    4. ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من 1 x تثبيت الحل ونقل الخلايا في أنابيب التدفق الخلوي.
    5. تحليل الخلايا في 488 نانومتر في تدفق سيتوميتير (الشكل 4 أ).
      ملاحظة: دوامة الخلايا 1 x مباشرة قبل القياس.
  3. إعداد الخلايا للفحص المجهري الأسفار.
    1. إصلاح الخلايا مع 1 مل/بئر 100 ٪ الميثانول، التي تم تخزينها مسبقاً في-20 درجة مئوية.
    2. إضافة 500 ميليلتر/بئر 300 نانومتر DAPI (4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) حله في برنامج تلفزيوني (دون Ca2 +/Mg2 +) واحتضانها لمدة 5 دقائق في الظلام.
    3. إزالة الحل DAPI وتغسل الخلايا مرة أخرى مع 100 ٪ الميثانول المخزنة في-20 درجة مئوية.
    4. تحليل الخلايا باستخدام مجهر الأسفار (الشكل 4 باء).
      ملاحظة: استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات التالية: اجفب 488/509 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط DAPI 358/461 Cy3 550/570 نانومتر.

8-خلية جدوى الفحص

  1. تذوب 5 ملغ MTT (بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) في 1 مل ربمي (دون الأحمر الفينول).
    ملاحظة: MTT حله يجب أن يكون كذلك المخفف 01:10 (التركيز النهائي: 0.5 ملغ/مل) في ربمي قبل الاستخدام.
  2. أغسل transfected الخلايا 3 x مع 1 مل/بئر PBS (دون Ca2 +/Mg2).
    ملاحظة: ما تبقى المتوسطة الخلية العادية ينبغي أن تكون إزالتها بالكامل.
  3. إضافة من 01:10 500 ميليلتر/جيدا تضعف حل MTT للخلايا واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية.
  4. إزالة الحل MTT من الخلايا بعد الاحتضان وإضافة 500 ميليلتر/بئر [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد). احتضان مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  5. "الماصة؛" الحل [دمس] في ثلاثة توائم في لوحة 96-جيدا واضحة لأسفل وقياس الامتزاز في 540 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
  6. تعيين بقاء الخلية غير المعالجة على 100% وحساب صلاحية خلية من المجموعات الأخرى بالمقارنة مع الخلايا التحكم غير المعالجة (الشكل 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدام البروتوكول كما هو موضح، أعدت نلبس تتألف من الدهون DC-الكوليسترول ومخدر باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم (الشكل 1). أثناء الإعداد، يظهر الحل نانوليبوسومي مراحل مختلفة في تعكر (الشكل 2).

يمكن ثم تحليل فعالي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويصف البروتوكول قدم توليد نلبس مع تغليف عالية الفعالية مرناً معدلة صناعيا، وكذلك تعداء موثوقة من الخلايا في المختبر. وعلاوة على ذلك، نلبس كفالة الإفراج عن مرناً، الذي بدوره يترجم إلى بروتين وظيفية داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ترانسفيكشنز استخدام نلبس يمكن أن يؤديها في الخلية الع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

لا شيء

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

References

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144 DC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved