Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Resumo

Descrevemos os métodos para a rotulagem fluorescente de tangencialmente migração células por eletroporação e para a imagem latente de lapso de tempo do movimento de célula rotulada em uma cultura de montagem plana a fim de visualizar a migração celular comportamento no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento .

Resumo

Imagem de lapso de tempo é um método poderoso para analisar o comportamento de migração celular. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento das células em cultura etiquetados pode ser gravado sob microscopia de vídeo. Para a análise de migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura comumente é usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, tais como migração celular radial. No entanto, informação limitada pode ser obtida o método de cultura de fatia para analisar a migração celular perpendicular à seção de fatia, tais como migração celular tangencial. Aqui, apresentamos os protocolos para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no tectum óptica do pintinho em desenvolvimento. Uma combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovo e uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de movimento de células migratórias no plano horizontal. Além disso, nosso método proporciona detecção de comportamento de célula individual e a ação coletiva de um grupo de células a longo prazo. Potencialmente, este método pode ser aplicado para detectar a alteração sequencial da fluorescente-etiquetadas microestrutura, incluindo o alongamento axonal no deslocamento de tecidos ou células neural nos tecidos não-neurais.

Introdução

O estudo da migração celular tem sido progredindo com a técnica de avançada de imagem ao vivo. Após a célula fluorescente rotulagem, o movimento temporal de pilhas etiquetadas em um prato de cultura ou na vivo pode ser gravado sob microscopia de vídeo. No estudo do desenvolvimento neural, foram analisadas as mudanças morfológicas da migração de células ou alongando axônios utilizando imagens de lapso de tempo. Para a imagem latente eficaz, é essencial para aplicar um método adequado para a preparação de rotulagem e tecido fluorescente célula, baseado sobre a finalidade do experimento e análise. Para analisar a migração celular no cérebro em desenvolvimento, fatia cultura tem sido comumente usada para observar a migração celular paralela à seção de fatia, como célula radial migração^1,2,3. O sistema de cultura de fatia é também utilizado para detectar células tangencial migração^4,5, mas não é adequado para análise direcional em casos onde as células se dispersar perpendicular à seção de fatia.

O tectum óptica é composta de uma estrutura de várias camada, formada pela migração radial e tangencial celular durante o desenvolvimento embrionário. Formação de camada tectal depende, principalmente, migração radial de células postmitotic neuronal precursor da zona ventricular, e seu destino final nas camadas correlaciona-se com sua data de nascimento na zona ventricular⁶. Quanto a migração tangencial, relatamos anteriormente dois fluxos de migrações nas camadas intermediária e superficiais em um desenvolvimento tectum óptica de garota. Nas camadas médios durante E6 E8, as células bipolares com um processo de tempo principal e um processo à direita fino migram dorsalmente ou ventralmente ao longo do fascículo axônio de axônios eferentes tectal executados dorso-ventralmente⁷. Após esta migração de axophilic, as células se diferenciar em neurônios multipolares localizados nas camadas profundas. Nas camadas superficiais durante E7-E14, as células migratórias dispersarem-se horizontalmente através da reforma de um processo principal ramificado e dispersão em múltiplas direções⁸. Após a migração de dispersão, as último células eventualmente se diferenciar em neurônios superficiais de várias morfologias. Em ambos os casos, uma cultura de plano de montagem é eficiente para observar o movimento da célula paralela à superfície pial.

Aqui, apresentamos um protocolo para Time-Lapse de imagens para visualizar a migração celular tangencial no desenvolvimento garota tectum óptica^7,8. Combinação de célula rotulagem por eletroporação no ovoe uma cultura de montagem plana subsequente na inserção da cultura de célula permite a detecção de direção de movimento e migração de células migrando. O objetivo desse método é facilitar a detecção de comportamento ambos célula individual o longo prazo e a ação coletiva de um grupo de células no plano horizontal.

Protocolo

1. Electroporation no Ovo

1. Prepare o plasmídeo de expressão para a rotulagem fluorescente em alta concentração. Isole o DNA de 200 mL de cultura bacteriana pelo método de Lise alcalina, utilizando colunas permutadora de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de materiais). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc em uma concentração final de 4 µ g / µ l cada.
   Nota: A purificação de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas pode ser preferencial para eletroporação.
2. Incube ovos férteis de galinha horizontalmente a 38 ° C, em 70% de humidade relativa.
3. Após 2,5 dias, eliminar 5 mL de albumina (clara de ovo) do lado pontiagudo do ovo com uma seringa de 20 mL com uma agulha de 18 calibre e selar o buraco da agulha com a fita.
4. Corte a parte superior da casca do ovo com uma tesoura curva para abrir um buraco de 2 cm de diâmetro e verificar o estágio do desenvolvimento do embrião sob o microscópio estereoscópico (estágio 17 de Hamburger e Hamilton⁹). Feche o buraco novamente com fita.
   Nota: Esta etapa pode ser executada a qualquer momento durante a E2.5-E3.0. Passos, 1.3 e 1.4 diminuir o nível do embrião no ovo para evitar uma ligação apertada do embrião crescente e os vasos sanguíneos com o revestimento superior.
5. Continue a incubação até 5.5.
6. Antes electroporation, prepare-se 10 µ l do mencionado Plasmídeo colorido com 0,5 µ l de Fast Green (25) mg/mL, 10 mL de tampão de fosfato autoclavado salino (PBS) contendo penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) e feitas a partir de micropipetas tubos capilares de vidro usando um processador de micropipeta. Corte a ponta distal a micropipeta para fazer um tamanho adequado de poros dependendo da quantidade de DNA para a injeção.
7. Corte o revestimento superior selado com uma tesoura para reabrir um buraco de 2,5 cm de diâmetro e definido o ovo estàvel ao microscópio estéreo. Adicione algumas gotas de PBS no ovo. Retire a membrana alantoico cobrindo o embrião sem hemorragia usando duas pinças bem. Remova o âmnio da cabeça do embrião.
8. Ao girar a cabeça com um microspatula, injetar 0,1-1 μL de DNA colorido na cavidade ventricular do tectum óptica esquerda utilizando uma micropipeta conectado a um tubo de sucção.
   Nota: A quantidade de DNA injetado depende da finalidade do experimento. Solução concentrada de DNA deve afundar e anexar ao longo da parede ventricular.
9. Coloque um par de eletrodos tipo pinça (eletrodos quadrados 3 mm com distância de 7 mm) para que o alvo da óptica tectumis colocado entre (Figura 1etapa 1).
   Nota: O DNA é electroporated para o lado do ânodo.
10. Cobra um pre-pulso de 30 V, 1 ms, com um intervalo de 5 ms e quatro pulsos subsequentes de 6 V, 5 ms, com um intervalo de 10 ms usando o gerador de pulso.
    Nota: A condição eletrônica depende do tamanho e distância dos eléctrodos. Deve ser forte o suficiente para alcançar a transfeccao eficiente, mas deve ser bastante modesto para assegurar o desenvolvimento normal do tecido alvo.
11. Selar o furo com a fita e continuar a incubação. Mergulhe os eléctrodos em PBS para remover a albumina com um escovilhão em um prato de plástico. Repita 1.7-1.11 para cada ovo.

2. plano de montagem cultura na inserção da célula

1. Um dia antes da cultura do plano de montagem, prepare a inserção de cultura celular revestido. Flutuam algumas inserções de cultura de células na água destilada esterilizada em um prato de cultura celular de 10 cm. Carrega uma solução de 8 µ g/mL laminina e 80 µ g/mL poli-L-lisina, para cobrir as inserções e deixar as inserções flutuadas na incubadora celular cultura CO₂ a 37 ° C durante a noite.
   Nota: No dia seguinte, as inserções revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C.
2. No dia da cultura no E7.0, remover a solução de laminina-poli-L-lisina da inserção e coloque a inserção em um fundo prato de vidro (Figura 1passo 2) preenchido com 1,1 mL de meio de cultura (meio soro reduzida de 60%, 20% F12, 10% de soro fetal bovino, 10 % de soro de pintinho, 50 unidades/mL penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL). Mantenha o prato na incubadora celular cultura CO₂ a 37 ° C.
   Nota: O meio pode ser usado durante todo o período de cultura há três dias sem alteração.
3. Prepare a instalação da cultura. Defina uma unidade de câmara húmida em um microscópio confocal invertido com um fluxo de gás de 40% O₂ e 5% CO₂ (controlador de gás) a 38 ° C (controlador de temperatura).
4. Cortou a cabeça do embrião com tesoura. Aperte a cabeça para fora com a pinça em solução de sal balanceada de Hanks gelada (HBSS) em um prato de cultura celular de 6 cm.
5. Isole o tectum óptica electroporated usando duas pinças bem. Transferi o tectum com um conta-gotas plástico para outro prato cheio de HBSS gelada. Use o prato de vidro concaved baseado com silício negro como um pires para o corte.
6. Verifique a posição da rotulagem sob o microscópio estereoscópico de fluorescência. Corte o tecido tectal que cercam a área de rotulagem com uma faca microcirúrgica. Certifique-se a direção do tecido no tectum (ântero-posterior, dorso-ventral).
7. Transferi o tecido rotulado com um conta-gotas de plástico para a inserção para que o lado da pia é anexado para a inserção. Colocar o tecido tectal na direção desejada e retire o excesso HBSS (Figura 1passo 2).
8. Repita inserir 2.4-2.7 para preparar outros tecidos na mesma. Coloque o prato no hemiciclo escaldado em microscópio confocal invertido (Figura 1etapa 3).

3. Time-Lapse Imaging

1. Verifique a rotulagem fluorescente e focar o campo microscópico no microscópio confocal invertido. Começar as unidades confocal laser e tente a varredura confocal para ajustar a direção e a posição do tecido ao longo do X e o eixo y no campo de amostragem. Use o X 10 ou 20 X objectiva sem óleo de imersão.
2. Selecione o tamanho de digitalização (por exemplo, 512 x 512 dpi). Decida o intervalo e a gama completa da varredura confocal ao longo do eixo z. Tire um 5 ou 10 µm de intervalo para o intervalo de 100 µm. Decida o intervalo de tempo da imagem latente confocal e total da imagem latente de duração (por exemplo, 10 min intervalos de mais de 48 h).
   Nota: Para evitar o laser fototoxicidade, proibir digitalização no tamanho digitalização alto com z-intervalos curtos para o z-longo alcance, ou com intervalos de tempo curto durante a duração do tempo de imagem. Por exemplo, ao aplicar um tamanho de digitalização alto (por exemplo, 1024 x 1024 dpi), diminua o número de exames ao longo do eixo z.
3. Definir os parâmetros do trabalho confocal program descrito em 3.2 e começam a imagem.
4. Após a imagem, combine as imagens confocal no eixo z diferente para fornecer imagens de z-pilha com ajuste focal fino em cada ponto de tempo.
5. Acrescentar as imagens de z-pilha em tempo-ponto diferente e construir um filme lapso de tempo no formato AVI.

Resultados

A Figura 2 mostra a migração tangencial superficial visualizada em uma cultura de plano de montagem em um tempo decorrido (0, 9, 18, 27 h) após o início da gravação. Filme 1 é um filme lapso de tempo de 10 min-intervalos durante um período de 28 h e 50 min. O quadro está selecionado para enfocando as células migrando do canto inferior esquerdo etiquetado do quadro para o espaço sem rótulo (Fig...

Discussão

O protocolo descrito acima é otimizado para a detecção de migração celular em camadas superficiais^6,8. É aplicável para a detecção de camada média migração córregos (filme 5),^6,7, só pelo momento da eletroporação (5.5 a e 4.5) e o início da cultura de movimento e imagem (E7.0 a E6.0).

O procedimento apresentado é composto de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300