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要約

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA を転写しました。

要約

メッセンジャー RNA (mRNA) の開発-正のため様々 な疾患の治療がより重要になる治療法に基づく体外のプロパティ (IVT) mRNA の転写。IVT mRNA の助けを借りて、ターゲット細胞の生理的状態を変更せず目的タンパク質のde novo合成を誘導することができます。さらに、蛋白質の生合成は、IVT mRNA の一時的な効果により正確に制御できます。

細胞の効率的な遺伝子導入の nanoliposomes (NLps) 治療 mRNA の安全かつ効率的な配信手段があります。本研究では、IVT mRNA の配信ベクトルとして安全かつ効率的なカチオン NLps DC コレステロールと 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine で構成される (ドープ) を生成するプロトコルについて説明します。定義を持つ NLps のサイズ、均一な分布と高錯形成能力とドライ フィルム法を使用して作り出すことができます。また、錯を分析するさまざまなテスト システムを提案し、トランスフェクションの効率、合成を使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) mRNA として細胞生存率に及ぼす影響。全体的にみて、提案するプロトコルは進めるし、治療 mRNA の管理を向上させる可能性のある mRNA の錯形成の効果的かつ安全なアプローチを提供します。

概要

治療への応用のため変更された mRNA の使用は最後の数年間で大きな可能性を示しています。心血管、炎症性、複成火山と疾患だけでなく、ワクチンの開発には、mRNA は有望な治療剤1です。

MRNA とタンパク質補充療法では、ターゲット セル2に DNA トランスフェクションに基づいている古典的な遺伝子療法にいくつかの利点を提供しています。MRNA 関数は、細胞質に直接開始します。プラスミド DNA (pDNA)、二本鎖の構築、円形がプロモーター領域および治療用タンパク質3、細胞質でも行為をエンコードする遺伝子の塩基配列を含む DNA それだけに組み込むことが細胞分裂している細胞トランスフェクション時。これは組織1,4transfected セルの数を減らします。具体的には、心筋細胞などの弱い細胞分裂活性を持つ組織の導入は困難な5です。PDNA と対照をなして、トランスフェクションと mRNA の翻訳は組織1,6の分裂と非分裂細胞で発生します。変異原性、または免疫反応7,8が蛋白質符号化の mRNA、目的タンパク質のde novo合成と細胞のトランスフェクション後、宿主ゲノムへの DNA のウイルスの統合が来るかもしれない9,10を自律的に起動します。さらに、タンパク質合成は、ゲノムと干渉や変異原効果11を危険にさらすことがなく個々 の用量で患者のニーズに正確に調整できます。シチジン、ウリジンの12の代わりに擬似ウリジンと 5'-methylcytidine を使用して総合的に生成された mRNA の免疫活性化の可能性を大幅に下げることができます。擬似ウリジン変更された mRNA は、生物学的安定性と有意に高い翻訳能力13に示されています。

臨床応用における mRNA ベース療法の有望なプロパティから利益を得ることができる、セルに mRNA の輸送に適した車両を作成することが不可欠です。この車必要があります非毒性特性の in vitroとin vivoの負担、ヌクレアーゼ劣化に対する mRNA を保護し、十分な細胞内取り込みは、長期にわたる可用性と14の mRNA の翻訳。

薬物送達など単層カーボンナノ チューブ量子ドットのリポソームは、体内のすべての可能なキャリア タイプの間で後者をされている最も15,16を検討しました。リポソームは、10脂質二分子膜からなる小胞。彼らは、疎水性と親水性部分を持つ両親媒性であり、これらの分子の自己整理、球形の二重層が形成された17。リポソーム、内部治療薬または薬カプセル化でき、したがって、酵素分解18から保護します。N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 塩化物 (DOTMA)19リポソーム [1, 2-ビス (oleoyloxy)-3-(トリメチルアンモニオ-) プロパン] (DOTAP)20、および dioctadecylamidoglycylspermine (犬)21、またはDC コレステロール22、よく特徴があり、DNA または RNA の細胞のトランスフェクションの頻繁に使用されます。

カチオン性リポソームは、正荷電脂質および中性リン脂質23を構成します。カチオン性リポソームによる遺伝子導入細胞24,25に核酸の輸送のための最も一般的な方法であります。カチオン性脂質粒子は、核酸分子26のバックボーンに負荷電の隣酸塩グループと複合体を形成します。これらのいわゆるリポプレックスは細胞膜の表面に添付し、エンドサイトーシス、エンドサイトーシスようなメカニズム27セルを入力します。

1989 年、マローンら。正常にカチオン性脂質を介した mRNA トランスフェクション28をについて説明します。しかし、DOTMA と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ドープ) 混合物を使用すると、グループは、DOTMA が細胞毒性28を明示されることを発見しました。また、Zohraらは、mRNA のトランスフェクション試薬29として DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-トリメチル アンモニウム-プロパン塩化ビニル) を使用できることを示した。ただし、細胞の効率的な遺伝子導入の DOTAP をフィブロネクチン29やドープ30など、その他の試薬との組み合わせで使用してください。これまでのところ、DOTMA は遺伝子配達31用市場で最初のカチオン性脂質です。他脂質治療キャリアとして使用されるまたは、臨床試験のさまざまな段階でテストされている (例えば、EndoTAG-私は、脂質キャリアとして DOTAP を含む)、フェーズ II 臨床試験32で現在調査中です。

この作品は、DC コレステロールと麻薬を含む NLps の世代のプロトコルを説明します。このメソッドを実行するは簡単です、サイズの異なる NLps の生成が可能します。ドライ フィルム法による NLp 世代の一般的な目標は、効率的かつ生体適合性細胞の in vitro14,トランスフェクション33をできるように、mRNA に対するリポソームを作成します。

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プロトコル

1. カチオン性 Nanoliposomes (図 1) の生成

  1. DC コレステロール (3-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) カルバモイルリン] コレステロール塩酸) とドープ (dioleoyl ホスファチジルエタノールアミン) クロロホルム 25 mg/mL の最終的な集中を達成するために、粉末として提供される脂質を溶解します。
    注: 保存-20 ° C で分解された脂質
  2. 両方の脂質の 25 mg/mL 原液で動作します。溶存 DC コレステロールおよび溶存ドープ ガラスのフラスコの中の 80 μ L のミックス 40 μ L。
    注: 総脂質量は 3 mg です。クロロホルムの速い蒸発を避けるためには、ピペッティング時に氷に脂質を配置します。
  3. アルゴン ガス流動場下における 15 分のクロロホルムを蒸発させます。その後、シリカゲルで乾燥器を埋める、内、オープン ガラス フラスコを配置し、残りのクロロホルムを蒸発し、ガラス フラスコ内脂質膜が形成されるかどうかを確認する一晩真空を適用します。
    注: は、高速動作し、不要な O2の接触を避けます。
  4. ヌクレアーゼ フリー水と渦 15 分 (図 2 a) の懸濁液の 1 mL で形成された脂質膜を水分補給します。その後、1 時間 (図 2 b) 超音波浴に懸濁液を配置します。
    注: 懸濁液は少し曇りでしょう。
  5. 製造元の指示に従って小型押出機を組み立てる脂質サスペンションと注射器を記入し、押出機の両側に満たされた注射器と空の注射器を配置します。他、x-懸濁液 (図 2) を押し出すの 25 x 20 に 1 つの注射器から膜脂質懸濁液を押します。
    注: NLps のサイズは、使用される膜の細孔径によって決定されます。
  6. さらに使用するまで 4 ° C でガラスのフラスコに、NLps を格納します。
    注: 長期貯蔵時間の後、NLps によって置かれなければなりません再び 15 分間超音波処理浴の複合体形成を回避するために 35 kHz。

2 合成 mRNA のin Vitro転写。

  1. EGFP エンコード準備 mRNA のプロトコルに従う公開以前34。
  2. 0.7 μ m の前方のプラスミドから eGFP シーケンスを増幅 (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') および逆引き (5'-T120 CTT CTT 法 CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') PCR のプライマーおよびポリメラーゼのキットします。
    1. 20 μ L のポリメラーゼ キットから 5 倍ミックスだけでなく、20 μ L の DNA (材料表) の溶融挙動の変化する商業緩衝液を混ぜます。各 (前方および後方) プライマーの 7 μ L を追加します。
    2. 25 を追加ポリメラーゼ キットから混合物およびポリメラーゼの 2 μ L に eGFP のプラスミッドの ng。
      注意: 氷上ポリメラーゼをソリューションにピペッティングする前に削除します。
    3. ヌクレアーゼ フリー H を追加2O 100 μ L のボリュームまで、混合物に。
    4. 次の表 1にプロトコルたちで PCR のサイクルを実行します。
  3. PCR 精製キットに eGFP エンコーディング dna を浄化します。
    1. したがって、500 μ L のキットから結合バッファーで PCR 溶液を混合、精製列に入力するために使用します。
    2. 1 分の最高の速度で列を遠心分離機、濾液を廃棄します。
    3. 洗浄バッファー列、最大で再び遠心分離に私は 1 分の高速化し、濾液を破棄の 750 μ L を追加します。
    4. 遠心分離機を手順 1 x 列フィルターからバッファーを削除する.
    5. 列を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
    6. ヌクレアーゼ フリー H の 20 μ L を追加2O 列にはインキュベート 1 の最小値と最大速度で 1 分間遠心します。この手順を繰り返します。
    7. 光度計で DNA の濃度を測定し、-20 ° C で保存
    8. ゲル電気泳動による DNA の品質分析を実行します。Tris ホウ酸 EDTA (TBE) バッファーの agarose の 0.5 g を追加し、agarose を完全に溶解するまで強火で電子レンジで熱しなさい。
    9. 液体の agarose のゲル染色液 5 μ L を追加、ゲル室にソリューションを埋める、ゲルの重合まで待ちます。
    10. 染料と塗りつぶしの 12 μ L の端ボリュームまでそれはゲルの井戸に DNA サンプルと同様に、DNA の梯子のピペット、100 V で 1 時間電気泳動を実行ロード x 6 の 2 μ L で DNA のミックス 200 ng。
    11. 紫外線の下でゲル分析ステーションを使用してゲルを分析します。
  4. 含む T7 ポリメラーゼの in vitro転写キットと、dna から mRNA を生成する生体外のトランスクリプションを実行し、Ψ UTP とメチル CTP UTP と CTP の修正されたヌクレオチドを代用します。
    1. 生体外のトランスクリプションのためには、次の表 2材料を混ぜます。
      メモ: 交換 1.5 μ L 1:10 とメチル CTP のヌクレアーゼ フリー H で希釈した Cy3 CTP2O eGFP の生体外のトランスクリプションの間に、mRNA の Cy3 標識を達成するために mRNA。
    2. 37 ° C で 4 h の IVT 反応混合物を孵化させなさい
    3. DNase を 1 μ l 添加 T7 ポリメラーゼからキットし、DNA のテンプレートを消化する 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
  5. MRNA を浄化するには、RNA クリーン アップ キットを使用します。
    1. ヌクレアーゼ フリー H で 100 μ L のボリュームに IVT ミックスを埋める2o.
    2. 上下にピペッティングで 350 μ L の換散バッファーとミックスを追加します。
    3. 100% エタノールの 250 μ L を加え、再度混ぜます。ピペットのクリーンアップ列にミックス。
    4. 15 遠心分離機 x gと濾液破棄 8,000 で s。
    5. 列、15 のために再度遠心分離機に洗浄液 500 μ L を追加 8,000 g、および削除濾液 x で s。
    6. コラム 1 を洗浄洗浄バッファーの 8,000 の x gで 2 分間遠心分離機 500 μ L と x。
    7. 新鮮な 1.5 mL の反応管に列を移動します。溶出が mRNA 2 ヌクレアーゼ フリー H の 20 μ L の 1 分孵化によって x2O 列膜上に続いて最高速度で 1 分遠心分離。
  6. 脱燐酸化キットを使用して mRNA から隣酸塩グループを削除します。MRNA に 10 x ホスファターゼ バッファーの 4.5 μ L とホスファターゼ 1 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
  7. 手順 2.5.1 - 2.5.7 mRNA を再度、浄化します。
  8. MRNA concertation を光度計で測定します。
  9. ゲル電気泳動を使用して、分析、純度および mRNA のサイズ。したがって、手順 2.3.9 - 2.3.10 で agarose のゲルを準備します。
    1. ホルムアミド、37% ホルムアルデヒドの 1 μ L、x の男性、10 の 1 μ L とローディングの染料 200 x 6 の 1.7 μ L ミックス 3.3 μ L mRNA の ng、ヌクレアーゼ フリー H で 10 μ L まで塗りつぶす2O 各サンプルの RNA マーカー。
    2. MRNA の変性の 65 ° C で 10 分間のミックスを孵化させなさい。MRNA RNA マーカーとゲルの井戸を読み込み、100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。
    3. 紫外光を用いたゲル ドック ステーションを使用してゲルを分析します。

3. 合成 mRNA の錯形成

  1. 氷の上の合成の mRNA を解凍渦、それとチューブを開く直前に遠心分離機。
  2. 合成 mRNA のミックス 10 μ L (mRNA 濃度は 100 ng/μ L) 1 μ L、2.5 μ L、5 μ、10 μ L または NLp 懸濁液 20 μ L を (自然言語処理濃度が 3 mg/mL)。簡単に遠心し、室温 (RT) nanolipoplex 形成で 20 分間インキュベートします。
    注: は、ピペッティングにより混在させないでください。これは、ボリュームの損失につながることができます。徹底した混合直後の渦。
  3. Nanolipoplexes に通常細胞培地 1 mL を追加し、上下にピペッティングで混ぜます。

4. Nanoliposomes のカプセル化効率の解析

  1. カプセル化の実験を実行するには、RNA 定量キットを使用します。
  2. 高範囲の蛍光染料レバレッジと低域の試金のための 1:2,000 を希釈して、実用的なソリューションを準備します。
    注: は、氷の上の蛍光染料を解凍します。使用する前に直接作業ソリューションを準備します。
  3. EGFP の 2 μ g/mL の原液 1 mL を使って高域と低域の標準曲線を準備 mRNA ヌクレアーゼ フリー H2o.
    注: 標準の曲線では、カプセル化の実験で使用される mRNA を使用します。
  4. 高範囲標準 (20 ng/mL の-1 μ g/mL) の準備のため表 3を使用します。
  5. 低範囲の標準は、mRNA 原液 1:20 100 ng/mL の最終的な集中を達成するために 2 μ G/ml eGFP を薄くしなさい。表 4で説明されているように低範囲標準 (1 ng/mL の-50 ng/mL) を準備します。
  6. EGFP の 1 μ g を組み合わせる mRNA (10 μ L) と NLps の 7.5 μ g (2.5 μ L) ルートで 20 分間インキュベートし、
    注意: 劣化を避けるために氷の上 mRNA。
  7. ヌクレアーゼ フリー H の 1 mL を追加フォーム nanolipoplexes と上下にピペッティングしてミックスする2O.
  8. 1: 200 の 1 mL を追加または 1:2,000 RNA の蛍光染料のカプセル化されたサンプルおよび標準に取り組んで解決策と暗闇の中で室温で 5 分間インキュベートします。
  9. 黒 96 ウェル プレートにピペットの標準および重複のサンプルと 530 で蛍光を測定マイクロ プレート リーダー (図 3) の nm。

5. セルの Transfection のための準備

  1. プレート 1.5 x 105 12 ウェル プレート トランスフェクション前に 1 d の A549 細胞/ウェル。
  2. 37 ° C、5% CO2通常細胞用培地 (10% 牛胎児血清 [売却]、2 mM L-グルタミン 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM/高血糖) で細胞をトランスフェクション前に 24 h にインキュベートします。

6. 細胞のトランスフェクション

  1. 洗って準備 1 mL/ウェル PBS で 1 x を細胞 (Ca なし2 +/Mg2 +)。
  2. 準備された nanolipoplex の混合物の 1 つの mL を追加、eGFP の 1 μ g を含む mRNA は、1 μ L、2.5 μ L、5 μ、10 μ L、または A549 細胞を準備板の 1 つに、20 μ L NLps にカプセル化されます。
  3. セルに nanolipoplex 懸濁液を追加し、正規条件トランスフェクション効率を分析する 24 h や 24 h、トランスフェクション後の細胞生存率を分析する 72 時間インキュベートします。
    注: NLps のトランスフェクションでは、媒体の変更は必要ありません。

7. 細胞トランスフェクション性フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いた解析

  1. 上澄みを除去し洗浄を 1 ml/残り NLps を削除する (なし Ca2 +/Mg2 +) PBS をよきます。
  2. フローサイトメトリー用セルを準備します。
    1. Trypsinize 500 μ L/ウェル トリプシン/edta (0.05%) 3 分停止の 37 ° C で細胞プロセス、通常の FBS を含む媒体の同じ量 (500 μ L/ウェル) を追加することによって、トリプシンを不活化します。
    2. 400 × gで 5 分間細胞を遠心し、細胞ペレットを触れることがなく上澄みを慎重に取り外します。
    3. 1 ml の PBS のセルを洗浄 (Ca なし2 +/Mg2 +)。
    4. 1 x 固定の解決の 300 μ L で細胞を再懸濁し、流れ cytometry チューブにセルを転送します。
    5. 488 で細胞を分析 (図 4 a) 流れの cytometer で nm。
      注: 渦を測定する前に x を直接セル 1。
  3. 蛍光顕微鏡用細胞を準備します。
    1. -20 ° C で保存しておいた 1 mL/よく 100% メタノールは、セルを修復します。
    2. 追加 500 μ L/ウェル 300 nM DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (せずに Ca2 +/Mg2 +) PBS に溶解し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。
    3. DAPI のソリューションを削除し、セルを洗浄して再び-20 ° C で保存されている 100% メタノール
    4. 蛍光顕微鏡 (図 4 b) を使用してセルを分析します。
      注: を使用して、次の励起/蛍光波長: eGFP 488/509 nm、DAPI 358/461 nm、Cy3 550/570 nm。

8. セル実行可能性の試金

  1. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 5 mg を RPMI (なし) 1 mL に溶かしてください。
    注: 溶存 MTT 必要がありますさらに希釈 1:10 (最終濃度: 0.5 mg/mL) 使用前に RPMI で。
  2. 洗浄 transfected セル 3 x 1 mL/ウェル PBS (Ca2 +/Mg2) なし。
    注: 通常のセル中のまま完全に削除してください。
  3. 1:10 の 500 μ L/ウェルの細胞に MTT ソリューションを希釈し、37 ° C で 4 時間インキュベートを追加します。
  4. 培養後、細胞から MTT ソリューションを削除し、500 μ L/ウェル DMSO (ジメチルスルホキシド) を追加します。再び 37 ° C で 10 分間インキュベートします。
  5. 540 で吸着を行いクリア下 96 ウェル プレートに三つ子の DMSO 溶液をピペット nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。
  6. 未処理細胞の生存率を 100% に設定し、無処理細胞 (図 5) と比較すると他のグループの細胞生存率を計算します。

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結果

前述のプロトコルを使用して、DC コレステロールおよびドープ脂質から成る NLps ドライ フィルム法 (図 1) を使用してを調製しました。準備中、nanoliposome ソリューションは、濁度 (図 2) のさまざまな段階を示しています。

NLps のカプセル化の効果は、無料 RNA 定量キット (

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ディスカッション

提案するプロトコルでは、総合的に変更された mrna は、高い封止効果 NLps の世代だけでなく、細胞の in vitroの信頼性の高いトランスフェクションをについて説明します。また、NLps mRNA は、ターンでは、細胞内タンパク質に翻訳はのリリースを保証します。さらに、NLps を使用して transfections 通常細胞培地で行うことが、高の結果セルの目をトランスフェクション効率を促進し、最後ト?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

どれも

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)AppliChem, Darmstadt, GermanyA2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol)Avanti, Alabama, USA700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyD1306
BD FACScan systemBD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x)BD Biosciences, Heidelberg, Germany340181
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti, Alabama, USA850725
Fluorescence microscopeZeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11668019
Mini extruderAvanti, Alabama, USA
Nuclease-free waterQiagen, Hilden, Germany129114
Opti-MemThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyQ33140
RPMI (w/o phenol red)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany11835030
Silica gelCarl Roth, Karlsruhe, GermanyP077
Trypsin/EDTA (0.05%)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany25300054
HotStar HiFidelity Polymerase KitQiagen, Hilden, Germany202602
QIAquick PCR Purification KitQiagen, Hilden, Germany28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies, San Diego, USAN-1014
Cyanine 3-CTPPerkinElmer, Baesweiler, GermanyNEL580001EA
RNeasy Mini KitQiagen, Hilden, Germany74104
MEGAscript T7 Transcription KitThermo Fisher Scientific, Darmstadt, GermanyAM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNew England Biolabs, Ipswich, USAS1411L
Antarctic PhosphataseNew England Biolabs, Ipswich, USAM0289S
AgaroseThermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany16500-500
GelRedBiotium, Fremont, USA41003
peqGOLD DNA ladder mixVWR, Pennsylvania, USA25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladderFisher Scientific, Göteborg,
Sweden		11528766

参考文献

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