التصور للهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ

Yuji Watanabe; Chie Sakuma; Hiroyuki Yaginuma

doi:10.3791/58506

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف لنا طرق وضع العلامات الفلورية عرضية ترحيل الخلايا انهانسر، ولتصوير الوقت الفاصل بين حركة خلية مسماة في ثقافة مسطحة-جبل من أجل تصور ترحيل الخلية السلوك في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ .

Abstract

الوقت الفاصل بين التصوير وسيلة قوية لتحليل سلوك الخلية ترحيل. بعد خلية الفلورسنت وسم، يمكن أن تسجل حركة الخلايا المسماة في الثقافة تحت المجهر الفيديو. لتحليل الهجرة الخلية في الدماغ، ثقافة شريحة يستخدم عادة لمراقبة الهجرة الخلية موازية للمقطع شريحة، مثل الهجرة الخلية شعاعي. ومع ذلك، يمكن الحصول على معلومات محدودة من أسلوب ثقافة شريحة لتحليل الهجرة الخلية عمودي إلى قسم الشريحة، مثل الهجرة الخلية عرضية. نقدم هنا، البروتوكولات للوقت الفاصل بين التصوير لتصور الهجرة الخلية عرضية في تيكتوم الألياف الضوئية النامية في الفرخ. مزيج من وسم الخلية انهانسر في ovo وثقافة مسطحة-جبل لاحقة على إدراج الثقافة الخلية تمكن من كشف ترحيل حركة الخلية في الطائرة الأفقي. وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب يسهل الكشف عن سلوك الخلية الفردية والعمل الجماعي لمجموعة من الخلايا على المدى الطويل. يمكن تطبيق هذا الأسلوب يحتمل أن تكون للكشف عن تغيير متسلسلة المسمى فلوري-البنية الصغرى، بما في ذلك استطالة محواري في تشريد الأنسجة أو الخلايا العصبية في الأنسجة غير العصبية.

Introduction

دراسة الهجرة الخلية تحرز تقدما مع تقدم تقنية التصوير الحي. بعد خلية الفلورسنت وسم، يمكن أن تسجل حركة الزمانية للخلايا المسماة في صحن الثقافة أو في فيفو تحت المجهر الفيديو. في دراسة التنمية العصبية، تم تحليل التغيرات المورفولوجية لترحيل الخلايا أو التمطيط محاور عصبية استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. للتصوير بفعالية، من الضروري لتطبيق أسلوب مناسب لإعداد وضع العلامات وأنسجة الخلية الفلورسنت، استناداً إلى الغرض من التجربة والتحليل. لتحليل الهجرة الخلية في الدماغ، ثقافة شريحة تستخدم عادة لمراقبة الهجرة الخلية موازية للمقطع شريحة، مثل خلية شعاعي الهجرة¹^،^،من²³. كما يستخدم النظام ثقافة شريحة للكشف عن خلية عرضية الهجرة⁴^،⁵، ولكن أنها ليست مناسبة لتحليل الاتجاهات في الحالات حيث تفريق الخلايا عمودي إلى المقطع شريحة.

ويتألف من بنية متعددة الطبقات، التي شكلتها الهجرة الخلية شعاعي وعرضية أثناء التطور الجنيني تكتم الألياف البصرية. تشكيل طبقة تيكتال يعتمد أساسا على الهجرة شعاعي من الخلايا السليفة العصبية بوستميتوتيك في منطقة البطين، ووجهتهم النهائية في الطبقات التي ترتبط بتاريخ الولادة في منطقة البطين⁶. أما بالنسبة للهجرة عرضية، أبلغنا سابقا اثنان تيارات الهجرات في الطبقات المتوسطة وسطحية في تيكتوم بصرية فرخ النامي. في الطبقات المتوسطة خلال E6-E8، تهاجر الخلايا القطبية الثنائية مع عملية طويلة رائدة وعملية زائدة رقيقة دورسالي أو بطنيا على طول فاسسيكولوس إكسون لمحاور عصبية ناقل تيكتال التي يتم تشغيلها دورسو بطنيا⁷. بعد الهجرة أكسوفيليك، وهذا التفريق بين الخلايا في الخلايا العصبية متعدد الأقطاب الموجودة في الطبقات العميقة. في الطبقات السطحية خلال E7-E14، تفريق الخلايا المهاجرة أفقياً بإصلاح عملية الرائدة تشعبت ومبعثر في عدة اتجاهات⁸. بعد تفريق الهجرة، تفرق خلايا هذه الأخيرة في نهاية المطاف في الخلايا العصبية سطحية من مورفولوجيس مختلفة. وفي كلتا الحالتين، ثقافة مسطحة-جبل تتسم بالكفاءة لمراقبة حركة الخلية موازيا للسطح بيل.

نقدم هنا، بروتوكولا للوقت الفاصل بين التصوير لتصور الهجرة الخلية عرضية في تكتم الألياف البصرية الفرخ النامي⁷^،⁸. مزيج من وسم الخلية انهانسر في ovo، وثقافة مسطحة-جبل لاحقة على إدراج الثقافة الخلية تمكن من كشف خلية ترحيل اتجاه حركة التنقل والهجرة. والهدف من هذا الأسلوب تيسير الكشف عن سلوك الخلية الفردية على حد سواء في الأجل الطويل والعمل الجماعي لمجموعة من الخلايا في الطائرة الأفقي.

Protocol

1. انهانسر في Ovo

تحضير التعبير بلازميد الحمض النووي للعلامات الفلورية في تركيزات عالية. عزل الحمض النووي من 200 مل ثقافة البكتيرية بواسطة الأسلوب تحلل القلوية باستخدام أعمدة شاردة-الصرف وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد). مزيج بكاجس-اجفب وبكاجس-متشيرينوك بتركيز 4 ميكروغرام/ميليلتر كل نهائي.
ملاحظة: قد تكون خالية من الذيفان تنقية الحمض النووي بلازميد المفضل انهانسر.
احتضان بيض الدجاج خصبة أفقياً في 38 درجة مئوية في الرطوبة النسبية 70%.
بعد يومين، القضاء على 5 مل الزلال (البيض) من الجانب أشار البيض باستخدام محقنة 20 مل مع إبرة قياس 18 وختم ثقب الإبرة مع الشريط.
قص الجزء العلوي من وعاء البيض مع مقص منحنى لفتح ثقب 2 سم في القطر وتحقق مرحلة النمو للجنين تحت ستيريوميكروسكوبي (المرحلة 17 من همبرغر وهاملتون⁹). ختم حفرة مرة أخرى مع الشريط.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في أي وقت أثناء E2.5-E3.0. خطوات 1.3 و 1.4 أدنى مستوى للجنين في البيضة تجنب ارتباط ضيق الجنين المتنامي والأوعية الدموية بشل الأعلى.
تستمر الحضانة حتى E5.5.
قبل انهانسر، إعداد 10 ميليلتر من المذكورة بلازميد الحمض النووي الملونة مع 0.5 ميليلتر سريعة الخضراء (25 ملغ/مل)، 10 مل فوسفات يعقم مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على بنسلين (100 وحدة/مل) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، وميكروبيبيتيس من أنابيب شعرية زجاجية باستخدام معالج ميكروبيبيتي. قص طرف القاصي ميكروبيبيتي جعل حجم مناسب من مسام اعتماداً على مقدار الحمض النووي للحقن.
قص شل الأعلى مختومة بالمقص فتح حفرة قطرها 2.5 سم وتعيين البيض ستابلي تحت المجهر ستيريو. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني في البيض. تقشر الغشاء الانتويك الذي يغطي الجنين دون نزيف استخدام الملقط غرامة اثنين. إزالة في amnion من رأس الجنين.
حين تحول رأسه ميكروسباتولا، حقن 0.1-1 ميكروليتر من الحمض النووي الملونة في تجويف البطين tectum الألياف البصرية الأيسر استخدام ميكروبيبيتي متصل بأنبوب شفط.
ملاحظة: كمية الحمض النووي حقن يعتمد على غرض التجربة. ينبغي أن يتركز الحمض النووي الحل بالوعة ونعلق على طول الجدار البطين.
وضع زوج من أقطاب فورسيب من نوع (أقطاب 3 مم مربع بمسافة 7 مم) حيث وضعت المنطقة المستهدفة من تيكتوميس الألياف البصرية بين (الشكل 1، الخطوة 1).
ملاحظة: هو الحمض النووي اليكتروبوراتيد إلى جانب اﻷنود.
المسؤول عن نبض قبل 30 الخامس، 1 مللي ثانية مع فاصل زمني يبلغ 5 مللي ثانية والبقول اللاحقة أربعة من 6 الخامس، 5 مللي ثانية مع فاصل 10 مللي ثانية، استخدام مولد النبض.
ملاحظة: الشرط الإلكترونية يعتمد على الحجم والمسافة من أقطاب كهربائية. ينبغي أن تكون قوية بما يكفي لتحقيق كفاءة تعداء، ولكن يجب أن يكون متواضعا ما يكفي لضمان التطور الطبيعي للأنسجة المستهدفة.
ختم الحفرة مع الشريط وتستمر الحضانة. نقع الأقطاب في برنامج تلفزيوني لإزالة بياضه مع فرشاة انتردنتال في صحن بلاستيك. كرر 1.7 1.11 لكل بيضة.

2-جبل مسطحة الثقافة على إدراج خلية

إعداد ثقافة مسطحة-جبل، قبل يوم واحد من إدراج الثقافة المغلفة الخلية. تعويم بعض إدراج ثقافة الخلية في الماء المقطر يعقم في طبق ثقافة خلية 10 سم. تحميل حل 8 ميكروغرام/مل laminin و 80 ميكروغرام/مل بولي-L-يسين لتغطية إدراج وترك إدراج مالها المطروح للاكتتاب في حاضنة الثقافة CO₂ الخلية عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: اليوم التالي، إدراج المغلفة يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية.
في يوم الثقافة في E7.0، إزالة الحل لامينين-بولي-L-يسين من الإدراج ووضع الإدراج في زجاج أسفل طبق (الشكل 1، والخطوة 2) مليئة 1.1 مل من الثقافة المتوسطة (المتوسطة المصل انخفاض نسبة 60%، 20% F12، 10% مصل بقرى الجنين، 10 % الفرخ المصل، 50 وحدة/مل البنسلين، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين). يبقى الطبق في خلية ثقافة CO₂ الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استخدام المتوسط طوال فترة الثقافة لمدة ثلاثة أيام دون تغيير.
إعداد إعداد الثقافة. تعيين وحدة دائرة رطبة مجهر مقلوب [كنفوكل] مع تدفق غاز 40% س₂ و 5% CO₂(المراقب المالي (الغاز) في 38 درجة مئوية (درجة الحرارة).
قطع رأس الجنين بالمقص. قرصه يخرج مع الملقط إلى حل "متوازن الملح" هانكس المثلج (هبس) في صحن ثقافة خلية 6-سم.
عزل تكتم الألياف البصرية اليكتروبوراتيد استخدام الملقط غرامة اثنين. نقل تيكتوم مع بقطاره بلاستيك إلى آخر طبق مليئة هبس المثلج. استخدام الطبق الزجاج concaved أساس مع سيليكون أسود كالصحن لعدة قطاعات.
التحقق من وضع العلامات تحت المجهر مجسمة الأسفار. قطع الأنسجة تيكتال المحيطة بالمنطقة وضع العلامات بسكين ميكروسورجيكال. تأكد من اتجاه الأنسجة في تكتم (الأمامي الخلفي، الظهرية البطني).
نقل الأنسجة المسمى مع قطارة بلاستيك للإدراج ذلك الجانب بيا ترتبط insert. وضع الأنسجة تيكتال في الاتجاه المطلوب وإزالة هبس الزائد (الشكل 1، والخطوة 2).
كرر إدراج 2.4-2.7 بغية إعداد الأنسجة الأخرى على نفس. ضع الطبق في قاعة بريوارميد في المجهر المقلوب [كنفوكل] (الشكل 1، والخطوة 3).

3-الوقت الفاصل بين التصوير

التحقق من العلامات الفلورية وتركز مجال المجهرية في المجهر المقلوب [كنفوكل]. بدء تشغيل الوحدات [كنفوكل] ليزر وحاول أخذ عينات الفحص [كنفوكل] لضبط اتجاه وموقف من الأنسجة على طول X والمحور y في الميدان. استخدام 10 X أو X 20 الهدف العدسة دون زيت الغمر.
حدد حجم المسح (مثلاً 512 × 512 نقطة في البوصة). تحديد الفاصل الزمني ونطاق مجموع المسح [كنفوكل] على طول محور ع. تأخذ فاصل 5 أو 10 ميكرون لنطاق 100 ميكرومتر. تحديد الفاصل الزمني لتصوير [كنفوكل] ومجموعة التصوير المدة (مثلاً، 10 دقيقة فترات أكثر من 48 ساعة).
ملاحظة: لتجنب الليزر الضيائية، تمنع المسح الضوئي في حجم المسح الضوئي عالية مع z-فترات قصيرة لنطاق z طويلة أو فترات زمنية قصيرة خلال مدة طويلة من التصوير. على سبيل المثال، عند تطبيق حجم مسح عالية (مثل 1024 × 1024 نقطة في البوصة)، إنقاص عدد الأشعة على طول محور ع.
مجموعة المعلمات للتشغيل [كنفوكل] البرنامج المبين في 3.2 وبدء التصوير.
وبعد التصوير، الجمع بين الصور [كنفوكل] في محور ع مختلفة لتوفير صور z-مكدس مع تعديل تنسيق غرامة عند كل نقطة في الوقت.
إلحاق الصور z-مكدس نقطة الوقت مختلفة وبناء فيلم مرور الزمن في شكل AVI.

النتائج

ويبين الشكل 2 الهجرة عرضية سطحية تصور في ثقافة مسطحة يشن في وقت المنقضي (0، 9، 18، ح 27) بعد بداية التسجيل. فيلم 1 فيلم الوقت الفاصل بين 10 دقيقة--الفترات الزمنية خلال فترة 28 ساعة و 50 دقيقة. الإطار المحدد للتركيز على الخلايا المهاجرة من المسمى ا?...

Discussion

البروتوكول هو موضح أعلاه هو الأمثل للكشف عن الهجرة الخلية في الطبقات السطحية⁶^،⁸. كان قابلاً للكشف عن الطبقة الوسطى الهجرة تيارات (فيلم 5)⁶^،⁷، فقط عن طريق تحويل توقيت انهانسر (E5.5 إلى E4.5) وظهور ثقافة والتصوير (E7....

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

هذا العمل وأيده عدد المنح كاكينهي JSPS 15 ك 06740 إلى Y.W.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300

References

Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 tectum

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: