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Resumen

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Resumen

El desarrollo de RNA mensajero (mRNA)-base terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades, se convierte cada vez más importante debido a la positiva propiedades de in vitro transcripción mRNA (IVT). Con la ayuda de mRNA IVT, puede inducirse la síntesis de novo de una proteína deseada sin necesidad de cambiar el estado fisiológico de la célula diana. Por otra parte, biosíntesis de la proteína pueden ser precisamente controlada debido al efecto transitorio del mRNA IVT.

Para la transfección eficiente de células, nanoliposomas (NLps) pueden representar un vehículo de entrega segura y eficiente para el mRNA terapéutico. Este estudio describe un protocolo para generar seguro y eficiente catiónico NLps compuesto de colesterol DC y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como un vector de la entrega para IVT mRNA. NLps tener definido el tamaño, una distribución homogénea y una capacidad de complejación alta y puede ser producidos utilizando el método de película seca. Por otra parte, presentamos sistemas de prueba diferentes para analizar la complejación y eficacias de transfección con sintético mejorado proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, así como su efecto en la viabilidad celular. En general, el protocolo presentado proporciona un acercamiento eficaz y seguro para la complejación de mRNA, que puede avanzar y mejorar la administración de terapéutica mRNA.

Introducción

El uso de ARNm modificado para aplicaciones terapéuticas ha mostrado gran potencial en los últimos años. En enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y monogenéticos, así como en el desarrollo de vacunas, el mRNA es un prometedor agente terapéutico1.

Terapia de reemplazo de la proteína con el mRNA ofrece varias ventajas sobre la terapia del gene clásico, basado en la transfección de la DNA en las células de destino2. La función de mRNA se inicia directamente en el citosol. Aunque el plásmido ADN (pDNA), una construcción de doble cadena, circular ADN que contiene una región promotora y una secuencia del gen que codifican la proteína terapéutica3, también actúa en el citosol, puede sólo ser incorporado en células que van a través de la mitosis en el momento de la transfección. Esto reduce el número de células transfected en el tejido1,4. Específicamente, la transfección de los tejidos con actividad de mitosis débiles, tales como células cardíacas, es difícil5. En contraste con pDNA, la transfección y traducción de mRNA ocurren en las células mitotic y no mitótica del tejido1,6. La integración viral de la DNA en el genoma del anfitrión puede venir con efectos mutagénicos o reacciones inmunes7,8, pero después de la transfección de células con una codificación de la proteína ARNm, la síntesis de novo de la proteína deseada inicia autónomamente9,10. Por otra parte, la síntesis de proteínas puede ajustarse precisamente a la necesidad del paciente a través de dosis individuales, sin interferir en el genoma y correr el riesgo de efectos mutagénicos11. El potencial de activación inmune de mRNA sintético generado podría reducirse drásticamente mediante pseudo uridina y 5'-methylcytidine en lugar de uridina y citidina12. Pseudo uridina mRNA modificada también se ha demostrado tener una mayor estabilidad biológica y una significativamente mayor capacidad traslacional13.

Para poder beneficiarse de las prometedoras propiedades de tratamiento basado en el mRNA en aplicaciones clínicas, es esencial para crear un vehículo adecuado para el transporte de ARNm en la célula. Este vehículo debe tener propiedades no tóxico en vitro e in vivo, proteger el mRNA contra degradación nucleasas y proporcionar suficiente absorción celular para una prolongada disponibilidad y traducción de los mRNA de14.

Entre todos los tipos de portador posible para en vivo entrega de la droga, tales como nanotubos de carbono puntos cuánticos y liposomas, estos últimos han sido estudiados más de15,16. Liposomas son vesículas que consiste en una bicapa de lípidos10. Son anfifílicas con una hidrofóbica y una hidrofílica sección, y a través de la propia disposición de estas moléculas, una doble capa esférica es formado17. Dentro de los liposomas, agentes terapéuticos o medicamentos pueden ser encapsulados y, así, protegidos de la degradación enzimática18. Liposomas que contienen N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20y21de dioctadecylamidoglycylspermine (perros), o DC-colesterol22, están bien caracterizadas y utilizado con frecuencia para transfección celular con ADN o ARN.

Liposomas catiónicos comprenden un lípido positivamente cargado y un fosfolípido23. Través de catiónicos liposomas de transfección es uno de los métodos más comunes para el transporte de los ácidos nucleicos en células24,25. Las partículas de lípidos catiónicos forman complejos con los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico26. Estos supuestos lipoplexes fije a la superficie de la membrana celular y entrar en la célula mediante endocitosis o mecanismos de endocitosis como27.

En 1989, Malone et al. con éxito se describe catiónico mediada por lípidos mRNA transfección28. Sin embargo, usando una mezcla de DOTMA y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), el grupo encontró que DOTMA manifiesta efectos citotóxicos28. Además, Zohra et al demostró que DOTAP (cloruro de 1, 2-dioleoyloxy-3-trimetilamonio-propano) puede utilizarse como un mRNA de la transfección reactivos29. Sin embargo, para la transfección eficiente de células, DOTAP debe utilizarse en combinación con otros reactivos, tales como fibronectina29 o30de la droga. Hasta ahora, DOTMA era el lípido catiónico primero en el mercado para el gen entrega31. Otros lípidos son utilizados como portadores de la terapéuticos o se están probando en diferentes etapas de ensayos clínicos (p. ej., EndoTAG-I, que contiene DOTAP como portador lípido), actualmente está siendo investigada en un ensayo clínico de fase II32.

Este trabajo describe un protocolo para la generación de NLps que contiene colesterol DC y la droga. Este método es fácil de realizar y permite la generación de NLps de diferentes tamaños. El objetivo general de generación de PNL mediante el método de película seca es crear liposomas para la complejación de mRNA, así permitiendo la transfección eficiente y biocompatibles de la célula en vitro14,33.

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Protocolo

1. generación de nanoliposomas catiónico (figura 1)

  1. Disolver los lípidos colesterol DC (3β-[-(N′,N′-dimethylaminoethane) de N-Carbamoil] colesterol clorhidrato) y DOPE (dioleoyl fosfatidiletanolamina), entregado en forma de polvo, en cloroformo para obtener una concentración final de 25 mg/mL.
    Nota: Almacenar los lípidos disueltos a-20 ° C.
  2. Trabajar con 25 mg/mL de solución stock de ambos lípidos. Mix 40 μl de la DC-colesterol disuelto y 80 μl de la droga disuelta en un frasco de vidrio.
    Nota: La cantidad total de lípidos es de 3 mg. Para evitar la evaporación rápida del cloroformo, coloque los lípidos en hielo durante el pipeteo.
  3. Evaporar el cloroformo durante 15 min bajo un flujo de gas argón. Posteriormente, llene un desecador con gel de silicona, coloque el frasco de cristal abierto dentro y aplicar un vacío durante la noche para asegurarse de que se evapora el cloroformo restante, y una película lipídica está formada dentro del frasco de vidrio.
    Nota: Trabajo rápido y evitar el contacto innecesario de2 O.
  4. Rehidratar la película lipídica formada con 1 mL de agua libre de nucleasas y agitar la suspensión durante 15 min (figura 2A). Después, coloque la suspensión en un baño de sonicación durante 1 hora (figura 2B).
    Nota: La suspensión estará ligeramente nublada.
  5. Montar el mini extrusora según las instrucciones del fabricante, llene una jeringa con la suspensión de lípidos y coloque la jeringa llena y una jeringuilla vacía en ambos lados de la extrusora. Presione la suspensión lipídica a través de la membrana de una jeringa a la otra, 20 x, 25 x, para sacar la suspensión (figura 2).
    Nota: El tamaño de la NLps es determinado por el tamaño de los poros de la membrana utilizada.
  6. Almacenar el NLps en un frasco de vidrio a 4 ° C hasta su uso posterior.
    Nota: Después de tiempo de almacenamiento prolongado, la NLps debe colocarse en el baño de sonicación nuevamente durante 15 minutos por 35 kHz para evitar la formación de complejos.

2. in Vitro de la transcripción de mRNA sintético

  1. Preparar la codificación eGFP ARNm siguiendo el protocolo publicado anterior34.
  2. Amplificar la secuencia de eGFP desde el plásmido con el μm 0.7 del forward (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') y reversa (5'-T120 CTT CTT ley CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') kit de cartillas y la polimerasa con PCR.
    1. Mezclar 20 μl de solución amortiguadora comercial que cambia el comportamiento de fusión del DNA (Tabla de materiales), así como de 20 μl de la mezcla 5 x desde el kit de la polimerasa. Añadir 7 μl de cada cebador (adelante y atrás).
    2. Agregue 25 ng de plásmido eGFP a la mezcla y 2 μl de polimerasa del kit de la polimerasa.
      Nota: Mantenga la polimerasa en el hielo antes de pipetear la solución.
    3. Añadir libre de nucleasa H2O a la mezcla, hasta un volumen de 100 μl.
    4. Ejecute los ciclos PCR en termociclador siguiendo el protocolo en la tabla 1.
  3. Purificar la secuencia de ADN de codificación eGFP con el kit de purificación de la polimerización en cadena.
    1. Por lo tanto, mezclar la solución PCR con 500 μl de tampón de unión del kit y utilizarlo para rellenar columnas de purificación.
    2. Centrifugue las columnas a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.
    3. Añadir 750 μl de tampón de lavado I de la columna, centrifugar nuevamente a la máxima velocidad durante 1 min y descartar el filtrado.
    4. Repita el paso de centrífuga 1 x para quitar el tampón desde el filtro de la columna.
    5. Transfiera la columna a un tubo de 1,5 mL fresco.
    6. Añadir 20 μl de H libre de nucleasa2O a la columna, incubar durante 1 minuto y centrifugar durante 1 min a velocidad máxima. Repita este paso.
    7. Medir la concentración de la DNA con un fotómetro y almacenar a-20 ° C.
    8. Realizar los análisis de calidad de ADN mediante electroforesis en gel. Añadir 0,5 g de agarosa en buffer borato-Tris-EDTA (TBE) y calentarlo en el microondas a fuego alto hasta que la agarosa se disuelva completamente.
    9. Añadir 5 μl de solución de tinción de gel de la agarosa líquida, llenar la solución en la cámara de gel y esperar hasta que el gel se polimeriza.
    10. Mezcla 200 ng de ADN con 2 μl de 6 x tinte y llenar hasta un volumen final de 12 μl. Pipetear una escalera de ADN, así como la muestra de ADN en los pocillos del gel y correr la electroforesis durante 1 h a 100 V de carga.
    11. Analizar el gel utilizando una estación de análisis de gel bajo luz UV.
  4. Ejecutar la transcripción en vitro para generar ARNm de la secuencia de ADN con un kit de transcripción en vitro contiene polimerasa T7 y sustituir los nucleótidos modificados de UTP y CTP con Ψ-UTP y CTP de metilo.
    1. Para la transcripción en vitro , mezclar los ingredientes siguiendo la tabla 2.
      Nota: Reemplazar 1.5 μl de metil-CTP con 1:10 Cy3-CTP diluida en libre de nucleasa H2O durante la transcripción en vitro de eGFP mRNA para lograr Cy3-etiquetado del mRNA.
    2. Incubar la mezcla de reacción de IVT de 4 h a 37 ° C.
    3. Añadir 1 μl de DNasa I de la polimerasa T7 kit e incubar durante 15 min por 37 ° C para digerir la plantilla de la DNA.
  5. Para purificar el mRNA, utilice el kit de limpieza de RNA.
    1. Llenar la mezcla IVT al volumen de 100 μl con libre de nucleasa H2O.
    2. Añadir 350 μl de tampón de lisis y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
    3. Añadir 250 μl de etanol al 100% y mezclar otra vez. Pipetear la mezcla en las columnas de limpieza.
    4. Centrifugar durante 15 s en 8.000 x g y descartar el filtrado.
    5. Añadir 500 μl del buffer de lavado en una columna, centrifugar nuevamente por 15 s en 8.000 x gy eliminar el filtrado.
    6. Lavar la columna 1 x con 500 μl de tampón de lavado y centrifugar durante 2 min a 8.000 x g.
    7. Mover la columna en un tubo de reacción de 1,5 mL fresco. Procederá a la elución del mRNA 2 x por una incubación de 1-min de 20 μl de H libre de nucleasa2O en la membrana de la columna, seguido de una centrifugación de 1 min a velocidad máxima.
  6. Retire los grupos fosfato de los mRNA usando un kit de desfosforilación. Agregar 4.5 μl de tampón de fosfatasa de x 10 y 1 μl de la fosfatasa en el mRNA e incubar durante 1 h a 37 ° C.
  7. Purificar el ARNm una vez más, siguiendo los pasos 2.5.1 - 2.5.7.
  8. Medir la concertación de mRNA con un fotómetro.
  9. Utilizar gel de electroforesis para analizar la pureza y el tamaño del mRNA. Por lo tanto, preparar un gel de agarosa como se describe en pasos 2.3.9 - 2.3.10.
    1. 3.3 mezcla μl de formamida, 1 μl de formaldehído al 37%, 1 μl de 10 x hombres y 1,7 μl de 6 x carga tinta 200 ng de mRNA y llénela hasta 10 μl de H libre de nucleasa2O para cada muestra y marcador de RNA.
    2. Incubar la mezcla por 10 min a 65 ° C para la desnaturalización del mRNA. Los pozos del gel con el mRNA y RNA marcador de cargar y ejecutar el gel durante 1 h a 100 V.
    3. Analizar el gel utilizando una estación de doc de gel con luz UV.

3. complejación del mRNA sintético

  1. Descongelar el mRNA sintético en hielo, vortex y centrifugar poco antes de abrir el tubo.
  2. Mezclar 10 μl de mRNA sintético (concentración de mRNA es 100 ng/μL) con 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl y 20 μl de la suspensión de PNL (NLp concentración es 3 mg/mL). Centrifugar brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente (RT) para la formación de nanolipoplex.
    Nota: No mezclar mediante pipeteo. Esto puede conducir a la pérdida de volumen. Vórtice poco para una mezcla completa.
  3. Añadir 1 mL de medio celular regular a los nanolipoplexes y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.

4. Análisis de la eficiencia de encapsulación de nanoliposomas

  1. Para realizar los experimentos de encapsulación, utilice el kit de cuantificación de RNA.
  2. Preparar la solución de trabajo diluyendo el colorante fluorescente 1: 200 para una gama alta y 1:2,000 para un ensayo de gama baja.
    Nota: Descongelar el tinte fluorescente en el hielo. Preparar la solución de trabajo directamente antes de su uso.
  3. Preparar las curvas estándar de gama alta y gama baja con 1 mL de una solución stock de 2 μg/mL de eGFP mRNA en libre de nucleasa H2O.
    Nota: Para las curvas estándar, utilice el mRNA que se utilizarán en los experimentos de encapsulación.
  4. Utilice la tabla 3 para la preparación del estándar de gama alta (20 ng/mL - 1 μg/mL).
  5. Para el estándar de gama baja, diluir la eGFP de 2 μg/mL mRNA solución madre 1:20 para lograr una concentración final de 100 ng/mL. Preparar un estándar de gama baja (1 ng/mL - 50 ng/mL) como se describe en la tabla 4.
  6. Combinar 1 μg de eGFP mRNA (10 μl) y 7,5 μg de NLps (2,5 μl) e incubar por 20 min a TA.
    Nota: Mantenga el mRNA en el hielo para evitar la degradación.
  7. Añadir 1 mL de H libre de nucleasa2O nanolipoplexes forma y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
  8. Añadir 1 mL de solución de trabajo de colorante fluorescente de RNA de 1: 200 o 1:2,000 a los estándares y las muestras encapsuladas e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  9. Pipetear los estándares y las muestras por duplicado en una placa de 96 pocillos negra y medir la fluorescencia a 530 nm en un lector de microplacas (figura 3).

5. preparación de las células para transfección

  1. Placa 1.5 x 105 células A549/pozo de una placa de 12 pozos 1 d antes de transfección.
  2. Incube las células a 37 ° C y 5% de CO2 en medio regular de la célula (glucosa alta DMEM con 10% suero fetal bovino [SBF], 2 mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina) durante 24 h antes de transfección.

6. transfección de las células

  1. Lavar el preparado células 1 x con 1 mL/pocillo de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).
  2. Añadir 1 mL de la mezcla de preparados nanolipoplex, que contenga 1 μg de eGFP que mRNA encapsulado en 1 μl, 2.5 μl, 5 μl, 10 μl o NLps 20 μl, en un pocillo de la placa preparada con células A549.
  3. Añadir la suspensión de nanolipoplex a las células e incubar en condiciones regulares de 24 horas para analizar la eficacia de transfección, o 24 h y 72 h para analizar la viabilidad de las células después de transfección.
    Nota: Transfección con NLps no requiere un cambio de medio.

7. Análisis de la eficacia de transfección celular mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia

  1. Quite el sobrenadante y lavar las células con 1 mL/bien PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) para quitar el restante NLps.
  2. Preparar las células para citometría de flujo.
    1. Trypsinize las células con 500 μL/pocillo tripsina/EDTA (0,05%) a 37 ° C por 3 min parada del proceso y desactivar la tripsina añadiendo la misma cantidad (500 μL/pocillo) de medio regular que contiene FBS.
    2. Centrifugar las células durante 5 min a 400 x g y retire con cuidado el sobrenadante sin tocar el precipitado de células.
    3. Lavar las células con 1 mL de PBS (sin Ca2 +Mg2 +).
    4. Resuspender las células en 300 μL de solución de fijación x 1 y las células de transferencia en tubos de citómetro de flujo.
    5. Analizar las células en 488 nm en un citómetro de flujo (Figura 4A).
      Nota: Vórtice las células 1 x directamente antes de medir.
  3. Preparar las células para la microscopía de fluorescencia.
    1. Fijar las células con 1 mL/pozo 100% metanol, que previamente se almacenó a-20 ° C.
    2. Añadir 500 μL/pocillo 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) disuelta en PBS (sin Ca2 +/Mg2 +) e incubar por 5 min en la oscuridad.
    3. Retirar la solución DAPI y lave las células otra vez con 100% metanol almacenado a-20 ° C.
    4. Analizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 4B).
      Nota: Use las siguientes longitudes de onda de excitación/emisión: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm y Cy3 550/570 nm.

8. ensayo de viabilidad celular

  1. Disolver 5 mg de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) en 1 mL de RPMI (sin rojo de fenol).
    Nota: El MTT disuelta debe ser más diluida 1:10 (concentración final: 0.5 mg/mL) en RPMI antes de su uso.
  2. Lavar las células transfected 3 x con 1 mL/pozo PBS (sin Ca2 +/Mg2).
    Nota: Los restos del medio celular regular deben retirarse completamente.
  3. Añadir 500 μL/pocillo de 1:10 diluido solución MTT a las células e incubar durante 4 h a 37 ° C.
  4. Retirar la solución MTT de las células después de la incubación y agregar 500 μL/pocillo de DMSO (dimetil sulfóxido). Otra vez incubar 10 min a 37 ° C.
  5. Pipetear la solución de DMSO en tríos en una placa de 96 pocillos de fondo claro y medir la absorción a 540 nm utilizando un lector de microplacas.
  6. Establecer la viabilidad de la célula no tratada en el 100% y calcular la viabilidad de las células de los otros grupos en comparación con las células control sin tratar (figura 5).

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Resultados

Utilizando el protocolo como se describe, NLps consisten en los lípidos colesterol DC y la droga fueron preparados utilizando el método de película seca (figura 1). Durante la preparación, la solución nanoliposoma muestra diferentes etapas en turbidez (figura 2).

La eficacia de la encapsulación de la NLps luego puede ser analizada después de la encapsulación de ...

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Discusión

El protocolo presentado describe la generación de NLps con eficacia alta encapsulación de mRNA sintético modificado, así como la fiable transfección de células en vitro. Por otra parte, las NLps garantiza la liberación de ARNm, que a su vez, se traduce en una proteína funcional dentro de las células. Además, las transfecciones con NLps puede realizarse en medio celular regular, dando por resultado alta viabilidades de la célula durante la transfección, y durar hasta tres días después de la transfec...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Ninguno

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

Referencias

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