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摘要

在这里, 我们描述了一个方案的阳离子纳米脂质体的生成, 这是基于干膜法, 并可用于安全和有效的传递体外转录信使 rna。

摘要

由于体外转录 (ivt) mrna 的积极特性, 基于信使 rna (mrna) 的治疗各种疾病的疗法的开发变得越来越重要。在 ivt mrna 的帮助下, 可以在不改变目标细胞生理状态的情况下诱导所需蛋白质的新合成。此外, 由于 ivt mrna 的瞬态效应, 可以精确地控制蛋白质的生物合成。

对于细胞的有效转染, 纳米脂质体 (nlps) 可能是治疗 mrna 的安全有效的载体。本研究描述了一种生成安全高效阳离子 nlps 的协议, 该方案由 dc-胆固醇和 1, 2-二醇-环甘油酯-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------nlps 具有定义的尺寸、均匀分布和较高的复用能力, 可使用干膜法生产。此外, 我们提出了不同的测试系统, 以分析他们的络合和转染效率使用合成增强绿色荧光蛋白 (transfection) mrna, 以及他们对细胞活力的影响。总体而言, 所提出的协议为 mrna 络合提供了一种有效和安全的方法, 可以促进和改进治疗性 mrna 的管理。

引言

在过去几年中, 改性 mrna 在治疗应用中的应用显示出巨大的潜力。在心血管、炎症和单基因疾病以及疫苗开发中, mrna 是一种很有前途的治疗药物1。

蛋白质替换疗法与 mrna 提供了几个好处比古典基因疗法, 根据脱氧核糖核酸转染入目标细胞2。mrna 功能直接在细胞溶胶中启动。尽管质粒 dna (pdna) 是一种双链结构, 含有启动子区域的圆形 dna 和编码治疗蛋白3的基因序列, 也在细胞溶胶中发挥作用, 但它只能被纳入正在进行有丝分裂的细胞中在转染的时候。这减少了组织中转染的细胞数量 1,4。具体来说, 有丝分裂活性弱的组织, 如心肌细胞的转染是困难的 5。与 pdna 不同的是, mrna 的转染和转化发生在组织1,6的有丝分裂和非有丝分裂细胞中。dna 与宿主基因组的病毒整合可能伴随着致突变效应或免疫反应7,8, 但在细胞转染后与蛋白质编码 mrna, 去重新合成所需的蛋白质自主开始 9,10。此外, 蛋白质合成可以通过单独剂量精确地调整到患者的需要, 而不会干扰基因组, 并有致突变效应11的危险.用伪尿素和 5 '-甲基胞苷代替尿素和胞苷12可显著降低合成生成的 mrna 的免疫激活潜力.假尿碱修饰的 mrna 也被证明具有更高的生物稳定性和显著提高的翻译能力13。

为了能够从基于 mrna 的治疗在临床应用中的有希望的特性中受益, 必须为 mrna 输送到细胞创造一个合适的工具。该飞行器应在体外和体内具有无毒特性, 保护 mrna 免受核酸酶降解的影响, 并提供足够的细胞吸收, 以便长时间地提供和翻译 mrna14。

在所有可能的体内药物传递载体类型中, 如碳纳米管、量子点和脂质体, 后者的研究最多 15、1 6.脂质体是由脂质双层10组成的囊泡。它们是具有疏水性和亲水性的两亲性, 通过这些分子的自排列, 形成了一个球形的双层。在脂质体内, 治疗药物或药物可以被封装, 从而防止酶降解 18.含有 n-[1, 2, 3-二烯二氧基) 丙基]-n 的脂质体, n、n-三甲基氯化铵 (dadma)19、[1, 2-bis (oley合 y)-3-(三甲基氨)丙烷] (dadap) 20 和二辛烷基氨基氨基氨基氨基氨基氨基胺胺 (dogs)21, 或dc-胆固醇22, 有很好的特征, 经常用于与 dna 或 rna 的细胞转染。

阳离子脂质体包括带正电荷的脂质和未带电的磷脂 23。通过阳离子脂质体转染是将核酸输送到细胞24,25的最常用方法之一。在核酸分子的主干中, 阳离子脂质颗粒与负电荷磷酸盐基团形成复合物26。这些所谓的脂质附着物附着在细胞膜表面, 并通过内吞或内皮样机制进入细胞 27。

1989年, 马龙等人。成功地描述了阳离子脂介导的mrna 转染28。然而, 使用 dotma 和 1, 2-二醇-sn-h神菌-3-磷乙醇胺 (dope) 的混合物, 该组发现 dotma 表现出细胞毒性作用28。此外, zohra等人还表明, dadap (1, 2-二烯二氧基 3-三甲基丙烷氯丙烷) 可用作 mrna 转染试剂29。然而, 为了有效转染细胞, dopap 应与其他试剂结合使用, 如纤维连接蛋白 29或 dope30。到目前为止, d同甲是市场上第一个用于基因传递的阳离子脂质 31.其他脂类被用作治疗载体或正在临床试验的不同阶段进行检测 (例如, 含有 dentap 作为脂质载体的 endatg-i) 目前正在第二阶段临床试验32中进行调查。

这项工作描述了一个协议, 用于生成含有 dc 胆固醇和 dope 的 nlps。此方法易于执行, 并允许生成不同大小的 nlps。使用干膜法生成 nlp 的总体目标是为 mrna 络合创建脂质体, 从而允许在体外高效和生物相容性的细胞转染 14,33。

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研究方案

1. 阳离子纳米脂质体的产生 (图 1)

  1. 溶解脂质 dc-胆固醇 (3β-[n-(n ', n '-二甲基氨基乙烷)-氨基乙酰] 盐酸胆固醇) 和 dope (二烯醇磷脂酰乙醇胺), 以氯仿的形式提供, 最终浓度为 25 mg/ml。
    注: 将溶解的脂质存放在-20°c。
  2. 使用 25 mgml 两种脂类的库存解决方案。将溶解的 dc 胆固醇的40μl 和溶解的 dope 的80μl 混合在一个玻璃瓶中。
    注: 总脂量为3毫克。为避免氯仿快速蒸发, 在移液过程中将脂质放在冰上。
  3. 在氩气流动下对氯仿进行15分钟的蒸发。随后, 用硅胶填充干燥器, 将打开的玻璃烧瓶放入室内, 并在一夜之间涂抹真空, 以确保剩余的氯仿蒸发, 并在玻璃烧瓶内形成脂质膜。
    注意: 工作速度快, 避免不必要的 o2 接触。
  4. 用1毫升无核酸水补充形成的脂质膜, 并对悬浮液进行15分钟的旋涡 (图 2a)。然后, 将悬浮液放入声纳浴中 1小时 (图 2b)。
    注意: 悬架将略显多云。
  5. 按照制造商的说明组装微型挤出机, 用脂质悬架填充注射器, 并将填充的注射器和空注射器放在挤出机的两侧。按下脂质悬浮液从一个注射器到另一个注射器, 20x–25x, 以挤压悬浮液 (图 2c)。
    注: nlps 的大小取决于所使用的膜的孔径。
  6. 将 nlps 存放在4°c 的玻璃烧瓶中, 直至进一步使用。
    注意: 经过长时间的储存时间后, nlps 应再次放置在超声浴中15分钟乘 35 khz, 以规避复杂的形成。

2. 合成 mrna 的体外转录

  1. 按照前面34发布的协议准备 egfp 编码 mrna。
  2. 用0.7μm 的前置 (5 '-ttg gac cct cgt cgt act aca gaa gct aat acg-3) 放大质粒中的 egfp 序列 ') 和反向 (5 '-t120 ctt ctt act cng tta ttta gac ca-3 ') 引物和聚合酶试剂盒与 pcr。
    1. 混合20μl 的商业缓冲液, 改变 dna (材料表) 的熔融行为, 以及20μl 的5倍混合从聚合酶试剂盒。加入每种 (正向和反向) 底漆的7μl。
    2. 在混合物中加入25纳克的 egfp 质粒和从聚合酶试剂盒中加入2μl 的聚合酶。
      注意: 将聚合酶移至溶液后, 请将其保存在冰上。
    3. 在混合物中加入无核酸酶的 h2o,体积不超过100μl。
    4. 按照表 1中的协议在热环器中运行 pcr 周期。
  3. 用 pcr 纯化试剂盒纯化 egfp 编码 dna 序列。
    1. 因此, 将 pcr 溶液与试剂盒中500μl 的结合缓冲液混合, 并使用它填充纯化柱。
    2. 以最大速度离心柱 1分钟, 并丢弃滤液。
    3. 在色谱柱中加入750μl 洗涤缓冲液 i, 以最大速度再离心 1分钟, 并丢弃滤液。
    4. 重复离心机步骤 1x, 从列筛选器中取出缓冲区。
    5. 将色谱柱转移到新鲜的 1.5 ml 管中。
    6. 在柱中加入20μl 的无核酸酶h2o, 孵育 1分钟, 离心机以最大速度孵育1分钟。重复此步骤。
    7. 用分光光度计测量 dna 的浓度, 并将其存储在-20°c。
    8. 使用凝胶电泳进行 dna 质量分析。在 rris-borate-edta (tbe) 缓冲液中加入0.5 克琼脂糖, 并在高温下将其加热, 直到琼脂糖完全溶解。
    9. 在琼脂糖液体中加入5μl 凝胶染色溶液, 将溶液灌入凝胶室, 然后等待凝胶聚合。
    10. 将200纳克的 dna 与2μl 的6x 负载染料混合, 并将其填充到凝胶井中, 直到端体积为 12μl. 移液器, 然后再放入凝胶井中, 并在 100 v 处运行1小时的电泳。
    11. 在紫外光下, 用凝胶分析站对凝胶进行分析。
  4. 运行体外转录, 利用含有 t7-聚合酶的体外转录试剂盒从 dna 序列中生成 mrna, 并用-utp 和甲基-ctp 取代 utp 和 ctp 的修饰核苷酸。
    1. 对于体外转录, 混合表2后面的成分。
      注: 将1.5 μl 的甲基 ctp 改为 1:10 cy3-ctp, 在 egfp mrna的体外转录过程中, 在无核酸酶 h2o 中稀释, 以实现 mrna 的 cy3 标记。
    2. 在37°c 下培养 ivt 反应混合物4小时。
    3. 从 t7 聚合酶试剂盒中加入1μl 的 dna i, 然后在37°c 孵育 15分钟, 以消化 dna 模板。
  5. 要净化 mrna, 请使用 rna 清理试剂盒。
    1. 用无核酸酶h2o填充 ivt 混合量为100μl。
    2. 加入350μl 的裂解缓冲液, 通过上下移液混合。
    3. 加入250μl 的100% 乙醇, 再混合。将混合液移到清理列中。
    4. 以 8, 000 x克的速度离心 15秒, 并丢弃滤液。
    5. 将洗涤缓冲液的500μl 加入柱中, 以 8, 000 x克的速度再次离心 15秒, 并取出滤液。
    6. 用500μl 的洗涤缓冲液和离心机清洗1x 柱 2分钟, 8, 000 x 克。
    7. 将色谱柱移动到一个新鲜的 1.5 ml 反应管中。通过在柱膜上培养20μl 的无核酸酶h2o, 然后以最大速度进行1分钟离心, 以确保 mrna 的2倍。
  6. 使用脱磷酸化试剂盒从 mrna 中取出磷酸盐基团。在 mrna 中加入4.5μl 的10倍磷酸酶缓冲液和1μl 磷酸酶, 并在37°c 孵育1小时。
  7. 再次净化 mrna, 按照步骤 2.5.1-2.5.7。
  8. 用测光仪测量 mrna 的协调。
  9. 使用凝胶电泳来分析 mrna 的纯度和大小。因此, 准备一个琼脂糖凝胶, 如步骤 2.3.9-2.3.10 中所述。
    1. 将喷洒酰胺3.3μl、37% 甲醛1μl、10倍单片染料1μl 和6倍负载染料1.7μl 与 200 ng mrna 混合, 并为每个样品和 rna 标记用无核酸酶2o 填充至多10μl。
    2. 在65°c 下将混合物培养 10分钟, 以实现 mrna 变性。用 mrna 和 rna 标记加载凝胶的井, 并在 100 v 处运行凝胶1小时。
    3. 使用具有紫外线的凝胶文档站对凝胶进行分析。

3. 合成 mrna 的复杂性

  1. 在打开试管前不久, 在冰上解冻合成的 mrna, 使其变热, 然后离心机。
  2. 将10μl 合成 mrna (mrna 浓度为 100ngμl) 与1μl、2.5μl、5μl、10μl 或20μl 的 nlp 悬浮液 (nlp 浓度为 3mg/ml) 混合。在室温 (rt) 下进行短暂离心和孵育 20分钟, 形成纳米橄榄石。
    注意: 不要通过移液混合。这可能会导致体积损失。涡旋很快为彻底混合。
  3. 在纳米细胞层数中加入1毫升的常规细胞培养基, 并通过上下移液混合。

4. 纳米脂质体的包封效率分析

  1. 要执行封装实验, 请使用 rna 定量试剂盒。
  2. 通过稀释荧光染料1:200 进行高范围处理和1:2000 低范围测定, 准备工作溶液。
    注意: 在冰上解冻荧光染料。使用前直接准备工作解决方案。
  3. 使用 egfp mrna 的2μgml 库存溶液在无核酸酶 h2o 中的 1 ml, 制备高范围和低范围的标准曲线。
    注意: 对于标准曲线, 请使用将用于封装实验的 mrna。
  4. 使用表 3制备高范围标准 (20 ng/mL μgml)。
  5. 对于低范围标准, 稀释 2μgl egfp 库存溶液 1:20, 最终浓度为 100 ngml。如表 4所示, 准备一个低范围标准 (1 ngl-50 ngml)。
  6. 将1微克的 egfp mrna (10μl) 和7.5 微克的 nlps (2.5μl) 混合在一起, 在 rt 孵育20分钟。
    注意: 将 mrna 放在冰上, 以避免降解。
  7. 加入1毫升无核酸酶的h2o, 形成纳米橄榄树, 上下移液混合。
  8. 在封装的样品和标准中加入1毫升的1:200 或 1:2000 rna 荧光染料工作溶液, 并在黑暗中在 rt 孵育5分钟。
  9. 将标准和样品以复制的形式输送到96孔的黑色板, 并在微板读取器上测量 530 nm 处的荧光 (图 3)。

5. 转染细胞的制备

  1. 转染前 12井板 1 d 的板 1.5 x 10 5 a549 地窖井。
  2. 在转染前24小时将细胞在37°c 和 5% co2 的常规细胞培养基中 (dmm2 高血糖与10% 的胎牛血清 [fbs]、2 mm l-谷氨酰胺、1% 的 penicilin·链霉素) 中培养 24小时.

6. 细胞的转染

  1. 用 1 mlwell pbs 清洗准备好的细胞 1x (不含 ca2 +/mg2 +)。
  2. 将制备的纳米 plex 混合物添加1毫升, 其中含有1μg 的 egfp mrna, 封装成1μl、2.5μl、5μl、10μl 或 20μl nlps, 加入制备的带有 a549 细胞的板材的一个井。
  3. 将纳米颗粒悬浮液加入细胞, 在常规条件下孵育 24小时, 分析转染效果, 或在24小时和72小时内分析转染后的细胞活力。
    注意: 使用 nlps 进行转染不需要进行介质更改。

7. 流式细胞仪和荧光显微镜对细胞转染效果的分析

  1. 取出上清液, 用 1 mlwell pbs (不含 ca2 +mgg2 +) 清洗细胞, 取出剩余的 nlps。
  2. 准备流式细胞仪的细胞。
    1. 在37°c 时, 用 500μl/井胰蛋白酶 edta (0.05%) 对细胞进行胰蛋白酶化 3分钟, 通过添加相同数量 (500μl/well) 的常规 fbs 介质来停止过程并灭活胰蛋白酶。
    2. 在 400 x g处离心细胞 5分钟, 并在不接触细胞颗粒的情况下小心去除上清液。
    3. 用1毫升的 pbs 清洗细胞 (不含ca 2 +/mg2 +)。
    4. 将细胞重新注入30μl 的1x 固定溶液中, 并将细胞转移到流式细胞仪中。
    5. 在流式细胞仪中分析 488 nm 的细胞 (图 4 a)。
      注: 在测量前, 细胞的涡旋为1x。
  3. 准备用于荧光显微镜的细胞。
    1. 用 1 mL/well 100% 甲醇固定细胞, 该甲醇以前储存在-20°c。
    2. 加入溶解在 pbs 中的 500μl/well 300 nm dapi (4 ', 6-二胺-2-苯二酚) (不含 ca2 +/mg2 +), 在黑暗中孵育5分钟。
    3. 取出 dapi 溶液, 然后在-20°c 下储存100% 甲醇, 再次清洗细胞。
    4. 使用荧光显微镜分析细胞 (图 4b)。
      注: 使用以下发射波长: egfp 488/509 nm、dapi 358/461 nm 和 cy3 550/570 nm。

8. 细胞活力检测

  1. 在 rpmi (不含苯酚红色) 1 毫升中溶解5毫克的 mtt (3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四唑溴铵)。
    注: 溶解的 mtt 在使用前必须在 rpmi 中进一步稀释 1:10 (最终浓度: 0.5 mg/ml)。
  2. 用 1 mlwell pbs 清洗转染细胞 3x (不含 ca2 +/mg2)。
    注意: 应完全取出常规细胞培养基的遗骸。
  3. 在细胞中加入 500μl/well 1:10 稀释 mtt 溶液, 在37°c 下孵育4小时。
  4. 孵育后从细胞中取出 mtt 溶液, 加入 500μlwell dmso (二甲基亚硫酸盐)。在37°c 下再次孵化10分钟。
  5. 将 dmso 溶液移入三胞胎96孔板, 并使用微板读取器测量540纳米的吸附量。
  6. 将未处理细胞的活力设置为 100%, 并与未处理的控制细胞进行比较, 计算其他组的细胞活力 (图 5)。

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结果

利用该协议, 采用干膜法制备了由脂质 dc-胆固醇和 dope 组成的 nlps (图 1)。在制备过程中, 纳米脂质体溶液显示浊度的不同阶段 (图 2)。

然后, 通过使用 rna 定量试剂盒 (图3) 分析未封装的 mrna 的自由量, 可以分析 nlps 的封装效果。

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讨论

该协议描述了具有高封装效果的 nlps 的生成, 以合成改性 mrna, 以及细胞在体外的可靠转染。此外, nlps 保证 mrna 的释放, 而 mrna 又被转化为细胞内的功能蛋白。此外, 使用 nlps 的转染可以在常规细胞培养基中进行, 从而在转染过程中产生较高的细胞振动, 并在转染后最多持续三天。

使用 mrna 作为治疗, 自组装系统为其交付的首选。最常见的转染试剂包括阳离子脂质, 包括脂?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

没有

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

参考文献

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

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