Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum

Резюме

Мы описываем методы для люминесцентные маркировки вскользь мигрирующих клеток путем электропорации и для покадровой изображений меткой ячейки движения в квартиру гора культуры для того, чтобы визуализировать миграции клеток поведение в развивающихся куриных оптические tectum .

Аннотация

Промежуток времени изображений является мощный метод для анализа миграции поведение клеток. После люминесцентные клеток маркировки движение помеченных клеток в культуре может быть записан под видео микроскопии. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры обычно используется для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции. Однако ограниченную информацию можно получить из метода slice культуры для анализа миграции клеток, перпендикулярно срез секции, такие как тангенциальная клеток миграции. Здесь мы представляем протоколы для покадровой изображений визуализировать тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические tectum. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo и последующие культуры плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос клеточного движения в горизонтальной плоскости. Кроме того наш метод облегчает обнаружение как поведение отдельной клетки, так и коллективных действий группы клеток в долгосрочной перспективе. Этот метод потенциально может применяться для обнаружения последовательные изменения люминесцентные меченых микро-структуры, включая аксональное удлинение в нейронной ткани или клетки перемещения в не нервной ткани.

Введение

Изучение миграции клеток развивается с развивающейся техникой живых изображений. После люминесцентные клеток маркировки височной движение помеченных клеток в культуре блюдо или в естественных условиях может быть записан под видео микроскопии. В изучении нейронных развития морфологические изменения миграции клеток или удлинения аксоны были проанализированы с использованием промежуток времени визуализации. Для эффективной обработки изображений, важно, чтобы применить подходящий метод подготовки люминесцентные клеток тканей и маркировки, основанные на Цель эксперимента и анализ. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры часто используются для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции^1,2,3. Срез культуры система также используется для обнаружения тангенциальная клеток миграции^4,5, но это не подходит для направления анализа в тех случаях, где клетки разогнать перпендикулярный срез секции.

Оптоволоконный tectum состоит из многослойной структуры, образованные радиального и тангециального клеток миграции во время эмбрионального развития. Формирование тектальный слоя зависит главным образом от радиального миграции клеток-постмитотических нейрональных предшественников из желудочков зоны, и их конечного назначения в слоях коррелирует с даты их рождения в Вентрикулярная зона⁶. Что касается тангенциальная миграции мы сообщалось ранее двух потоков миграции в средних и поверхностных слоев в развивающихся куриных оптические tectum. В средних слоях во время E6-E8 биполярный клетки с давно ведущих процесс и тонкие завершающие процесс миграции дорзально или вентрально вдоль аксона fasciculus тектальный эфферентной аксонов, использующих dorso вентрально⁷. После этого axophilic миграции клетки дифференцироваться в многополярном нейроны, расположенные в глубоких слоях. В поверхностных слоях во время E7-E14 мигрирующих клеток расходятся горизонтально путем реформирования разветвленной ведущих процесс и разброс в несколько направлений⁸. После диспергирования миграции, последний клетки в конечном итоге дифференцироваться в поверхностных нейроны различных морфологии. В обоих случаях с плоским гора культура эффективно соблюдать клеточного движения параллельно сетчаточных поверхности.

Здесь мы представляем собой протокол для покадровой imaging для визуализации тангенциальная клеток миграции в оптические tectum развивающихся куриных,^7,,⁸. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo, и последующие культуры с плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос направления движения и миграции клеток. Цель этого метода является для облегчения обнаружения поведения как отдельной ячейки в долгосрочной перспективе и коллективных действий группы клеток в горизонтальной плоскости.

протокол

1. Электропорация в Ovo

1. Подготовьте выражение плазмидной ДНК люминесцентные маркировки в высокой концентрации. Изолируйте ДНК от 200 мл бактериальной культуры щелочного литического методом с использованием Анионообменная столбцы по данным производителя протокол (Таблица материалов). Смесь pCAGGS-EGFP и pCAGGS-mCherryNuc в конечной концентрации 4 мкг/мкл каждого.
   Примечание: Бесплатно эндотоксина плазмида ДНК очистки может быть предпочтительным для электропорации.
2. Инкубируйте плодородные куриные яйца горизонтально на 38 ° C в 70% относительной влажности.
3. После 2,5 дня ликвидировать 5 мл белка (белок) со стороны указал яйцо с помощью 20 мл шприц с иглой 18 калибр и запечатать отверстие иглы с лентой.
4. Вырежьте в верхней части скорлупы яиц с изогнутые ножницы, чтобы открыть отверстие 2 см в диаметре и проверить стадии развития эмбриона под стереомикроскопом (этап 17 гамбургер и Хэмилтон⁹). Запечатать отверстие снова с лентой.
   Примечание: Этот шаг можно выполнить в любое время во время E2.5-E3.0. Шаги, 1.3 и 1.4 снизить уровень эмбриона в яйцо, чтобы избежать жесткой приверженности верхней оболочки растущий эмбрион и кровеносных сосудов.
5. Продолжать инкубации до E5.5.
6. Перед электропорация Подготовьте 10 мкл упомянутых плазмида ДНК цветные с 0.5 мкл быстро Грин (25 мг/мл), 10 мл газобетона фосфата буфер солевой (PBS) содержащие пенициллин (100 единиц/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) и micropipettes из стеклянные капиллярные трубки с помощью микропипеткой процессора. Вырежьте дистального наконечника микропипеткой сделать соответствующий размер поры в зависимости от количества ДНК для инъекций.
7. Вырежьте запечатанных верхней оболочки с ножницами, чтобы открыть отверстия 2,5 см в диаметре и задать яйцо стабильно под стерео Микроскоп. Добавьте несколько капель PBS в яйцеклетку. Отделите allantoic мембраны, охватывающих эмбриона без кровоизлияния, используя две прекрасные щипцами. Удалите из головы эмбриона амнион.
8. При повороте головы с microspatula, придать 0,1-1 мкл цветные ДНК в полость желудочков левой оптические tectum, используя микропипеткой подключен к всасывающую трубу.
   Примечание: Количество ДНК вводят зависит от цели эксперимента. Концентрированный раствор ДНК следует раковина и прикрепить вдоль стены желудочков.
9. Место пара forcep тип электродов (квадратный электродов 3 мм с расстоянием 7 мм), так что целевой области оптоволоконных tectumis помещен между (рис. 1Шаг 1).
   Примечание: ДНК-electroporated в сторону анода.
10. Оплата до пульс 30 V, 1 мс с интервалом в 5 мс и четырех последующих импульсов 6 V, 5 мс с интервалом в 10 мс, с помощью генератора импульсов.
    Примечание: Электронные состояния зависит от размера и расстояния электродов. Она должна быть достаточно сильны, чтобы добиться эффективного трансфекции, но она должна быть достаточно скромный, чтобы обеспечить нормальное развитие ткани-мишени.
11. Запечатать отверстие с лентой и продолжить инкубации. Смочите электроды в PBS для удаления белка с Интердентальные щетки в пластиковую посуду. 1.7-1.11 повторите для каждого яйца.

2. квартира гора культура на Вставка ячеек

1. Один день перед плоским гора культуры, подготовьте Вставка культуры клеток с покрытием. Поплавок культуры вставки некоторые ячейки на газобетона дистиллированной воды в блюдо культуры клеток 10-см. Загрузите решение 8 мкг/мл Ламинин и 80 мкг/мл поли L-Лизин для покрытия вставок и оставить плавали вставок в инкубатор культуры CO₂ клетки при 37 ° C на ночь.
   Примечание: На следующий день, покрытые вставок могут храниться при 4 ° C.
2. День культуры в E7.0 удалить раствор Ламинин поли L-лизин из вставки и место вставки в стекла дно блюдо (рис. 1Шаг 2) заполнены с 1,1 мл питательной среды (60% сокращение сыворотке средний, 20% F12, 10% плода бычьим сывороточным, 10 % куриных сыворотки, 50 единиц/мл пенициллин, 50 мкг/мл стрептомицина). Держите блюдо в ячейку культуры CO₂ инкубатора 37 ° c.
   Примечание: Носитель может использоваться на протяжении всего периода культуры за три дня без изменений.
3. Подготовка установки культуры. Задайте единицу влажной камере на Перевернутый Конфокальный микроскоп с газового потока 40% O₂ и 5% CO₂ (Газ контроллер) в 38 ° C (контроллер температуры).
4. Вырежьте голове эмбриона с ножницами. Щепотку голову с щипцами в ледяной Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS) в блюдо культуры клеток 6-см.
5. Изолируйте electroporated оптические tectum, используя две прекрасные щипцами. Перенесите tectum с пластиковые капельницы в другое блюдо, наполненный ледяной HBSS. Используйте кривыми стеклянную посуду, основанный с Черный кремний как блюдце для резки.
6. Проверьте положение маркировки под стереоскопическим микроскопом флуоресценции. Вырежьте тектальный ткани, окружающие области маркировки микрохирургическое ножом. Убедитесь, что направление ткани в tectum (передняя кзади, спинной вентральной).
7. Приклеенные этикетку ткани с пластиковые капельницы можно передать insert чтобы сторона Пиа прилагается к вставка. Положите тектальный ткани в нужном направлении и удалите избыток HBSS (рис. 1Шаг 2).
8. Повторите, вставить 2,4-2,7 с целью подготовки других тканей на то же самое. Поместите блюдо в зале подогретую в Перевернутый Конфокальный микроскоп (рис. 1Шаг 3).

3. промежуток времени изображений

1. Проверьте люминесцентные маркировки и сосредоточиться микроскопическом поле в Перевернутый конфокального микроскопа. Запустите лазерного конфокального единиц и попробуйте выборки конфокальный сканирования настроить положение ткани вдоль X и y в области и направление. Используйте 10 X или 20 X объектив без погружения нефти.
2. Выберите размер сканирования (например, 512 x 512 точек на дюйм). Решите, интервал и полный диапазон конфокальный сканирования вдоль оси z. Возьмите 5 или 10 мкм интервал диапазона 100 мкм. Определить интервал времени конфокальная томография и общей визуализации продолжительности (например, интервалы более 48 ч 10 мин).
   Примечание: Чтобы избежать Фототоксичность лазер, запретить сканирование в высокий размер сканирования с короткими z интервалами для долгого z диапазона, или короткие интервалы времени во время долго изображений продолжительность. Например при применении высокий размер сканирования (например, 1024 x 1024 точек на дюйм), уменьшите количество сканов вдоль оси z.
3. Набор параметров конфокальный работает программа описана в 3.2 и начать изображений.
4. После обработки изображений, объединяйте конфокальный изображения на различных z-axis предоставлять z стек изображений с тонкой регулировки фокуса в каждый момент времени.
5. Добавление z стек изображений в другой момент времени и построить покадровой фильм в формате AVI.

Результаты

Рисунок 2 показывает Визуализация поверхностного тангенциальная миграции в культуре с плоским гора в прошедшее время (0, 9, 18, 27 h) после начала записи. Фильм 1 — промежуток времени фильм 10 мин-интервалов в течение 28 ч 50 мин. Рамка, выбранн...

Обсуждение

Описанные выше протокол оптимизирован для обнаружения миграции клеток в поверхностных слоях^6,8. Это применимо для обнаружения среднего уровня миграции потоков (фильм 5)^6,7, просто перенос сроков электропо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300