Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Methoden für die fluoreszierenden Kennzeichnung von tangential Migration Zellen durch Elektroporation und für Zeitraffer-Aufnahmen von der markierten Zelle Bewegung in einer Wohnung-Mount-Kultur um die Migration zu visualisieren Zelle Verhalten in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum .

Zusammenfassung

Zeitraffer-Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode, wandernde Zelle Verhalten zu analysieren. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die Bewegung der markierten Zellen in Kultur unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, ist Stück Kultur verbreitet Zellwanderung parallel zum Abschnitt Slice wie radial Zellwanderung beobachten. Die Slice-Kultur-Methode Zellwanderung senkrecht zur Scheibe Abschnitt, z. B. tangentiale Zellwanderung analysieren kann jedoch nur begrenzte Informationen einzuholen. Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken optic Tectum. Eine Kombination aus Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovo und eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht eine Erfassung der wandernde Zelle Bewegung in der horizontalen Ebene. Darüber hinaus ermöglicht unsere Methode Erkennung der einzelnen Zelle Verhalten und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen auf lange Sicht. Diese Methode kann potenziell angewendet werden, um die sequenzielle Änderung der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Mikro-Struktur, einschließlich der axonalen Dehnung in die neuronale Gewebe oder Zellen Verschiebung im nicht-neuronale Gewebe zu erkennen.

Einleitung

Mit der fortschreitenden Technik live Imaging hat das Studium der Zellmigration voran. Nach fluoreszierende Zelle beschriften kann die zeitliche Bewegung der markierten Zellen in einer Kulturschale oder in Vivo unter Videomikroskopie aufgezeichnet werden. In der Studie der neuronalen Entwicklung wurden die morphologische Veränderungen der Zellen migrieren oder verlängern Axone mit Zeitraffer Bildgebung analysiert. Für effektive Belichtung ist es wichtig, eine geeignete Methode für fluoreszierende Zelle Kennzeichnung und Gewebe Zubereitung, basierend auf dem Zweck des Experiments und Analyse anwenden. Für die Analyse der Zellwanderung in das sich entwickelnde Gehirn, wurde Slice Kultur allgemein zur Zellwanderung parallel zur Scheibe Abschnitt, z. B. radial Zelle Migration^1,2,3beobachten. Die Slice-Kultur-System dient auch zur Erkennung von tangentialen Zelle Migration^4,5, aber es ist nicht geeignet für die gerichtete Analyse in Fällen, wo die Zellen senkrecht zum Abschnitt Slice zerstreuen.

Die optic Tectum besteht aus einer vielschichtigen Struktur, gebildet durch radial und tangential Zellwanderung während der Embryonalentwicklung. Tectal Schichtausbildung hängt vor allem von radialen Migration der postmitotischen neuronalen Vorläuferzellen aus der ventrikulären Zone, und ihren endgültigen Bestimmungsort in den Schichten korreliert mit ihr Geburtsdatum in der ventrikulären Zone⁶. Für tangentiale Migration berichteten wir bereits zwei Ströme von Migrationen in den mittleren und oberflächlichen Schichten in einem entwickelnden Küken optic Tectum. In den mittleren Schichten während E6-E8 migrieren die bipolaren Zellen mit eine lange führende Prozess- und einen dünnen nachgestellten Prozess dorsal oder ventral entlang den Axon Fasciculus tectal ableitenden Axone, die dorsal-ventral⁷ausgeführt. Nach dieser Axophilic Migration differenzieren die Zellen multipolare Nervenzellen befindet sich in den tieferen Hautschichten. In den oberflächlichen Schichten während E7-E14 zerstreuen die Migration von Zellen horizontal durch eine verzweigte führende Prozess- und Streuung in mehrere Richtungen⁸zu reformieren. Nach der Migration zu dispergieren, differenzieren die letzteren Zellen schließlich oberflächliche Neuronen von verschiedenen Morphologien. In beiden Fällen ist eine Wohnung-Mount Kultur effizient, Zelle Bewegung parallel zur pial Oberfläche zu beobachten.

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-imaging zu visualisieren, tangentiale Zellwanderung in Entwicklungsländern Küken optic Tectum^7,,⁸. Kombination von Zelle Kennzeichnung durch Elektroporation in Ovound eine anschließende Wohnung-Mount-Kultur auf dem Handy-Kultur-Einsatz ermöglicht Richtungserkennung wandernde Zelle Bewegung und Migration. Das Ziel dieser Methode ist es, Aufdeckung von sowohl einzelnen Zelle Verhalten langfristig und die kollektive Aktion einer Gruppe von Zellen in der horizontalen Ebene zu erleichtern.

Protokoll

1. Electroporation In Ovo

1. Bereiten Sie vor, dass der Ausdruck Plasmid DNA fluoreszierende Kennzeichnung in hoher Konzentration. Isolieren Sie DNA aus 200 mL Bakterienkultur von der alkalischen Lyse-Methode mit Anionen-Austausch Spalten entsprechend des Herstellers Protokoll (Table of Materials). Mischen Sie pCAGGS-EGFP und pCAGGS-mCherryNuc auf eine Endkonzentration von 4 µg/µL.
   Hinweis: Endotoxin-freie Plasmid DNA Reinigung möglicherweise für die Elektroporation bevorzugt.
2. Inkubieren Sie fruchtbaren Hühnereier horizontal bei 38 ° C 70 % Relative Luftfeuchtigkeit.
3. Nach 2,5 Tagen 5 mL Albumin (Eiweiß) aus der Spitzen Seite des Eies mit 20 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel zu eliminieren und die Nadelloch mit Klebeband abdichten.
4. Schneiden Sie die Spitze des die Eierschale mit gebogenen Schere zu öffnen ein Loch 2 cm im Durchmesser und überprüfen das Entwicklungsstadium des Embryos unter dem Stereomikroskop (17. Etappe von Hamburger und Hamilton⁹). Das Loch wieder mit Klebeband abdichten.
   Hinweis: Dieser Schritt kann jederzeit während der E2.5-E3.0 ausgeführt werden. 1.3 und 1.4 Schritte reduzieren Sie die Lautstärke des Embryos im Ei, eine enge Bindung des wachsenden Embryos und die Blutgefäße an der Oberschale zu vermeiden.
5. Weiter Inkubation bis E5.5.
6. Bereiten Sie vor, bevor Elektroporation 10 µL der genannten Plasmid DNA gefärbt mit 0,5 µL schnell grün (25 mg/mL), 10 mL autoklaviert Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Penicillin (100 Einheiten/mL) und Streptomycin (100 μg/mL) und Mikropipetten hergestellt aus Glas-Kapillare mit einer Mikropipette Prozessor. Schneiden Sie die distalen Spitze der Mikropipette eine geeignete Größe der Poren abhängig von der Menge der DNA für die Injektion zu machen.
7. Schneiden Sie die versiegelte Oberschale mit einer Schere zu öffnen ein Loch 2,5 cm im Durchmesser und legen Sie das Ei stabil unter dem Stereo-Mikroskop. Fügen Sie ein paar Tropfen PBS in die Eizelle. Die Viruswenig Membran, die den Embryo ohne Blutung mit zwei feinen Pinzette abziehen. Entfernen Sie das Amnion vom Kopf des Embryos.
8. Beim Drehen des Kopfes mit einer Microspatula, injizieren 0,1-1 μL der farbigen DNA in den linksventrikulären Hohlraum der linken optic Tectum mit einer Mikropipette an einen Saugschlauch angeschlossen.
   Hinweis: Die Menge an DNA injiziert hängt vom Zweck des Experiments. Konzentrierte DNA-Lösung sollte sinken und entlang der Ventrikelwand befestigen.
9. Legen Sie ein paar Forcep-Art Elektroden (3 mm quadratisch Elektroden mit 7 mm Abstand), so dass das Zielgebiet des optischen Tectumis zwischen (Abbildung 1Schritt 1) platziert.
   Hinweis: Die DNA ist elektroporiert auf der Anodenseite.
10. Laden Sie einen Pre-Puls von 30 V, 1 ms mit einem Intervall von 5 ms und vier nachfolgenden Impulse von 6 V, 5 ms mit einem Intervall von 10 ms mit dem Pulsgenerator.
    Hinweis: Die elektronischen Zustand richtet sich nach der Größe und Abstand der Elektroden. Es sollte stark genug sein, effiziente Transfektion zu erreichen muss, es jedoch bescheiden genug, um die normale Entwicklung der Zielgewebe zu gewährleisten.
11. Das Loch mit Klebeband abdichten und weiter Inkubation. Genießen Sie die Elektroden in PBS, Eiweiss mit einer Interdentalbürste in einer Plastikschale zu entfernen. Wiederholen Sie 1.7-1.11 für jedes Ei.

2. Wohnung-Mount-Kultur auf die Zelle einfügen

1. Bereiten Sie einen Tag vor der Wohnung-Mount-Kultur, die beschichteten Zelle Kultur einfügen. Schwimmen Sie einige Zelle Kultur Einsätze auf dem autoklaviert destilliertes Wasser in der Kulturschale 10-cm-Zelle. Eine Lösung von 8 µg/mL Laminin und 80 µg/mL Poly-L-Lysin zur Deckung der Einsätze und lassen die gefloateten Einsätze in der Zelle Kultur CO₂ Inkubator bei 37 ° C über Nacht zu laden.
   Hinweis: Am nächsten Tag können die beschichteten Wendeschneidplatten bei 4 ° c gespeichert werden
2. Am Tag der Kultur an E7.0 entfernen Sie die Laminin-Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Einfügen und platzieren Sie die Einlage in eine untere Glasschale (Abbildung 1Schritt2) gefüllt mit 1,1 mL Kulturmedium (60 % reduzierte Serum Mittel, 20 % F12, 10 % fötalen Rinderserum, 10 % Küken Serum, 50 Einheiten/mL Penicillin, 50 μg/mL Streptomycin). Halten Sie die Schüssel in die Zelle Kultur CO₂ Inkubator bei 37 ° C.
   Hinweis: Das Medium kann während der gesamten Kultur drei Tage lang ohne Änderung verwendet werden.
3. Bereiten Sie das Kultur-Setup. Legen Sie eine feuchte Kammer-Einheit auf eine invertierte confocal Mikroskop mit einem Gasstrom von 40 % O₂ und 5 % CO₂ (Gas-Controller) bei 38 ° C (Temperatur-Controller).
4. Durchschneiden Sie der Kopf des Embryos mit einer Schere. Kneifen Sie begeben Sie sich mit der Zange in die eiskalte Hanks' Balanced Salzlösung (HBSS) in der Kulturschale 6-cm-Zelle.
5. Isolieren der elektroporiert optic Tectum mit zwei feinen Pinzette. Übertragen der Tectum mit einer Pipette aus Kunststoff in einer anderen Schüssel mit eiskaltem HBSS gefüllt. Verwenden Sie die konkave Glasschale Sitz mit schwarzem Silikon als Unterteller für das Schneiden.
6. Überprüfen Sie die Position der Beschriftung unter dem Fluoreszenz stereoskopische Mikroskop. Das tectal Gewebe der Kennzeichnung Umgebung mit einem mikrochirurgischen Messer ausschneiden. Stellen Sie sicher die Richtung des Gewebes in der Tectum (anterior-Posterior, dorsal-Ventral).
7. Übertragen Sie das beschriftete Gewebe mit einer Kunststoff-Pipette auf den Einsatz, so dass die Pia-Seite auf den Einsatz angebracht ist. Legen Sie das tectal Gewebe in die gewünschte Richtung zu und entfernen Sie überschüssige HBSS (Abbildung 1Schritt2).
8. Wiederholen Sie 2,4 bis 2,7 zur anderen Geweben auf der gleichen Vorbereitung einfügen. Legen Sie die Schale in die vorgewärmte Kammer in der invertierten confocal Mikroskop (Abbildung 1Schritt 3).

3. Time-Lapse Imaging

1. Die fluoreszierende Etikettierung zu überprüfen und das Gesichtsfeld in der invertierten confocal Mikroskop konzentrieren. Starten Sie die konfokale Laser-Einheiten und versuchen Sie, probieren die konfokalen Scan um die Richtung und Position des Gewebes entlang der X- und Y-Achse im Bereich anzupassen. Verwenden Sie die 10 X oder 20 X Objektiv ohne Immersionsöl.
2. Wählen Sie die Scan-Größe (z. B. 512 x 512 dpi). Entscheiden Sie das Intervall und die Gesamtreichweite des konfokalen Scans entlang der z-Achse. Nehmen Sie eine 5 oder 10 µm-Intervall für den 100 µm-Bereich. Bestimmen Sie das Zeitintervall für die konfokale Bildgebung und Total imaging-Dauer (z. B. 10 min Abständen über 48 h).
   Hinweis: Zur Vermeidung von Laser Phototoxizität verbieten Sie Scannen in der hohe Scan-Größe mit kurzen Z-Intervalle für die Z-Langstrecken oder mit kurzen Zeitintervallen während der langen bildgebenden Dauer. Beispielsweise wenn Sie eine hohe Scan-Größe (z. B. 1024 X 1024 dpi) anwenden, verringern Sie die Anzahl der Scans entlang der z-Achse.
3. Satz, die Parameter der konfokalen laufendem Programm gemäß 3.2 und starten Sie imaging.
4. Nach dem Imaging, kombinieren Sie die konfokale Bilder bei verschiedenen z-Achse Z-Stapel Bilder mit Schwerpunkt Feineinstellung zu jedem Zeitpunkt zu liefern.
5. Fügen Sie die Z-Stapel Bilder an verschiedenen Zeit-Punkt und konstruieren Sie einen Zeitraffer-Film im AVI-Format.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die visualisierte oberflächliche tangentiale Migration in einer Wohnung-Mount-Kultur zu einer verstrichene Zeit (0, 9, 18, 27 h) nach Beginn der Aufzeichnung. Film 1 ist ein Zeitraffer Film von 10 Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 28 h 50 min. Der Rahmen ist für die Fokussierung auf die Migration von Zellen von den beschrifteten unteren linken Ecke des Rahmens auf den unmarkierten Raum (

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll ist für die Erkennung von Zellwanderung in oberflächlichen Schichten^6,8optimiert. Es ist anwendbar für die Erkennung von Mittelschicht Migration Bäche (Movie 5)^6,7, nur durch Verschieben der Zeitplan für die Elektroporation (E5.5, E4.5) und dem Beginn der Kultur und Bildgebung (E7.0, E6.0).

Das vorgestellte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300