개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

요약

형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

초록

시간 경과 영상 마이그레이션 셀 동작을 분석 하는 강력한 방법입니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화에 레이블이 지정 된 세포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하에 주로 사용 됩니다. 그러나, 슬라이스 문화 방법 접선 셀 마이그레이션 등의 조각 섹션에 수직 셀 마이그레이션 분석 하에서 제한 된 정보를 얻을 수 있습니다. 여기, 우리는 시각화 개발 병아리 광섬유 tectum에 접선 셀 마이그레이션 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜을 제시. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서 문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해의 조합 수평 평면에 마이그레이션 세포 운동의 감지 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 개별 셀 동작 및 장기적으로 세포의 그룹의 집단 행동의 탐지를 촉진 한다. 이 방법은 잠재적으로 형광 표시 된 마이크로-구조, axonal 신장 비 신경 조직의 신경 조직 또는 세포 치환 등의 순차적 변화를 감지에 적용할 수 있습니다.

서문

세포 이동의 연구 라이브 이미징의 발전 기법으로 진행 되었습니다. 형광 셀 라벨, 후 비디오 현미경 아래 문화 접시 또는 vivo에서 레이블이 지정 된 셀의 시간적 움직임을 기록할 수 있습니다. 신경 개발 연구에서 세포를 마이그레이션하거나 elongating axons의 형태학 변화 되었습니다 분석 했습니다 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여. 효과적인 이미징에 대 한 형광 셀 라벨 및 조직 준비, 실험 및 분석의 목적에 따라 적당 한 방법을 적용 하는 필수적 이다. 개발 두뇌에 셀 마이그레이션 분석, 대 한 조각 문화는 셀 마이그레이션 방사형 셀 마이그레이션^1,2,3등의 조각 섹션에 평행 하 게 관찰 하 일반적으로 사용 되었습니다. 조각 문화 시스템은 접선 셀 마이그레이션^4,5, 검색에 사용 하지만 셀 슬라이스 섹션에 수직을 분산 하는 경우에 방향 분석에 적합 하지 않습니다.

광섬유 tectum는 배아 개발 하는 동안 레이디얼 및 접선 셀 마이그레이션에 의해 형성 된 다층 구조의 구성 됩니다. Tectal 계층 형성 된 심 실 영역에서 postmitotic 신경 선구자 세포의 방사형 마이그레이션에 주로 의존 하 고 층에서 그들의 최종 목적지는 심 실 지역⁶에 그들의 출생 날짜와 상관 관계가. 접선 이동에 관해서는 우리는 이전 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum에 중간과 표면 층에서 두 개의 스트림을 보고. E6-E8 중 중간 층에서 긴 주요 프로세스와 얇은 후행 프로세스 양극 세포 dorso ventrally⁷실행 tectal 원심 성 축 삭의 축 삭 fasciculus 따라 dorsally 또는 ventrally 마이그레이션합니다. 이 axophilic 마이그레이션 후 셀 깊은 층에 있는 다 극 신경 세포로 분화. E7-E14 중 표면 층에서 마이그레이션 셀 가로로 여러 방향⁸로 분기 주요 프로세스 및 분산형 개혁에 의해 분산. 마이그레이션, 분산 후 후자의 셀 결국 다양 한 형태학의 피상적인 뉴런으로 분화. 두 경우 모두, 평면 산 문화 pial 표면에 병렬 셀 운동 관찰 효율적입니다.

여기, 선물이 접선 셀 마이그레이션 개발 병아리 광섬유 tectum^7,8에서 시각화 하 시간 경과 영상에 대 한 프로토콜. 셀 라벨 electroporation에서 비켜에서문화와 후속 플랫-마운트 셀 문화 삽입에 의해 한 마이그레이션 셀 이동 및 마이그레이션 방향 감지가 있습니다. 이 방법의 목표는 장기와 수평 평면에 있는 셀의 그룹의 집단 행동에 두 개별 셀 동작의 탐지를 촉진.

프로토콜

1입니다. 비켜에 Electroporation

1. 높은 농도에 형광 라벨에 대 한 식 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 음이온 교환 열을 사용 하 여 알칼리 성 세포의 용 해 방법으로 200ml의 세균성 문화에서 DNA를 분리. 각 4 µ g / µ L의 최종 농도에 pCAGGS-mCherryNuc pCAGGS-EGFP 믹스.
   참고: 내 무료 플라스 미드 DNA 정화 electroporation에 대 한 선호 있을 수 있습니다.
2. 가로 70% 상대 습도에서 38 ° C에 비옥한 계란을 품 어.
3. 2.5 일 후 18 게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 계란의 지적된 측면에서 배 젖 (달걀 흰 자 위)의 5 mL을 제거 하 고 테이프와 바늘 구멍을 봉인.
4. 곡선가 위 직경에서 2cm 구멍을 열고 stereomicroscope (햄버거와 해밀턴⁹의 단계 17) 아래 태아의 발달 단계를 확인 하는 달걀 껍질의 상단을 잘라. 다시 테이프로 구멍을 봉인.
   참고:이 단계는 E2.5 E3.0 동안 언제 든 지 수행할 수 있습니다. 1.3 및 1.4 단계 상위 셸에 성장 배아와 혈관의 꽉 첨부 파일을 피하기 위해 계란에서 태아의 수준 낮은.
5. E5.5까지 부 화를 계속 합니다.
6. Electroporation, 전에 언급 한 플라스 미드 DNA의 착 색 된 빠른 그린 (25 mg/mL)의 0.5 µ L 10 mL 버퍼링 압력가 인산 염의 염 분 (PBS) 페니실린 (100 단위/mL)와 스 (100 μ g/mL), 및 micropipettes에서 만든 10 µ L를 준비 유리 모 세관 튜브 micropipette 프로세서를 사용 하 여입니다. 주입에 대 한 DNA의 양에 따라 적절 한 크기를 만들기 위해 micropipette의 원심 끝을 잘라.
7. 가 위로 다시 구멍 직경에서 2.5 c m 스테레오 현미경 안정적으로 달걀을 설정 하 밀봉된 최고 껍질을 잘라. 달걀으로 PBS의 몇 방울을 추가 합니다. 두 개의 미세 집게를 사용 하 여 출혈 없이 태아를 덮고 allantoic 멤브레인을 벗기다. 태아의 머리에서 있는 amnion를 제거 합니다.
8. microspatula와 머리를 선회 하는 동안 주사 0.1-1 μ는 micropipette를 사용 하 여 왼쪽된 눈 tectum의 심 실 구멍으로 색된 DNA의 흡입 관에 연결 된.
   참고: DNA 주입 양의 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 집중된 DNA 솔루션 싱크 하 고 심 실 벽을 따라 연결 해야 합니다.
9. 광섬유 tectumis의 대상 영역 (그림 1단계 1) 사이 배치 되도록 forcep 형 전극 (3 m m 평방 전극 7 mm 거리)의 한 쌍을 놓습니다.
   참고: DNA는 양극 쪽으로 electroporated.
10. 30 V의 사전 펄스, 1 ms 5 ms 간격 및 V 6의 4 개의 연속적인 펄스, 펄스 발생기를 사용 하 여 10 ms 간격 5 ms를 부과 합니다.
    참고: 전자 상태 크기와 전극의 거리에 따라 달라 집니다. 효율적인 transfection를 달성 하기 위해 충분히 강한 해야 하지만 충분히 겸손 하 게 대상 조직의 정상적인 발전을 보장 해야 합니다.
11. 테이프로 구멍을 밀봉 하 고 부 화를 계속 합니다. 플라스틱 접시에는 치 간 브러시로 배 젖 제거를 PBS 전극을 담근 다. 1.7-1.11 각 계란에 대 한 반복 합니다.

2. 플랫-마운트 문화에 셀 삽입

1. 플랫-마운트 문화 전에 1 일 코팅된 셀 문화 삽입 준비. 10 cm 세포 배양 접시에 압력가 증류수에 셀 문화 삽입 일부 플 로트. 8 µ g/mL laminin의 80 µ g/mL 폴 리-L-리 신 커버를 삽입 하 고 37 ° C에서 셀 문화 CO₂ 배양 기에서 떠다니는 삽입을 떠나 하룻밤을 솔루션을 로드 합니다.
   참고: 다음 날, 코팅된 삽입 저장 될 수 있다 4 ° c.에
2. E7.0에서 문화의 날, 삽입에서 laminin-폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 유리 하단 접시에 (그림 12 단계) 문화 매체 (60% 감소 된 혈 청 매체, 20 %F12, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 10의 1.1 mL 가득 삽입 장소 % 여 자가 혈 청, 50 단위/mL 페니실린, 50 μ g/mL 스). 37 ° c.에 셀 문화 공동₂ 인큐베이터에 접시를 유지
   참고: 매체는 변화 없이 3 일 동안 문화 기간 동안 사용할 수 있습니다.
3. 문화 설치를 준비 합니다. 40% O₂ , 5% CO₂ (가스 컨트롤러) 38 ° C (온도 컨트롤러)에서 가스 흐름을 거꾸로 confocal 현미경에 습기가 챔버 단위를 설정 합니다.
4. 가 위로 태아의 머리를 잘라. 차가운 행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 6 cm 세포 문화 접시에서에 있는 집게와 함께 밖으로 머리를 꼬집어.
5. Electroporated 광섬유 tectum 두 미세 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 플라스틱 스 포 이트와 tectum 차가운 HBSS 가득 다른 접시에 전송 합니다. 절단에 대 한 접시로 검은 실리콘 기반 concaved 유리 접시를 사용 합니다.
6. 형광 실체 현미경 아래 라벨의 위치를 확인 하십시오. Tectal 조직 지역을 포위 하는 라벨 microsurgical 칼으로 잘라. 있는지 확인 조직의 방향 tectum (앞쪽-후부, 복 부 등)에서.
7. 플라스틱 스 포 이트로 레이블이 지정 된 조직 삽입 전송 피아 측 삽입에 연결 되어 있도록. 원하는 방향으로 tectal 조직을 제거 초과 HBSS (그림 12 단계).
8. 2.4-2.7 같은 다른 조직 준비 하기 위하여 삽입을 반복 합니다. 거꾸로 confocal 현미경 (그림 13 단계)에서 prewarmed 약 실에 있는 접시를 놓습니다.

3. 시간 경과 영상

1. 형광 라벨을 확인 하 고 거꾸로 confocal 현미경 현미경 분야 초점. 레이저 confocal 장치를 시작 하 고 샘플링 confocal 스캔 방향 및 필드에 X와 y 축을 따라 조직의 위치를 조정 하려면 보십시오. 사용 하 여 10 배 또는 침수 기름 없이 20 X 렌즈.
2. 스캔 크기를 선택 합니다 (예를 들어, 512 x 512 dpi). 간격 및 z 축 따라 confocal 스캔의 전체 범위를 결정 합니다. 100 µ m 범위에 대 한 5 또는 10 µ m 간격을 가져가 라. Confocal 영상 및 전체 기간 (예: 10 분 간격 이상 48 h) 이미징의 시간 간격을 결정 합니다.
   참고: 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 높은 스캔 크기는 긴 z 범위에 대 한 짧은 z 간격 또는 긴 이미징 기간 동안 짧은 시간 간격에 검색 금지 합니다. 예를 들어 높은 스캔 크기 (예: 1024 x 1024 dpi)를 적용할 때 z 축 따라 검사의 수를 감소.
3. Confocal 실행의 매개 변수에서 설명된 3.2 프로그램 및 이미징 시작 설정 합니다.
4. 이미징, 후 모든 시간 지점에서 미세 초점 조정 z 스택 이미지를 제공 하는 다른 z 축에서 confocal 이미지를 결합.
5. 다른 시간 지점에서 z-스택 이미지를 추가 하 고 시간 경과 영화 AVI 형태로 구성.

결과

그림 2 녹음의 개시 후 경과 시간 (0, 9, 18, 27 h)에서 플랫-마운트 문화에 시각화 된 표면 접선 마이그레이션을 보여준다. 영화 1 28 h 50 분 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화입니다. 프레임은 레이블 없는 공간 (그림 3A) 프레임의 레이블된 왼쪽 모서리에서 마이그레이션 세포에 초점을 맞추고 선택 됩니다. ...

토론

위에서 설명한 프로토콜 표면 레이어^6,8셀 마이그레이션 감지 최적화 되어 있습니다. 그것은 이동 electroporation (E4.5에 E5.5)의 타이밍 및 문화의 발병 및 이미징 (E6.0에 E7.0) 그냥 중간 계층 마이그레이션 스트림영화 ( 5)^6,7, 탐지를 위해 적용 가능한.

제시 하는 절차?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300