JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Özet

Mesajcı RNA (mRNA) gelişimi-çeşitli hastalıkların tedavisinde olumlu nedeniyle daha fazla önemli hale gelir therapeutics temel özelliklerini vitro transkripsiyonu (IVT) mRNA. IVT mRNA sayesinde, istenilen bir protein de novo sentezi hedef hücre fizyolojik durumunu değiştirmeden bağlı olmak. Ayrıca, protein biyosentezi tam IVT mRNA geçici etkisi nedeniyle kontrol edilebilir.

Hücreleri verimli transfection için nanoliposomes (NLps) tedavi mRNA için güvenli ve verimli teslim araç temsil edebilir. Bu çalışmada DC-kolesterol ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine oluşan güvenli ve verimli katyonik NLps (uyuşturucu) teslimat vektör olarak IVT mRNA için oluşturmak için bir protokol açıklar. Bir tanımlanmış olan NLps, homojen bir dağılım ve yüksek complexation kapasitesi, boyutu ve kuru-film yöntemi kullanılarak üretilen. Ayrıca, biz onların complexation analiz etmek için farklı test sistemleri mevcut ve transfection efficacies sentetik kullanarak gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) mRNA, hem de hücre canlılığı üzerindeki etkileri. Genel olarak, sunulan Protokolü ilerlemek ve terapötik mRNA yönetimini geliştirmek mRNA complexation için etkili ve güvenli bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Değiştirilmiş mRNA kullanımı tedavi uygulamaları için son birkaç yıldır büyük bir potansiyel göstermiştir. Kalp, enflamatuar ve monogenetic hastalıkları, olduğu gibi aşı geliştirme, mRNA bir umut verici terapötik ajan1' dir.

Protein replasman tedavisi ile mRNA DNA transfection2hedef hücreleri içine dayalı klasik gen terapisi birkaç avantaj sunar. MRNA işlevi sitozol doğrudan başlatır. Her ne kadar plazmid DNA (pDNA), bir çift iplikçikli yapı, daire organizatörü bölge ve terapötik protein3, ayrıca eylemlere sitozol, kodlama bir gen dizisini içeren DNA bu sadece mitoz gidiyorsun hücrelere dahil edilebilir transfection anda. Bu doku1,4transfected hücrelerin sayısını azaltır. Özellikle, kalp hücreleri gibi zayıf mitoz faaliyeti ile dokuların transfection zor5' tir. PDNA aksine, transfection ve çeviri mRNA doku1,6mitotik ve mitotik olmayan hücrelerde ortaya çikmaktadir. Ana bilgisayar genom viral entegrasyon DNA'ın mutajenik etkileri veya bağışıklık tepkileri7,8, ama hücrelerin protein kodlama mRNA, istenen protein de novo sentezi ile transfection sonra gelebilir özerk olarak9,10da başlıyor. Ayrıca, protein sentezi tam için hastanın ihtiyacı aracılığıyla bireysel dozlarda, genom ile müdahale ve mutajenik etkileri11riske olmadan ayarlanabilir. Sentetik oluşturulan mRNA bağışıklık aktive potansiyelini önemli ölçüde sahte üridin ve 5'-methylcytidine ve sitidin Üridin12yerine kullanarak indirdi. Sözde Üridin değiştirilmiş mRNA da artan bir biyolojik istikrar ve anlamlı olarak daha yüksek bir translasyonel kapasitesi13var olduğu gösterilmiştir.

MRNA tabanlı terapi klinik uygulamaları umut verici özelliklerinden yararlanmak için mRNA taşıma hücre içine için uygun bir araç oluşturmak için önemlidir. Bu araç toksik olmayan özellikleri vitro ve in vivoayı, mRNA nükleaz düşmesine karşı korumak ve bir uzun süreli kullanılabilirlik ve mRNA14olan için yeterli hücresel alımını sağlamak.

Karbon nanotüpler, kuantum noktaları ve lipozomlar, gibi vivo içinde ilaç dağıtım için tüm olası taşıyıcı türleri arasında ikinci olmuştur en15,16okudu. Lipozomlar veziküller bir lipid bilayer10/ oluşan vardır. Onlar amfifilik bir hidrofobik ve hidrofilik bir bölüm ile ve bu moleküller öz düzenleme ile küresel bir çift katmanlı kurulan17yaşında. Lipozomlar içinde terapötik ajanlar veya uyuşturucu olabilir kapsüllü ve, böylece, enzimatik Bozulması18korumalı. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium klorür (DOTMA)19, içeren lipozomlar [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propan] (DOTAP)20ve dioctadecylamidoglycylspermine (köpek)21, ya da DC-kolesterol22, iyi karakterize ve DNA veya RNA ile hücresel transfection için sık kullanılan.

Katyonik lipozomlar pozitif yüklü bir lipid ve bir doldurulmamış fosfolipid23oluştururlar. Nükleik asitler hücre24,25içine taşınması için en yaygın yöntemlerden birini transfection yolu ile katyonik lipozomlar var. Katyonik lipit parçacıklar kompleksleri olumsuz şarj edilmiş fosfat grupları ile nükleik asit molekülleri26omurgası oluşturmak. Bu sözde lipoplexes hücre membran yüzeyine takın ve endositoz veya endositoz-gibi-mekanizmaları27aracılığıyla hücre girin.

1989 yılında, Malone ve ark. başarıyla katyonik lipit-aracılı mRNA transfection28nitelendirdi. Ancak, bir karışım DOTMA ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (uyuşturucu) kullanarak, Grup DOTMA sitotoksik efekt28tecelli bulundu. Ayrıca, Zohra vd. DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propan klorür) bir mRNA transfection reaktif29kullanılabileceğini gösterdi. Ancak, için verimli transfection hücre DOTAP fibronektin29 veya uyuşturucu30gibi diğer kimyasalları ile birlikte kullanılmalıdır. Şimdiye kadar DOTMA ilk katyonik lipit gen teslim31için kullanılan piyasada oldu. Diğer lipidler tedavi taşıyıcı olarak kullanılan ya da klinik çalışmalarda, farklı aşamalarında test edilen (örneğin, EndoTAG-ı DOTAP lipid taşıyıcı olarak içeren), şu anda bir aşama II klinik deneme32araştırılmaktadır.

Bu eser DC-kolesterol ve uyuşturucu içeren NLps üretimi için bir protokolünü açıklar. Bu yöntemi gerçekleştirmek kolay ve farklı boyutlarda NLps nesil sağlar. Kuru film yöntemi kullanarak NLp üretimi genel amacı lipozomlar mRNA complexation, böylece verimli ve biyouyumlu hücre transfection vitro14,33izin için oluşturmaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. nesil katyonik Nanoliposomes (Şekil 1)

  1. DC-kolesterol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] kolesterol hidroklorid) ve 25 mg/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için kloroform içinde bir toz olarak teslim uyuşturucu (dioleoyl phosphatidylethanolamine), lipitler geçiyoruz.
    Not:-20 ° C'de çözünmüş lipidler depolamak
  2. 25 mg/mL stok çözüm her iki lipidler ile çalışır. Mix 40 µL çözünmüş DC-kolesterol ve bir cam şişe içinde çözünmüş uyuşturucu 80 µL.
    Not: 3 mg toplam lipid tutardır. Kloroform hızlı buharlaşma önlemek için pipetting sırasında lipidler buza koyun.
  3. Kloroform bir argon gaz akışı altında 15 dakika buharlaştırmak. Daha sonra bir desiccator silika jel ile doldurmak, içinde açık cam şişeye koyun ve kalan kloroform buharlaşmış ve lipid film cam şişe içinde oluşturulur emin olmak için bir vakum gecede uygulamak.
    Not: hızlı çalışması ve gereksiz O2 temasından kaçının.
  4. 1 mL su nükleaz-alerjik ve girdap süspansiyon için 15 dk (Şekil 2A) ile kurulan lipid film rehydrate. Daha sonra süspansiyon için 1 h (Şekil 2B) sonication banyo içine koyun.
    Not: Süspansiyon biraz bulutlu olacak.
  5. Üreticinin yönergelerine göre mini ekstruder montajı, lipid süspansiyon ile bir şırıngaya doldur ve dolgulu şırınga ve boş bir şırınga ekstruder her iki tarafında yer. Lipid süspansiyon aracılığıyla bir şırıngadan membran diğer 20 x-süspansiyon (Şekil 2C) yükseltme için 25 x tuşuna basın.
    Not: NLps boyutu kullanılan membran gözenek boyutu tarafından belirlenir.
  6. NLps kadar daha fazla kullanılmasını bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın.
    Not: uzun süreli saklama süresi sonra NLps 15dk için tekrar sonication banyoda 35 kHz tarafından karmaşık oluşumu engelleyecek şekilde yerleştirilmelidir.

2. sentetik mRNA Vitro transkripsiyon

  1. EGFP kodlama hazırlamak mRNA protokol sonrası yayınlanan önceki34.
  2. Plazmid ileri 0.7 µM ile eGFP serisinden yükseltmek (5'-TTG GAC SKK CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') ve ters (5'-T120 CTT CTT Yasası CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') astar ve polimeraz kit PCR ile.
    1. DNA (Tablo malzemeler), erime davranışını değiştirir bir ticari tampon çözeltinin 20 µL yanı sıra 20 µL polimeraz Takımı'ndan 5 x karışımı karıştırın. Her (ileri ve geri) astar 7 µL ekleyin.
    2. 25 ekleyin karışımı ve polimeraz 2 µL eGFP plazmid polimeraz kitinden ng.
      Not: çözüm pipetting önce polimeraz buz üzerinde tutun.
    3. H nükleaz ücretsiz eklemek2O karışıma 100 µL hacmi kadar.
    4. Tablo 1' deki protokol sonrası thermocycler içinde PCR döngüleri çalıştırın.
  3. EGFP kodlama DNA dizisi PCR arıtma kiti ile arındırmak.
    1. Bu nedenle, bağlama arabellek Takımı'ndan 500 µL PCR çözüm karıştırın ve arıtma sütunlar doldurmak için kullanabilirsiniz.
    2. 1 dk. için maksimum hızda sütunları santrifüj kapasitesi ve filtrate atın.
    3. Ben sütuna, santrifüj maksimumda tekrar 1 dakika hız ve filtrate atın yıkama arabelleği 750 µL ekleyin.
    4. Arabellek sütun filtresini kaldırmak için 1 x santrifüj adımı yineleyin.
    5. Sütun için taze bir 1.5 mL tüp aktarın.
    6. Nükleaz ücretsiz h 20 µL Ekle2O sütun için kuluçkaya 1 dk ve maksimum hızda 1 dk santrifüj için. Bu adımı yineleyin.
    7. DNA'ın konsantrasyon fotometre ile ölçmek ve -20 ° C'de saklayın
    8. Jel Elektroforez kullanarak DNA kalite analizleri gerçekleştirmek. Özel 0.5 g Tris-bor-EDTA (TBE) arabellekte ekleyin ve özel tamamen eriyene kadar mikrodalga yüksek ısı ısı.
    9. Sıvı özel jel boyama çözüm 5 µL eklemek, çözüm jel odanın içine doldurun ve jel polimerli kadar bekleyin.
    10. Mix 200 ng 2 µL boya ve buna bir son hacmi 12 µL. hazır bir DNA merdiven yanı sıra DNA örneği jel kuyu Pipette ve Elektroforez için 1 h 100 V çalıştırmak dolgu yükleme x 6 ile DNA'ın.
    11. UV ışık altında bir jel analiz istasyonu kullanarak jel analiz.
  4. Vitro transkripsiyon mRNA DNA dizisinden T7-polimeraz içeren bir vitro transkripsiyon kiti ile oluşturmak için çalıştırmak ve Ψ-UTP ve metil-CTP ile UTP ve CTP nükleotit değiştirilen yedek.
    1. Vitro transkripsiyon için Tablo 2takip malzemeyi karıştırın.
      Not: 1.5 yerine metil-CTP ile 1:10 µL Cy3-CTP seyreltilmiş nükleaz ücretsiz H2O eGFP in vitro Transkripsiyon sırasında mRNA Cy3 etiketleme mRNA elde etmek için.
    2. IVT tepki karıştırmak 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya
    3. DNaz 1 µL eklemek T7 polimeraz dan kit ve 37 ° C tarafından DNA şablon sindirimi 15dk için kuluçkaya.
  5. MRNA arındırmak için RNA temizlik seti kullanın.
    1. Nükleaz ücretsiz h 100 µL hacmi IVT karışıma doldurmak2O.
    2. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 350 µL lizis arabellek ve karışımı ekleyin.
    3. 250 µL % 100 etanol ekleyip tekrar karıştırın. Karışımı içine Temizleme sütunları pipette.
    4. Santrifüj 15 x g ve atma filtrate 8.000 s.
    5. Bir sütununa, santrifüj 15 için tekrar çamaşır arabelleği 500 µL eklemek 8.000 x gve Kaldır filtrate s.
    6. 1 sütun yıkama x 500 µL yıkama arabellek ve 8.000 x gde 2 dk santrifüj ile.
    7. Sütun bir taze 1.5 mL tepki tüp içine taşıyın. MRNA 2 elute 1-dak kuluçka nükleaz ücretsiz h 20 µL olan x2O sütun membran üzerinde maksimum hızda 1 dk aralıklarla izledi.
  6. Fosfat grupları bir dephosphorylation kit kullanarak mRNA kaldırın. 10 x fosfataz arabelleği 4,5 µL ve fosfataz 1 µL mRNA için ekleyin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  7. MRNA tekrar, aşağıdaki adımları 2.5.1 - 2.5.7 arındırmak.
  8. MRNA concertation bir fotometre ile ölçmek.
  9. Jel Elektroforez saflık ve mRNA boyutunu çözümlemek için kullanın. Bu nedenle, bir özel jel adımları 2.3.9 - 2.3.10 açıklandığı şekilde hazırlayın.
    1. Formamide, 1 µL % 37 formaldehit, 10 x MEN 1 µL ve boya 200 ile yükleme x 6 1.7 µL Mix 3.3 µL ng mRNA ve ilâ 10 µL nükleaz ücretsiz H ile doldurun2O her örnek ve RNA işaretçisi için.
    2. Karıştırmak için mRNA denatürasyon 65 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Jel mRNA ve RNA marker ile kuyu yük ve 1 h için jel 100 V çalıştırın.
    3. Bir jel Doktor İstasyonu ile UV ışık kullanarak jel analiz.

3. complexation sentetik mRNA

  1. Buz, sentetik mRNA çözülme girdap ve santrifüj tüpü açmadan önce kısa bir süre.
  2. Mix 10 µL sentetik mRNA (mRNA konsantrasyonu ise 100 ng/µL) 1 µL, 2.5 µL, 5 µL, 10 µL veya 20 µL NLp süspansiyon (NLp konsantrasyonu ise 3 mg/mL). Kısaca santrifüj kapasitesi ve nanolipoplex oluşumu için (RT) Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
    Not: pipetting tarafından birlikte kullanmayın. Bu hacim kaybına yol açabilir. Kısa bir süre için kapsamlı bir karıştırma girdap.
  3. 1 mL normal hücre orta nanolipoplexes için ve onları yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.

4. Nanoliposomes kapsülleme Verimlilik Analizi

  1. Kapsülleme deneyler yapmak için RNA miktar seti kullanın.
  2. Çalışma çözümü için yüksek menzilli floresan boya 1: 200 ve 1:2,000 yüksek menzilli tahlil için sulandrarak hazırlayın.
    Not: floresan boya buz çözme. Kullanmadan önce doğrudan çalışma çözüm hazırlamak.
  3. 1 mL eGFP 2 µg/mL stok çözeltisi kullanarak yüksek menzilli ve yüksek menzilli standart eğrileri hazırlamak mRNA nükleaz ücretsiz h2O.
    Not: Standart eğriler için kapsülleme deneylerde kullanılacak olan mRNA kullanın.
  4. Tablo 3 yüksek menzilli standart (20 ng/mL - 1 µg/mL) hazırlanması için kullanın.
  5. Yüksek menzilli standart için mRNA hisse senedi çözüm 1:20 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon ulaşmak için 2 µg/mL eGFP sulandırmak. Bir yüksek menzilli standart (1 ng/mL - 50 ng/mL) Tablo 4' te açıklandığı şekilde hazırlayın.
  6. EGFP 1 µg birleştirmek mRNA (10 µL) ve NLps 7.5 µg (2.5 µL) ve 20 dk RT. az için kuluçkaya
    Not: yıkımı önlemek için mRNA buz üzerinde tutun.
  7. Nükleaz ücretsiz H 1 mL ekleyin2O formu nanolipoplexes ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix.
  8. Kapsüllenmiş örnekleri ve standartları için 1 mL 1: 200 veya 1:2,000 RNA floresan boya çalışma çözeltisi ekleyin ve karanlıkta RT, 5 min için kuluçkaya.
  9. Standartlar ve çoğaltmaları örneklerinde siyah bir 96-şey plaka pipette ve 530, floresans ölçmek nm Mikroplaka Okuyucu (Şekil 3).

5. Transfection için hücreleri hazırlanması

  1. Plaka 1.5 x 105 A549 hücreler/iyi bir 12-şey plaka 1 d transfection önce.
  2. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 normal hücre Orta (DMEM/yüksek glikoz ile % 10 fetal Sığır serum [FBS], 2 mM L-glutamin, % 1 penisilin/streptomisin)'de transfection önce 24 h için kuluçkaya.

6. transfection hücre

  1. Hazırlanan yıkayın 1 x 1 mL/iyi PBS ile hücreleri (Ca olmadan2 + /Mg2 +).
  2. 1 mL 1 µL, 2.5-µL, 5-µL, 10 µL veya 20 µL NLps, bir de A549 hücreleri ile hazırlanan plaka mRNA kapsüllü eGFP 1 µg içeren hazır nanolipoplex karışımı ekleyin.
  3. Nanolipoplex süspansiyon hücrelere ekleme ve normal koşullar transfection etkinliğini analiz etmek 24 saat veya 24 saat ve 72 h hücre canlılığı transfection sonra analiz etmek için kuluçkaya.
    Not: Transfection NLps ile orta bir değişiklik gerektirmez.

7. Akış Sitometresi ve floresan mikroskopi kullanarak hücre Transfection Etkinlik Analizi

  1. Süpernatant kaldırmak ve 1 mL hücrelerle yıkama/PBS (Ca2 +/Mg2 +) kalan NLps kaldırmak için iyi.
  2. Hücreleri akış sitometresi için hazırlayın.
    1. 500 µL/iyi tripsin/EDTA (% 0.05) 3 dk. durdurmak için 37 ° C'de hücrelerle işlemi trypsinize ve tripsin düzenli FBS içeren orta aynı miktarda (500 µL/de) ekleyerek devre dışı bırakın.
    2. Hücreler için 400 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde süpernatant hücre Pelet dokunmadan çıkarın.
    3. PBS 1 mL hücrelerle yıkayın (Ca olmadan2 + /Mg2 +).
    4. 1 x fiksasyon çözüm 300 µL hücrelerde resuspend ve hücreleri akış sitometresi tüpler içine aktarın.
    5. Senaryo Özeti 488 analiz nm bir akış sitometresi (Şekil 4A) içinde.
      Not: Girdap ölçme önce hücreleri 1 x doğrudan.
  3. Hücreleri Floresan Mikroskobu hazırlayın.
    1. Daha önce-20 ° C'de depolanmış 1 mL/iyi % 100 metanol ile hücreleri tamir
    2. Eklemek 500 µL/iyi 300 nM DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) PBS (Ca2 +/Mg2 +) çözünmüş ve karanlıkta 5 min için kuluçkaya.
    3. DAPI çözümü kaldırmak ve hücrelerin tekrar-20 ° C'de depolanan % 100 metanol ile yıkayın.
    4. Hücreleri floresan mikroskop (Şekil 4B) kullanarak analiz.
      Not: aşağıdaki uyarma/emisyon dalga boylarında kullanın: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm ve Cy3 550/570 nm.

8. hücre canlılığı tahlil

  1. RPMI 1 ml (olmadan fenol red) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür) 5 mg geçiyoruz.
    Not: Çözünmüş MTT daha fazla sulandırılmış 1:10 olması gerekir (son konsantrasyonu: 0,5 mg/mL) kullanmadan önce RPMI içinde.
  2. Transfected hücreleri 3 yıkama x 1 mL/iyi PBS (olmadan Ca2 +/Mg2) ile.
    Not: Kalıntıları normal hücre orta tamamen kaldırılması gerekir.
  3. 1:10 500 µL/iyi MTT çözüm hücrelere seyreltilmiş ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya ekleyin
  4. MTT çözüm hücrelerden kuluçka sonra kaldırın ve 500 µL/iyi DMSO (dimetil sülfoksit) ekleyin. Yine 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
  5. Üçüz DMSO çözümde bir açık-alt 96-şey plaka pipette ve 540, adsorpsiyon ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.
  6. Tedavi edilmemiş hücre canlılığı % 100 olarak ayarlayın ve diğer gruplar ile karşılaştırıldığında tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Şekil 5) hücre canlılığı hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Açıklandığı gibi iletişim kuralını kullanarak, lipitler DC-kolesterol ve uyuşturucu oluşan NLps Kuru-film (Şekil 1) yöntemiyle hazırlanmıştır. Hazırlık sırasında nanoliposome çözüm farklı aşamaları bulanıklık (Şekil 2) gösterir.

NLps kapsülleme etkinliğinin ardından eGFP kodlama mRNA 1 µg kapsülleme sonra ücretsiz kapsüllü değil, R...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sunulan Protokolü NLps nesil sentetik değiştirilmiş mRNA için yüksek kapsülleme etkinliği ile hem de hücreleri vitrogüvenilir transfection açıklar. Ayrıca, buna karşılık, hücre içinde işlevsel bir protein çevrilmiş mRNA sürümü NLps garanti. Ayrıca, NLps kullanarak transfections normal hücre ortamda gerçekleştirilebilir, yüksek çıkan viabilities transfection sırasında hücre ve üç gün sonra transfection son.

MRNA bir tedavi kullanmak için sistemi te...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Hiçbiri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

Referanslar

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 144mRNAnanoliposomesuyu turucuDC kolesterolkaps llemetransfectionteslimattedavi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır