ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Summary

אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .

Abstract

הדמיה בצילום מואץ היא שיטה חזקה כדי לנתח בהתנהגות התא נודדים. לאחר התא פלורסנט תיוג, ניתן לרשום את התנועה של התאים עם תוויות בתרבות תחת מיקרוסקופ וידאו. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה משמש בדרך כלל כדי להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון נדידת תאים רדיאלי. עם זאת, ניתן להשיג מידע מוגבל השיטה התרבות פרוסה לנתח נדידת תאים בניצב המקטע פרוסה, כגון נדידת תאים וצורניים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo ותרבות עוקבות שטוח-mount על תותב התרבות התא מאפשר זיהוי של התא נודדים, בתנועה במישור האופקי. יתר על כן, שיטת שלנו מקלה על גילוי של התנהגות תא בודד וגם פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים בטווח הארוך. בשיטה זו ניתן להחיל באופן פוטנציאלי כדי לזהות את השינוי רציפים של התווית על-ידי פלורסנט המיקרו-המבנה, כולל התארכות עצב העקירה עצבית רקמות או תאים בתוך הרקמה ללא עצביות.

Introduction

המחקר של נדידת תאים מתקדמת עם טכניקה לקידום הדמיה בשידור חי. לאחר התא פלורסנט תיוג, התנועה הטמפורלי של תאים עם תוויות תרבות מאכל או ויוו ניתן להקליט תחת מיקרוסקופ וידאו. במחקר של התפתחות עצבית, שינויים מורפולוגיים של נדידת תאים או מתארך אקסונים יש כבר נותחה באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור הדמיה יעיל, זה חיוני כדי להחיל שיטה מתאימה להכנה תא פלורסנט תיוג ורקמות, בהתבסס על מטרת ניסוי וניתוח. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה כבר בשימוש נפוץ להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון תא רדיאלי ההעברה^1,2,3. מערכת התרבות פרוסה משמש גם לגילוי תא וצורניים ההעברה^4,5, אבל זה לא מתאים לניתוח כיוונית במקרים שבו התאים לפזר בניצב בסעיף פרוסה.

Tectum סיב אופטי מורכב מבנה מרובה שכבות, שהוקמה על ידי נדידת תאים רדיאלי, וקולו במהלך התפתחות עובריים. היווצרות שכבה tectal תלוי בעיקר ההעברה רדיאלי של קודמן עצביים postmitotic תאים מאזור חדרית, היעד הסופי שלהם ברבדים בקורלציה עם תאריך הלידה שלהם ב אזור חדרית⁶. באשר וצורניים ההעברה, דיווחנו בעבר שני זרמים של העברות בשכבות הביניים ושיטחית ב tectum אופטיים המתפתח הבחורה. בשכבות הביניים במהלך E6-E8, התאים דו קוטבי עם תהליך ארוך המובילים ותהליך נגרר דק נודדים dorsally או ventrally לאורך fasciculus האקסון של אקסונים efferent tectal הפועלות dorso-ventrally⁷. לאחר העברה זו axophilic, התאים להבדיל לתוך הנוירונים multipolar הנמצא בשכבות העמוקות. בשכבות שטחיות במהלך E7-E14, התאים נודדים לפזר בצורה אופקית על ידי רפורמה תהליך המוביל מסועף ופיזור לתוך כיוונים מספר⁸. לאחר פיזור ההעברה, התאים האחרונים להבדיל בסופו של דבר לתוך הנוירונים שטחית מורפולוגיות שונות. בשני המקרים, תרבות שטוח-הר יעיל כדי לבחון את תנועת התא מקביל פני השטח pial.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים לתעל פיתוח צ'יק tectum סיב אופטי^7,8. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo, ותרבות עוקבות שטוח-mount על הוספה התרבות תאים מאפשרת גילוי של כיוון התנועה והעברה תא נודדים. המטרה של שיטה זו היא כדי להקל על הזיהוי של שני התנהגות תא בודד לטווח הארוך, פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים במישור האופקי.

Protocol

1. אלקטרופורציה ב Ovo

1. להכין את הביטוי פלסמיד DNA תיוג פלורסנט בריכוז גבוה. לבודד דנ א מ- 200 מ של התרבות חיידקי בשיטת פירוק אלקליין תוך שימוש בעמודות אניון הבורסה לפי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים). לערבב pCAGGS-EGFP pCAGGS-mCherryNuc-ריכוז סופי של 4 µg/µL כל.
   הערה: טיהור DNA פלסמיד נטולת אנדוטוקסין עשוי להיות המועדפת עבור אלקטרופורציה.
2. דגירה ביצי תרנגולת פורייה אופקית ב 38 ° C ב- 70% לחות יחסית.
3. אחרי 2.5 ימים, לחסל את 5 מ של אלבומין (חלבון ביצה) מן הצד המחודד של הביצה באמצעות 20 מ"ל מזרק עם מחט בקוטר 18, לאטום את החור מחט עם הקלטת.
4. לחתוך העליון של המעטפת ביצה עם מספריים מעוגלים כדי לפתוח חור 2 ס מ קוטר ולבדוק את השלב ההתפתחותי של העובר תחת stereomicroscope (שלב 17 / המבורגר והמילטון⁹). לאטום את החור שוב עם הקלטת.
   הערה: שלב זה יכול להתבצע בכל עת במהלך E2.5-E3.0. שלבים 1.3 ו- 1.4 להנמיך את הרמה של העובר על הביצה כדי להימנע קובץ מצורף חזק של העובר גדל ואת כלי הדם כדי המעטפת העליונה.
5. המשך דגירה עד E5.5.
6. לפני אלקטרופורציה, להכין µL 10 על פלסמיד שהוזכרו dna צבעוניים עם 0.5 µL מהר ירוק (25 מ"ג/מ"ל), 10 מ של פוספט בלוק buffered מלוחים (PBS) המכיל פניצילין (100 יחידות/mL) סטרפטומיצין (100 μg/mL), ואת micropipettes מסיבים זכוכית צינורות קפילר באמצעות מעבד micropipette. חותכים בקצה הדיסטלי micropipette כדי להפוך בגודל המתאים של הנקבובית בהתאם לכמות הדנ א להזרקה.
7. חותכים את הקליפה העליונה אטום עם מספריים כדי לפתוח חור 2.5 ס מ קוטר ולהגדיר את הביצה stably תחת המיקרוסקופ סטריאו. הוסף מספר טיפות של PBS לתוך הביצית. לקלף את הקרום allantoic מכסה את העובר ללא דימום באמצעות מלקחיים בסדר שני. הסר את השפיר של ראשו של העובר.
8. כשאתם מסובבים את הראש עם microspatula, מזריקים 0.1-1 μL של ה-DNA צבעוני לתוך חלל חדרית של tectum אופטיים שמאל באמצעות micropipette מחובר צינור שאיבה.
   הערה: כמות ה-DNA מוזרק תלוי מטרת הניסוי. תמיסה מרוכזת של הדנ א צריך לשקוע וצרף לאורך הקיר חדרית.
9. המקום זוג אלקטרודות מסוג forcep (3 מ מ, מרובע אלקטרודות עם מרחק 7 מ מ) כך אזור היעד של tectumis סיב אופטי ממוקם בין (איור 1שלב 1).
   הערה: ה-DNA היא electroporated לצד אנודת.
10. גובה דופק מראש של 30 V, ms עם מרווח של 5 אלפיות השנייה, ארבע פעימות עוקבות של 6 V 1, 5 מילי-שניות עם מרווח 10 ms באמצעות הגנרטור דופק.
    הערה: התנאי אלקטרונית תלוי גודל ומרחק של האלקטרודות. זה צריך להיות מספיק חזק כדי להשיג יעילות תרביות תאים, אך זה חייב להיות צנוע מספיק כדי להבטיח להתפתחות תקינה של רקמת המטרה.
11. לאטום את החור עם הקלטת ולהמשיך הדגירה. משרים את האלקטרודות ב- PBS להסיר אלבומין במברשת interdental בצלחת פלסטיק. חזור על 1.7-1.11 עבור כל ביצה.

2. שטוח-הר תרבות על תותב תא

1. יום אחד לפני התרבות שטוח-הר, להכין את תותב תרבות תא מצופה. לצוף קצת מוסיף התרבות התא למים מזוקקים בלוק בצלחת בתרבות תא ס מ-10. לטעון פתרון של µg/mL laminin 8 ו- 80 µg/mL פולי-L-ליזין לכסות את הכיסויים ולעזוב את הכיסויים צפים בחממה תרבות CO₂ תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: למחרת, המכסים מצופים שניתן לאחסן ב 4 º C.
2. ביום של התרבות-E7.0, הסר תותב הפתרון laminin-פולי-L-ליזין ולמקם את תותב בקערת זכוכית התחתון (איור 1שלב 2) מלא 1.1 מ של תרבות בינונית (60% מופחת סרום בינוני, 20% F12, סרום שור עוברית 10%, 10 נסיוב החתיכה %, 50 יחידות/mL פניצילין, 50 סטרפטומיצין μg/mL). לשמור את המנה בחממה תא תרבות CO₂ ב 37 º C.
   הערה: המדיום יכול לשמש לאורך כל תקופת תרבות במשך שלושה ימים ללא שינוי.
3. להכין את ההגדרה של תרבות. הגדר היחידה קאמרית לח מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם זרם הגז של 40% O₂ ו 5% CO₂ (גז בקר) ב 38 ° C (בקר טמפרטורה).
4. חותכים את הראש של העובר עם מספריים. לצבוט את הראש החוצה עם המלקחיים בתוך תמיסת מלח מאוזנת הנקס קר כקרח (HBSS) בקערה התרבות תאים 6 ס מ.
5. לבודד את tectum electroporated סיב אופטי באמצעות מלקחיים בסדר שני. להעביר את tectum עם טפי פלסטיק לתוך תבשיל אחר מלא HBSS קר כקרח. השתמש את צלחת זכוכית והקעורות מבוסס עם סיליקון שחור כמו צלוחית לחיתוך.
6. בדוק את המיקום של תיוג תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי זריחה. לגזור tectal רקמות המקיפים את האזור תיוג עם סכין השתלה. ודא את הכיוון של הרקמה ב tectum (קדמי-אחוריים, הגבי הגחוני /).
7. להעביר הרקמה שכותרתו עם טפי פלסטיק הכנס כך הצד פיא מצורפת את הכנס. להניח את הרקמה tectal בכיוון הרצוי ולהסיר עודפי HBSS (איור 1שלב 2).
8. חזור על 2.4-2.7 לשם הכנת רקמות אחרות באותו הכנס. מקם את המנה בבית הבליעה prewarmed ב מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 1בשלב 3).

3. זמן לשגות הדמיה

1. בדוק את תוויות פלורסנט ולהתמקד בתחום מיקרוסקופיים. מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. להתחיל את היחידות לייזר קונפוקלי ונסה הדגימה את הסריקה קונאפוקלית כדי להתאים את הכיוון והמיקום של הרקמה לאורך ציר ה-y, X בשטח. השתמש ה-X של 10 או 20 X עדשה אובייקטיבי ללא שמן טבילה.
2. בחר את גודל סריקה (למשל, 512 x 512 dpi). להחליט את מרווח הזמן ואת טווח הכולל של הסריקה קונאפוקלית לאורך ציר z. לקחת מרווח של 5 או 10 מיקרומטר עבור הטווח 100 מיקרומטר. להחליט את מרווח הזמן של הדמיה קונאפוקלית, הכולל הדמיה משך (למשל, 10 דקות מרווחי מעל 48 שעות).
   הערה: כדי להימנע לייזר phototoxicity, לאסור סריקה גודל סריקה גבוהה עם z-הפסקות קצרות עבור z ארוך-הטווח, או עם מרווחי זמן קצר במהלך משך זמן הדמיה. לדוגמה, בשעת החלת גודל סריקה גבוהה (למשל, 1024 1024 x dpi), להקטין את מספר סריקות לאורך ציר z.
3. ערכת הפרמטרים של הריצות קונאפוקלית תוכנית 3.2 שמתואר ולהתחיל הדמיה.
4. לאחר ההדמיה, לשלב את התמונות קונאפוקלית על ציר z שונים כדי לספק תמונות z-מחסנית עם התאמת מוקד משובח בכל נקודת זמן.
5. צרף תמונות z-מחסנית בנקודת זמן שונים ולבנות סרט זמן לשגות בפורמט AVI.

תוצאות

איור 2 מציג את ההעברה וצורניים שטחית מטמיעים בתרבות שטוח-הר בזמן שחלף (0, 9, 18, 27 h) לאחר תחילת הקלטה. הסרט 1 הוא סרט בצילום מואץ של מינימום 10-מרווחי על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות. במסגרת נבחרת עבור התמקדות התאים נודדים מהפינה השמאלית התחתונה ...

Discussion

הפרוטוקול המתואר לעיל ממוטבת לגילוי נדידת תאים שכבות שטחיות^6,8. הוא ישים לגילוי שכבה אמצעית ההעברה נחלים (סרט 5)^6,7, רק על ידי הסטה העיתוי של אלקטרופורציה (E5.5 כדי E4.5) ואת תחילתה של תרבות והדמיה (E7.0 כדי E6.0).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300