JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Résumé

Le développement de l’ARN messager (ARNm)-fonction thérapeutique pour le traitement de diverses maladies devient plus important à cause de la positive propriétés de in vitro transcrit mRNA (IVT). Avec l’aide de l’ARNm de l’IVT, la synthèse de novo d’une protéine désirée peut être induite sans changer l’état physiologique de la cellule cible. En outre, biosynthèse des protéines peut être contrôlée avec précision en raison de l’effet transitoire du mRNA IVT.

Pour la transfection efficace des cellules, nanoliposomes (PNV) peut représenter un véhicule de livraison sûre et efficace pour l’ARNm thérapeutique. Cette étude décrit un protocole pour générer sûre et efficace cationique PNV composée de DC-cholestérol et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) comme un vecteur de livraison d’ARNm IVT. PNV ayant une taille, une répartition homogène et une capacité élevée de complexation et peut être produites à l’aide de la méthode sèche-film. Par ailleurs, nous présentons des systèmes de test différent afin d’analyser leur complexation et efficacité de transfection utilisant synthétique renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) mRNA, ainsi que leur effet sur la viabilité des cellules. Globalement, le protocole présenté fournit une approche efficace et sans danger pour la complexation d’ARNm, qui peut faire avancer et améliorer l’administration de l’ARNm thérapeutique.

Introduction

L’utilisation du mRNA modifiés pour des applications thérapeutiques a montré beaucoup de potentiel dans les deux dernières années. Maladies cardiovasculaires, inflammatoires et monogénique, ainsi que dans le développement de vaccins, l’ARNm est agent thérapeutique prometteur1.

Thérapie de remplacement de protéines avec l’ARNm offre plusieurs avantages sur la thérapie génique classique, qui repose sur la transfection d’ADN dans les cellules de cible2. La fonction ARNm lance directement dans le cytosol. Bien que le plasmide ADN (pDNA), une construction de double-brin, circulaire ADN contenant une région promotrice et une séquence de gène codant pour la protéine thérapeutique3, également des actes dans le cytosol, il peut seulement être incorporé dans les cellules qui traversent la mitose au moment de la transfection. Cela réduit le nombre de cellules transfectées dans le tissu1,4. Plus précisément, la transfection des tissus ayant une activité faible mitose, telles que les cellules cardiaques, est difficile5. Contrairement à pDNA, la transfection et la traduction des ARNm produisent dans les cellules mitotiques et non-mitotique dans le tissu1,6. L’intégration virale d’ADN dans le génome hôte peut venir avec des effets mutagènes ou réactions immunitaires7,8, mais après la transfection de cellules avec un ARNm codant des protéines, la synthèse de novo de la protéine désirée commence de manière autonome9,10. En outre, la synthèse des protéines peut être ajustée précisément au besoin du patient par le biais de doses individuelles, sans interférer avec le génome et risquer des effets mutagènes11. Le potentiel d’activation immunitaire des ARNm synthétiquement généré pourrait être considérablement réduit en utilisant des pseudo-uridine et 5'-méthylcytidine au lieu de l’uridine et cytidine12. Pseudo-uridine, mis à jour le mRNA a également été montré pour avoir une meilleure stabilité biologique et une significativement plus élevée capacité translationnelle13.

Pour pouvoir bénéficier des propriétés prometteuses de la thérapie axée sur les ARNm en applications cliniques, il est essentiel de créer un véhicule adapté pour le transport de l’ARNm dans les cellules. Ce véhicule devrait porter non toxique propriétés in vitro et in vivo, de protéger l’ARNm contre la nucléase-dégradation et fournir absorption cellulaire suffisante pour une disponibilité prolongée et la traduction de l’ARNm de14.

Parmi tous les types de support possible pour in vivo l’administration de médicaments, tels que les nanotubes de carbone, points quantiques et liposomes, ces derniers ont été étudiées les plus de15,16. Liposomes sont des vésicules constituée d’une bicouche de lipides10. Ils sont amphiphiles comporte un hydrophobe et une partie hydrophile, et grâce à l’entente autonome de ces molécules, une double couche sphérique est formé de17. Dans les liposomes, agents thérapeutiques ou drogues peuvent encapsulés et, ainsi, protégés de dégradation enzymatique18. Liposomes contenant N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorure (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(triméthylammonio) propane] (DOTAP)20et21de dioctadecylamidoglycylspermine (chiens), ou DC-cholestérol22, sont bien caractérisées et fréquemment utilisé pour la transfection cellulaire avec l’ADN ou d’ARN.

Les liposomes cationiques forment un lipide chargé positivement et un phospholipide sans inculpation23. La transfection par l’intermédiaire des liposomes cationiques est l’une des méthodes plus courantes pour le transport d’acides nucléiques dans des cellules24,25. Les particules de lipide cationique forment des complexes avec les groupes phosphates chargés négativement dans le squelette de l’acide nucléique molécules26. Ces soi-disant lipoplexes fixent à la surface de la membrane cellulaire et entrer dans la cellule par endocytose ou endocytose-mécanismes27.

En 1989, Malone et al. avec succès décrits médiée par les lipides cationiques ARNm transfection28. Toutefois, à l’aide d’un mélange de DOTMA et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), le groupe a estimé que DOTMA manifeste des effets cytotoxiques28. En outre, Zohra et coll. ont montré que DOTAP (chlorure de 1, 2-dioleoyloxy-3-triméthylammonium-propane) peut être utilisé comme un ARNm transfection réactif29. Toutefois, pour la transfection efficace des cellules, DOTAP doit être utilisé en combinaison avec d’autres réactifs, tels que la fibronectine29 ou30de la DOPE. Jusqu'à présent, DOTMA a été le premier lipide cationique sur le marché utilisé pour la livraison de gène31. Autres lipides sont utilisées comme supports thérapeutiques ou sont actuellement testés à différents stades d’essais cliniques (p. ex., EndoTAG-I, contenant DOTAP comme un transporteur de lipides), est actuellement à l’étude dans un essai clinique de phase II32.

Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération du PNV contenant DC-cholestérol et DOPE. Cette méthode est facile à réaliser et permet la génération du PNV de différentes tailles. L’objectif général de génération de PNL à l’aide de la méthode sèche-film est de créer des liposomes pour la complexation de l’ARNm, ce qui permet de transfection de cellules efficace et biocompatible en vitro14,33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. génération de Nanoliposomes cationique (Figure 1)

  1. Dissoudre les lipides DC-cholestérol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol chlorhydrate) et DOPE (dioléoyl phosphatidyléthanolamine), livrés sous forme de poudre, dans le chloroforme à une concentration finale de 25 mg/mL.
    Note : Stocker les lipides dissous à-20 ° C.
  2. Travailler avec 25 mg/mL de solution de ces deux lipides. Mix 40 µL de la DC-cholestérol dissous et 80 µL de la DOPE dissoute dans un flacon en verre.
    Remarque : La quantité de lipides totaux est de 3 mg. Pour éviter une évaporation rapide du chloroforme, placez les lipides sur glace pendant le pipetage.
  3. Vaporiser le chloroforme pendant 15 min sous un débit de gaz d’argon. Par la suite, remplissez un dessiccateur avec gel de silice, placer la fiole de verre ouvert à l’intérieur et d’appliquer un vide durant la nuit pour s’assurer que le chloroforme restant s’évapore, et un film lipidique est formé à l’intérieur de la fiole de verre.
    Remarque : Travailler vite et d’éviter les contacts inutiles de2 O.
  4. Réhydrater le film lipidique formé avec 1 mL d’eau exempte de nucléase et vortexer la suspension pendant 15 min (Figure 2 a). Par la suite, placez la suspension dans un bain de sonication pendant 1 h (Figure 2 b).
    Remarque : La suspension sera légèrement nuageuse.
  5. Assembler l’extrudeuse mini selon les instructions du fabricant, remplissez une seringue avec la suspension de lipides et placez la seringue remplie et une seringue vide des deux côtés de l’extrudeuse. Appuyez sur la suspension des lipides à travers la membrane d’une seringue à l’autre, 20 x – x 25, à extruder la suspension (Figure 2).
    Remarque : La taille de la PNV est déterminée par la taille des pores de la membrane utilisée.
  6. Conserver le PNV dans une fiole de verre à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    Remarque : Après un temps de stockage prolongé, le PNV doit être placé dans le bain de sonication à nouveau pendant 15 min en 35 kHz à contourner la formation d’un complexe.

2. in Vitro la Transcription de l’ARNm synthétique

  1. Préparer l’eGFP-encodage ARNm suivant le protocole publié plus tôt34.
  2. Amplifier la séquence eGFP du plasmide avec 0,7 µM de vers l’avant (5'-TTG GAC TDC CGT ACA GAA GCT AAT NOC-3') et inverse (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA CA GAC-3') des amorces et la polymérase kit avec PCR.
    1. Mélanger 20 µL d’une solution de tampon commercial qui modifie le comportement de fusion de l’ADN (Table des matières), ainsi que 20 µL du mélange 5 x de la trousse de la polymérase. Ajouter 7 µL de chaque amorce (avant et arrière).
    2. Ajouter 25 ng de plasmide eGFP pour le mélange et 2 µL de polymérase de la trousse de la polymérase.
      Remarque : Conservez la polymérase sur la glace avant de pipetage il à la solution.
    3. Ajouter exempte de nucléase H2O et le mélange jusqu'à un volume de 100 µL.
    4. Exécuter les cycles de la PCR dans le thermocycleur suivant le protocole dans le tableau 1.
  3. Purifier la séquence d’ADN codant eGFP avec le kit de purification de PCR.
    1. Par conséquent, mélanger la solution PCR avec 500 µL de tampon de liaison de la trousse et utilisez-la pour remplir les colonnes de purification.
    2. Centrifuger les colonnes à vitesse maximum pendant 1 min et éliminer le filtrat.
    3. Ajouter 750 µL de tampon de lavage j’ai à la colonne, centrifuger à nouveau au maximum vitesse pendant 1 min, puis annuler le filtrat.
    4. Répétez l’étape centrifugeuse 1 x pour supprimer le tampon du filtre des colonnes.
    5. Transférer la colonne pour un nouveau tube de 1,5 mL.
    6. Ajouter 20 µL d’exempte de nucléase H2O à la colonne, incuber pendant 1 min et centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale. Répétez cette étape.
    7. Mesurer la concentration de l’ADN avec un photomètre et conserver à-20 ° C.
    8. Effectuer les analyses de qualité d’ADN par électrophorèse sur gel. Ajouter 0,5 g d’agarose dans un tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) et le faire chauffer au micro-ondes à haute température jusqu'à dissolution complète de l’agarose.
    9. Ajouter 5 µL de solution de gel de coloration à l’agarose liquide, remplissez la solution dans le compartiment de gel et attendez que le gel est polymérisé.
    10. Mix 200 ng d’ADN avec 2 µL de 6 x chargement colorant et remplir jusqu'à un volume de fin de 12 µL. pipetter une échelle d’ADN, ainsi que l’échantillon d’ADN, dans les puits du gel et exécutez l’électrophorèse pendant 1 h à 100 V.
    11. Analyser le gel à l’aide d’une station d’analyse de gel sous la lumière UV.
  4. Exécutez la transcription in vitro pour générer des ARNm de la séquence d’ADN avec un kit transcription in vitro contenant polymérase T7 et substituer les nucléotides modifiés de l’UTP et CTP avec Ψ-UTP et méthyl-CTP.
    1. Pour la transcription in vitro , mélanger les ingrédients suivant le tableau 2.
      Remarque : Remplacer 1,5 µL de méthyl-CTP à 01:10 Cy3-CTP dilué en exempte de nucléase H2O pendant la transcription in vitro d’eGFP ARNm pour atteindre Cy3-marquage de l’ARNm.
    2. Incuber le mélange de réaction IVT pendant 4 h à 37 ° C.
    3. Ajouter 1 µL de DNase I par la polymérase T7 kit et il incuber pendant 15 min par 37 ° C à digérer la matrice d’ADN.
  5. Pour purifier les ARNm, utiliser le kit de nettoyage d’ARN.
    1. Remplir le mélange IVT au volume de 100 µL avec exempte de nucléase H2O.
    2. Ajouter 350 µL de tampon de lyse et mélanger par pipetage de haut en bas.
    3. Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % et mélanger à nouveau. Déposer le mélange dans les colonnes de nettoyage.
    4. Centrifuger pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le filtrat.
    5. Ajouter 500 µL de la mémoire tampon de lavage dans une colonne, centrifuger à nouveau pendant 15 s à 8 000 x get enlever le filtrat.
    6. Laver la colonne 1 x avec 500 µL de tampon de lavage et centrifuger pendant 2 min à 8 000 x g.
    7. Déplacer la colonne dans un tube à essais frais de 1,5 mL. Éluer les ARNm 2 x par une incubation de 1 min 20 µL d’exempte de nucléase H2O sur la membrane de la colonne, suivie d’une centrifugation de 1 min à vitesse maximale.
  6. Supprimer les groupes phosphates de l’ARNm en utilisant un kit de déphosphorylation. Ajouter 4,5 µL de tampon de phosphatase x 10 et 1 µL de phosphatase de l’ARNm et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  7. Purifier l’ARNm encore une fois, en suivant les étapes 2.5.1 - 2.5.7.
  8. Mesurer la concertation d’ARNm avec un photomètre.
  9. Électrophorèse sur gel permet d’analyser la pureté et la taille de l’ARNm. Par conséquent, préparer un gel d’agarose comme décrit aux étapes 2.3.9 - 2.3.10.
    1. 3.3 mix µL de formamide, 1 µL de 37 % de formaldéhyde, 1 µL de 10 x hommes et 1,7 µL de 6 x chargement colorant avec 200 ng d’ADN messagère et remplissez-le jusqu'à 10 µL exempte de nucléase H2O pour chaque échantillon et marqueur de RNA.
    2. Incuber le mélange pendant 10 min à 65 ° C, pour dénaturation de l’ARNm. Chargez les puits du gel avec l’ARNm et marqueur de RNA et exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.
    3. Analyser le gel à l’aide d’une station de doc de gel avec lumière UV.

3. la complexation de l’ARNm synthétique

  1. Décongeler l’ARNm synthétique sur la glace, vortex et centrifugeuse peu avant l’ouverture du tube.
  2. Mix 10 µL d’ARNm synthétique (concentration de l’ARNm est 100 ng/µL) avec 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou 20 µL de suspension de la PNL (PNL concentration est de 3 mg/mL). Centrifuger brièvement et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT) pour la formation de nanolipoplex.
    Remarque : Ne pas mélanger de pipetage. Cela peut conduire à la perte de volume. Vortex prochainement pour un mélange intime.
  3. Ajouter 1 mL de milieu cellulaire ordinaire à la nanolipoplexes et mélangez-les en pipettant également de haut en bas.

4. analyse de l’efficacité de l’Encapsulation du Nanoliposomes

  1. Pour effectuer les expériences d’encapsulation, utilisez le kit de quantification ARN.
  2. Préparer la solution de travail en diluant le colorant fluorescent 1 : 200 pour un haut de gamme et 1:2,000 pour un dosage bas de gamme.
    Remarque : Décongeler le colorant fluorescent sur la glace. Préparer la solution de travail directement avant utilisation.
  3. Préparer les courbes standards haut de gamme et bas de gamme, à l’aide de 1 mL d’une solution mère de 2 µg/mL d’eGFP ARNm en exempte de nucléase H2O.
    Remarque : Pour les courbes standards, utilisez l’ARNm qui est utilisés dans les expériences de l’encapsulation.
  4. Utilisez le tableau 3 pour la préparation de la norme haut de gamme (20 ng/mL - 1 µg/mL).
  5. Pour le standard de la gamme basse, diluer l’eGFP 2 µg/mL ARNm solution mère 01:20 pour obtenir une concentration finale de 100 ng/mL. Élaborer une norme de bas de gamme (1 ng/mL - 50 ng/mL) comme décrit dans le tableau 4.
  6. Mélanger 1 µg d’eGFP ARNm (10 µL) et 7,5 µg du PNV (2,5 µL) et incuber pendant 20 min à température ambiante.
    Remarque : Conservez l’ARNm sur la glace pour éviter une dégradation.
  7. Ajouter 1 mL d’exempte de nucléase H2O de forme nanolipoplexes et mix par pipetage de haut en bas.
  8. Ajouter 1 mL de solution 1 : 200 ou 1:2,000 de travail du colorant fluorescent RNA aux normes et échantillons encapsulés et incuber pendant 5 min à la RT dans l’obscurité.
  9. Pipetter, les normes et les échantillons en double dans une plaque à 96 puits noire et mesurer la fluorescence à 530 nm sur un lecteur de microplaques (Figure 3).

5. préparation des cellules pour la Transfection

  1. Plaque de 1,5 x 105 A549 cellules/puits d’une plaque de 12 puits 1D avant la transfection.
  2. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un milieu cellulaire ordinaire (glucose DMEM/haut avec 10 % sérum de veau fœtal [BF], 2 mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine) pendant 24 h avant la transfection.

6. la transfection des cellules

  1. Laver les préparés cellules 1 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).
  2. Ajouter 1 mL de mélange nanolipoplex préparés, contenant 1 µg d’eGFP Qu'arnm encapsulée dans 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou PNV 20 µL, à un puits de la plaque préparée avec des cellules A549.
  3. Ajouter la suspension nanolipoplex aux cellules et incuber pendant 24 h analyser l’efficacité de transfection, ou aux conditions régulières pour 24h et 72 h pour analyser la viabilité cellulaire après la transfection.
    Remarque : Transfection avec le PNV ne nécessite pas un changement médiatique.

7. analyse de l’efficacité de Transfection cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et la microscopie de Fluorescence

  1. Retirez le surnageant et laver les cellules avec 1 mL/bien PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) pour enlever le PNV restants.
  2. Préparer les cellules pour la cytométrie en flux.
    1. Trypsinize les cellules avec 500 µL/puits trypsine/EDTA (0,05 %) à 37 ° C pendant 3 min. arrêt du processus et inactiver la trypsine en ajoutant la même quantité (500 µL/puits) d’ordinaire milieu contenant du FBS.
    2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g et retirer délicatement le surnageant sans toucher le culot cellulaire.
    3. Laver les cellules avec 1 mL de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).
    4. Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de solution de fixation 1 x et les cellules de transfert dans des tubes de cytométrie de flux.
    5. Analyser les cellules à 488 nm dans un cytomètre de flux (Figure 4 a).
      Remarque : Vortex les cellules 1 x directement avant la mesure.
  3. Préparer les cellules pour la microscopie de fluorescence.
    1. Fixer les cellules avec 1 mL/puits 100 % de méthanol, qui a été précédemment stocké à-20 ° C.
    2. Ajouter 500 µL/puits 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phénylindole) dissous dans du PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et incuber pendant 5 min dans le noir.
    3. Enlever la solution DAPI et laver les cellules encore une fois avec 100 % de méthanol stocké à-20 ° C.
    4. Analyser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 4 b).
      Remarque : Utilisez les longueurs d’onde d’excitation/émission suivante : eGFP 488/509 nm, nm DAPI 358/461 et Cy3 550/570 nm.

8. analyse de viabilité de cellules

  1. Dissoudre 5 mg de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dans 1 mL de milieu RPMI (sans rouge de phénol).
    Remarque : Le MTT dissous doit être plus dilué 01:10 (concentration finale : 0,5 mg/mL) en milieu RPMI avant utilisation.
  2. Laver les cellules transfectées 3 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 +/Mg2).
    Remarque : Les restes du milieu cellulaire ordinaire devraient être complètement enlevés.
  3. Ajouter 500 µL/puits de 01:10 solution MTT aux cellules dilué et incuber pendant 4 h à 37 ° C.
  4. Enlever la solution MTT des cellules après incubation et ajouter 500 µL/puits DMSO (diméthyl sulfoxyde). Incuber à nouveau pendant 10 min à 37 ° C.
  5. Dans une plaque de 96 puits clear-fond, déposer la solution DMSO en triolets et mesurer l’adsorption à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  6. La valeur de la viabilité de la cellule non traitée sur 100 % et calculer la viabilité cellulaire des autres groupes en comparaison avec les cellules témoins non traitées (Figure 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

En utilisant le protocole comme décrit, PNV consistant en des lipides DC-cholestérol et DOPE ont été préparés selon la méthode de sec-film (Figure 1). Pendant la préparation, la solution de nanoliposome montre différentes étapes de la turbidité (Figure 2).

L’efficacité de l’encapsulation de la PNV peut ensuite être analysée après l’encapsulation de ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le protocole présenté décrit la génération du PNV avec efficacité d’encapsulation élevée d’ARNm synthétiquement mis à jour le, ainsi que la fiabilité transfection des cellules in vitro. En outre, le PNV garantie la libération des ARNm, qui à son tour, est traduit en une protéine fonctionnelle à l’intérieur des cellules. En outre, les transfections utilisant le PNV peut être effectuée dans un milieu ordinaire cellulaire, résultant en grande viabilité de cellules au cours de la transfecti...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Aucun

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

Références

  1. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
  2. Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
  3. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  4. Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
  5. Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
  6. Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
  7. Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
  8. Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
  9. Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8(2014).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  11. Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
  12. Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  13. Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
  14. Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
  15. Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
  16. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  17. Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
  18. Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
  19. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  20. Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
  21. Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
  22. Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
  23. Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
  24. Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
  25. Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
  26. Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
  27. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
  28. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
  29. Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
  30. Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
  31. Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497(2011).
  32. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  33. Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
  34. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943(2014).
  35. Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
  36. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
  37. Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
  38. Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
  39. Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
  40. Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
  41. Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
  42. Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
  43. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience Reports. 22 (2), 197-224 (2002).
  44. Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
  45. Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
  46. Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
  47. Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
  48. Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
  49. Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
  50. Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
  51. Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
  52. Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
  53. Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
  54. Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
  55. Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
  56. Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
  57. Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
  58. Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504(2015).
  59. Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
  60. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Bio ing nierienum ro 144ARNmnanoliposomesDOPEDC cholest rolencapsulationtransfectionlivraisonth rapeutique

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.