نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

Summary

تصف هذه الدراسة نموذجا جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية على مر الزمن استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. هذا النموذج نظام واعدة لاستكمال نماذج الحيوانات الثديية مثل الماوس نماذج لدراسة الأمراض المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.

Abstract

العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) أحد أسباب رئيسية لفشل الأجهزة الطبية الحيوية. المكوّرات العنقودية الذهبية إحدى المسببات الرئيسية في بأي. النماذج الحالية تجريبية بأي الحيوانات الثديية مثل نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وذلك غير مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. وهكذا، الرواية نماذج حيوانية كنظم متكاملة للتحقيق بأي المجراة في المرغوب فيها. في هذه الدراسة، نحن تهدف إلى تطوير نموذج جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى البكتيرية حضور الحيوية استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. وبالإضافة إلى ذلك، تدرس استجابة بلعم استفزاز. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا الفلورسنت معربا عن البروتين المذهبة س. والأجنة المعدلة وراثيا الزرد معربا عن البروتينات الفلورية في الضامة بهم ووضع إجراء لحقن البكتيريا وحدها أو بالاشتراك مع الجزئي المجالات الخرز الصغير في العضلات أنسجة الأجنة. لرصد تطور العدوى البكتيرية في الأجنة الحية على مر الزمن، ونحن استنباط طريقة بسيطة ولكنها موثوقة التهديف مجهرية للبكتيريا الفلورسنت. وأظهرت النتائج من التهديف مجهرية أن جميع الأجنة مع الوحدات المكونة للمستعمرة أكثر من 20 (زيمبابوي) من البكتيريا أسفرت عن إشارة إيجابية فلورسنت من البكتيريا. لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى، حددنا الأرقام زيمبابوي في المذهبة س. مع أو بدون 10 ميكرون البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS₁₀) كنموذج الحيوية في الأجنة. وعلاوة على ذلك، قمنا باستخدام ملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست" العاملة في إيماجيج لقياس كثافة الأسفار من عدوى المكوّرات س. مع أو بدون ملاحظة:₁₀ مع مرور الوقت. وأظهرت النتائج من كلا الأسلوبين أعلى الأرقام في المذهبة س. في الأجنة المصابة مع الجزئي المجالات الخرز الصغير مما في الأجنة دون الجزئي المجالات الخرز الصغير، مما يدل قابلية إصابة بزيادة حضور مادة بيولوجية. وهكذا، يظهر هذه الدراسة إمكانيات النموذجي الجنين الزرد للدراسة بأي مع الأساليب المتقدمة هنا.

Introduction

يتزايد استخدام مجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية (يشار إليها على أنها "الحيوية") في الطب الحديث لاستعادة أو استبدال أجزاء جسم الإنسان¹. ومع ذلك، عند غرس الحيوية مريض للعدوى، دعا عدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي)، ومضاعفات رئيسية ليزرع في الجراحة. المكوّرات العنقودية الذهبية و المكوّرات العنقودية ابيديرميديس هي الأنواع البكتيرية الأكثر انتشارا هما مسؤولة بأي^2،،من^34،،من⁵⁶. مزروع النموذج الحيوية على سطح عرضه لتشكيل بيوفيلم الجرثومي. وعلاوة على ذلك، قد تكون مختل الاستجابة المناعية المحلية بالحيوية مزروع، مما تسبب في انخفاض فعالية إزالة البكتيريا. الموافقة الأولية على إصابة البكتيريا يقوم أساسا بتسلل العَدلات، التي بشدة انخفاض قدرة جراثيم حضور المدرج أو مزروع مادة بيولوجية⁷. وعلاوة على ذلك، الضامة التسلل إلى الأنسجة بعد تدفق العَدلات الأولى سوف phagocytose البكتيريا المتبقية ولكن لا يمكن فعلياً قتلهم إينتراسيلولارلي، بسبب المناعة مختل مما يشير إلى أنه نتيجة لوجود مجتمعة مادة بيولوجية والبكتيريا⁸. وهكذا، يمكن تيسير وجود الحيوية البقاء داخل الخلايا للبكتيريا^{9،10،11،،}من¹²¹³ وبيوفيلم تشكيل على مزروع الحيوية^4،14. ونتيجة لذلك، قد تؤدي إلى الفشل بأي والحاجة إلى استبدال مزروع الحيوية، مما تسبب في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات والاستشفاء المطول مع التكاليف الإضافية^2،15.

ويجري عدد متزايد من استراتيجيات مكافحة--بأي المتقدمة^2،،من¹⁶¹⁷. المجراة في تقييم فعالية هذه الاستراتيجيات في نماذج حيوانية ذات الصلة أمر ضروري. ومع ذلك، التقليدية التجريبية بأي نماذج حيوانية (مثل، الماوس نماذج) عادة ما تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لذلك غير مناسب لاختبار الإنتاجية العالية من استراتيجيات متعددة¹⁸. التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير الضوئية الحيوية استناداً إلى طرحه/فلوري تسمية الخلايا المضيفة والبكتيريا قد يسمح للرصد المستمر للتفاعلات بأي تطور والمضيف الممرض/المضيف-المواد في الحيوانات الصغيرة واحدة مثل الفئران^18،19،،من²⁰²¹. ومع ذلك، هذا الأسلوب معقد نسبيا ولا تزال في مهدها، ويجب معالجة عدة قضايا للتحليل الكمي بأي¹⁸. على سبيل المثال، مطلوب بجرعة عالية من تحدي لتصور الاستعمار الجرثومي. وبالإضافة إلى ذلك، على ضوء التشتت والامتزاز إشارات الإضاءة الحيوية/الأسفار في أنسجة الثدييات اختبار الحيوانات كما يجب تناول^18،،من¹⁹²¹. ولذلك، هي نماذج حيوانية مبتكرة، وفعالة من حيث التكلفة مما يسمح للتصور إينترافيتال والتحليل الكمي على مر الزمن قيمة النظم التكميلية للدراسة المجراة في بأي.

وقد استخدمت الزرد (الأجنة) كأداة في الحية تنوعاً لتشريح التفاعلات المضيف-مسببات المرض والإصابة المرضية للعديد من الأنواع البكتيرية مثل المتفطرة²²،²³من الزائفة الزّنجاريّة، الإشريكيّة القولونية^26،24و العنقوديات البرازية faecalis²⁵²⁷. وقد أجنة الزرد العديد من المزايا مثل الشفافية الضوئية، وتكلفة الصيانة منخفضة نسبيا، وحيازة نظام المناعة عالية مماثلة لتلك في الثدييات^28،29. وهذا يجعل الأجنة الزرد كائن نموذج الغاية الاقتصادية والمعيشية للتصور إينترافيتال وتحليل تطور العدوى والمضيف المقترنة الردود^28،29. للسماح لتصور سلوك الخلية خطوط الزرد في الحية، ومحوره وراثيا مع أنواع مختلفة من الخلايا المناعية (مثل الضامة، والعدلات) وحتى مع المعلمة فلوريسسينتلي الهياكل سوبسيلولار وقد وضعت^{28 ،29}. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر معدل الإنجاب عالية الزرد إمكانية تطوير نظم اختبار إنتاجية عالية يتميز الحقن الآلية المؤتمتة والأسفار الآلي الكمي و تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل^{27، 30}.

في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى وضع نموذج الزرد جنين للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية باستخدام تقنيات التصوير الأسفار. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير إجراء لحقن البكتيريا (S. aureus) حضور مادة بيولوجية الجزئي المجالات الخرز الصغير الأنسجة العضلية الزرد الأجنة. كنا المذهبة س. RN4220 وإذ تعرب عن مشري الفلورسنت البروتين (S. aureus-مشري)، الذي شيد كما هو موضح في مكان آخر لآخر^10،سلالة المذهبة س. ³¹. السطر الزرد المحورة وراثيا (mpeg1: UAS/كايد) معربا عن كايد واستخدمت بروتين فلوري أخضر في الضامة³² والأزرق الفلورسنت البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير. في دراسة سابقة، وقد أظهرنا أن ضخ العضلي الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة الزرد لتقليد غرس مادة بيولوجية هي عمليا³³. لتحليل كمي التقدم بأي وتسلل خلية مرتبطة في الأجنة واحد مع مرور الوقت، كنا ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست" الذي يجري تشغيله في "أوبجيكتج" (المكونات في إيماجيج) لقياس كثافة الأسفار البكتيريا المقيمين والضامة التسلل إلى محيط موقع الحقن الجزئي المجالات الخرز الصغير³³. وباﻹضافة إلى ذلك، عقدنا العزم الأرقام لتشكيل مستعمرة وحدات (زيمبابوي) من البكتيريا في الوجود والغياب الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى. لدينا هذه الدراسة يتبين أن الجنين الزرد مع الأساليب المتقدمة هنا، نموذج حيوانات الفقارية واعدة، ورواية لدراسة الإصابات المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.

Protocol

في هذا البروتوكول، وصيانة الزرد الكبار امتثالا للوائح المحلية الرفق بالحيوان كما أقرته اللجنة المحلية الرفق بالحيوان. وأجريت تجارب على الأجنة وفقا لتوجيهات 2010/63/الاتحاد الأوروبي.

1-إعداد "البكتيريا فقط" وتعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير

ملاحظة: يتم استخدام سلالة RN4220 S. aureus معربا عن البروتين الفلورسنت مشري (S. aureus-مشري). سلالة RN4220 في المذهبة س. هو تحور في أغرا (منظم الجينات الملحق A) منظم الجينات الفوعة³⁴، وذلك قد فوعة منخفضة نسبيا في الطراز الجنين الزرد. ويمكن استخدام سلالات المكوّرات س. الأخرى أو غيرها من الأنواع البكتيرية لأي.

1. يأخذ 4 إلى 5 مستعمرات من البكتيريا المكوّرات س. RN4220 من فول الصويا تريبتيك أجار الثقافة لوحات تستكمل مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول والثقافة البكتيريا إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي في 10 مل مرق الصويا تريبتيك تكملة مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية تحت تهتز.
   1. خلال الثقافة، وتمييع 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية في 900 ميليلتر من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في ومبومو (عرض 1 سم) لقياس كثافة بصرية (OD) في 620 نانومتر (OD₆₂₀). الثقافة البكتيريا حتى OD₆₂₀ يصل إلى 0.4 – 0.8.
      ملاحظة: عموما يناظر التطوير التنظيمي₆₂₀ من 0.1 3.0 x 10⁷ زيمبابوي/مل س المذهبة. OD₆₂₀ من العدوى البكتيريا في منتصف مرحلة النمو لوغاريتمي ما بين 0.4 0.8. قد يلزم فترات زمنية مختلفة لاستزراع أنواع وسلالات من البكتيريا الأخرى.
2. إعادة وقف البكتيريا الأعلاف في 1 مل PBS العقيمة والطرد المركزي البكتيريا في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق. بعد ذلك يغسل البكتيريا مع أوقات PBS 2 العقيمة، وأخيراً إعادة تعليق البكتيريا في 1.1 مل محلول₄₀ (₄₀من حماية الأصناف النباتية) بوفيدون 4% (w/v) في برنامج تلفزيوني.
3. دوامة هذا التعليق البكتيرية وتمييع ميليلتر 100 تعليق في 900 ميليلتر من PBS العقيمة في ومبومو لقياس₆₂₀ OD. ضبط تركيز تعليق البكتيرية مع الحل₄₀ حماية الأصناف النباتية. وهذا تعليق "للبكتيريا فقط".
4. ويمكن اختيار الحيوية بحرية لخلط مع تعليق البكتيرية. وتستخدم في هذه الدراسة، الجزئي المجالات التجارية البوليستيرين (PS) الخرز الصغير (الفلورية الزرقاء، 10 ميكرومتر). لإنشاء تعليق بكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير، الطرد المركزي الجزئي المجالات الخرز الصغير لمدة 1 دقيقة في 1,000 ز x، درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الجزئي في المجالات الخرز الصغير في تعليق "للبكتيريا فقط" (في حماية الأصناف النباتية₄₀ الحل).
5. من أجل حقن جرعات متساوية تقريبا من البكتيريا في الوجود وفي غياب الجزئي المجالات الخرز الصغير، تركيز التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا يجب أن يكون ثلثا تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" (بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير). ويتحقق ذلك بتمييع تعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بحجم 0.5 من حل₄₀ حماية الأصناف النباتية. مزيج أن الإيقاف قبل فورتيكسينج. من المذكرة، هذه النسبة (ثلثي) قد جرى تقييم المذهبة س. كما أنها مناسبة ابيديرميديس س.، ولكن ينصح بالتحقق من ما إذا كانت هذه النسبة ينطبق أيضا على غيرها من الأنواع البكتيرية والأحجام (من 10 ميكرون) أو الأشكال الحيوية (من الجزئي المجالات الخرز الصغير) بالحقن.
6. فحص تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" والبكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بثقافة الكمية لتخفيف المسلسل إذ وصفها أدناه: نقل 100 ميليلتر من المعلقات إلى 96 لوحة جيدا وتمييع متسلسل بنقل 10 ميليلتر مختبرين تعليق إلى 90 ميليلتر من PBS العقيمة. لوحة مختبرين ميليلتر 10 مكرر من المعلقات غير مخفف والمخفف على ألواح [اغروس]، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، عد المستعمرات وحساب أرقام البكتيريا (الوحدات المكونة للمستعمرة. زيمبابوي).

2-تربية، الحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد

1. اتبع الإجراءات العامة وصف سابق^35،36 لتربية والحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد، مع إدخال التعديلات المبينة أدناه. عبر أسرة من نوع البرية توفيل زعنفة طويلة (TL) الزرد أو الزرد للسطر المحدد وراثيا (هنا، Mpeg1: كايد) في دبابة مع صافي إضافة إلى حمل الإناث البالغات لإنتاج البيض بعد يضيء الضوء، ثم فصل البالغين من البيض المنتجة.
2. جمع الأجنة في اليوم التالي، وتجاهل تلك غير الشفافة التي لا تكون قابلة للتطبيق. تبقى حوالي 60 أجنة كل طبق بتري (100 ملم في القطر) في E3 المتوسطة³⁷ واحتضان عند 28 درجة مئوية. إزالة أجنة ميتة وغير طبيعي، وتحديث المتوسطة E3 يوميا.

3-التحضير للحقن بالإبر

1. تعد الإبر ميكروكابيلاري الزجاج للحقن باستخدام أداة ساحبة ميكروبيبيتي. استخدم الإعدادات التالية: الحرارة: 772، سحب: حطي 100،: 200، الوقت: الغاز 40،: 75.
2. كسر طرف إبرة مع الملقط في موضع الإبرة فيها قطر خارجي لما يقرب من 20 ميكرومتر (عن 10 ميكرون الجزئي المجالات الخرز الصغير)، استخدام مجهر خفيفة مع شريط مقياس في العين. تجنب الإبر مع حجم فتحه كبيرة جداً، كما أنها سوف تهدد بقاء الأجنة.
   ملاحظة: ويمكن اختيار فتح يكون أصغر أو أكبر، تبعاً لحجم وشكل الحيوية بالحقن. في الأدب، أبلغ الحقن باستخدام الإبر مع فتح من حوالي 50 ميكرومتر يسبب انخفاضا كبيرا في بقاء الجنين³⁸.

4-حقن "البكتيريا فقط" أو التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا في الأجنة الزرد

1. حرارة [اغروس] حل (1 – 1.5% (wt) في المياه ديمي) باستخدام فرن ميكروويف وتصب في طبق بتري 100 ملم. ضع قالب بلاستيكية العفن على رأس الحل [اغروس] في طبق بتري لإنشاء المسافات البادئة في [اغروس] لوضع الأجنة في المواقف المناسبة، تسهيل الحقن. احتضان في درجة حرارة الغرفة وإزالة العفن عندما قد وطدت الحل [اغروس].
2. في 3 د بعد الإخصاب، وضع الأجنة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على 0.02% (w/v) حمض 3-امينوبنزويك (تريكيني) تخدير لهم. بعد 5 دقائق، نقل الأجنة إلى اللوحة [اغروس] مضافين مع E3 المتوسطة التي تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني ومواءمتها في اتجاه واحد للحقن. Mpeg1: خط المعدلة وراثيا كايد أولاً تخدير الأجنة في E3 المتوسطة تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني. ثم حدد الأجنة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء باستخدام مجهر الأسفار ستيريو.
3. تحميل الإبرة مع حوالي 10 ميليلتر من تعليق "للبكتيريا فقط" أو البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير باستخدام تلميح ماصة ميكرولوادير. جبل الإبرة على ميكرومانيبولاتور متصلاً مايكرو-الحاقن. لتستخدم محقن هنا (انظر الجدول للمواد)، استخدام الإعدادات التالية لحقن nL 2 – 3: الضغط: الضغط الخلفي 300 – 350،: 0, الوقت: 2 مللي ثانية.
   ملاحظة: تعتمد إعدادات مايكرو-الحاقن على محقن المستخدمة. إعدادات حاقن قد تحتاج إلى تعديل لحقن البكتيريا مختلطة مع الحيوية مع أحجام أو أشكال أخرى.
   1. استخدام الإبر مع فتح نفسه لحقن تعليق "للبكتيريا فقط" ووقف البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير. إذا كان الإبرة مكسورة أو انسداد، دائماً تغيير إبرة جديدة لمزيد من الحقن.
4. إدراج الإبرة في النسيج العضلي للأجنة تحت مجهر خفيفة (الشكل 1)، بزاوية من 45-60 درجة مئوية بين الإبرة والجسم للأجنة. ضبط موضع الإبرة في الأنسجة بلطف أنها تتحرك جيئة وذهابا. حقن الأجنة باستخدام دواسة قدم متصلاً مايكرو-الحاقن.
5. بعد حقن البكتيريا الفلورسنت، نقاط الأجنة لعدوى ناجحة تحت مجهر fluorescence ستيريو. تجاهل السلبية الأجنة وسجل (لا البكتيريا الفلورسنت مرئية أو لا تظهر الجزئي الفلورسنت المجالات الخرز الصغير). الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.

5. سحق الأجنة والتهديف المجهرية، والثقافة كمية من البكتيريا

1. نقاط جميع أجنة مجهريا لوجود البكتيريا الفلورية استخدام مجهر الأسفار ستيريو، البدء فورا بعد الحقن، وفي كل يوم بعد ذلك حتى الأجنة يتم اختيارها عشوائياً للثقافة الكمية.
2. عشوائياً تحديد الأجنة المصابة حية قليلة (5 إلى 6 في هذه الدراسة) بعد الحقن بوقت قصير ونقلها على حدة إلى microtubes مل 2 منفصلة باستخدام النصائح العقيمة. إزالة المتوسطة وتغسل الأجنة بلطف مع PBS العقيمة مرة واحدة وإضافة 100 ميليلتر من PBS العقيمة.
3. إضافة الخرز الزركونيا العقيمة 2 – 3 (قطرها 2 ملم) لكل قنينة وسحق الأجنة في الخالطون باستخدام (انظر الجدول للمواد) 3,500 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. الثقافة هوموجيناتي كيفا وكما هو موضح في الخطوة 1، 3.
   ملاحظة: الخالطون أخرى قد تتطلب إعدادات مختلفة.
4. عشوائياً اختيار أجنة متعددة في الأيام اللاحقة بعد الحقن لثقافة الكمية وفقا للخطوة 5.3.

6-الأسفار مجهرية من تطور الإصابة وتسلل خلية استفزاز في الأجنة الزرد

1. تخدير الأجنة كما هو موضح في الخطوة 4، 2. "الماصة؛" 500 ميليلتر حل السليلوز الميثيل PBS-2% (wt) في طبق بتري يحتوي على المتوسطة E3 مع 0.02% (w/v) تريكيني. وضع الأجنة في الحل الميثيل السليلوز وإبقائها مستقيمة وأفقية.
   ملاحظة: يستخدم الميثيل السليلوز الحل "غراء"، الذي سبب لها اللزوجة، يمكن مؤقتاً تجميد الأجنة في اتجاه أفضل للتصوير.
2. استخدام مجهر الأسفار ستيريو مزودة بمرشحات للأجنة الصورة الفردية ضمن إعدادات الأمثل مماثلة (مثل، كثافة والكسب، والتعرض الوقت) في التكبير 160 x ميدان مشرق، مشري، والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، والأشعة فوق البنفسجية . قم بتعيين المستوى البؤري مثل الأنسجة الأضرار الناجمة عن الحقن في التركيز، باستخدام عامل التصفية حقل مشرق. تعيين عمق المكدس Z بحجم 10 ميكرون، وخطوة في 5 ميكرومتر، الذي يسمح بتسجيل الصور على التوالي 3.
3. صورة فردية الأجنة مرة واحدة يوميا من الحقن بعد ح 5 حتى 3 أيام بعد الحقن. استبعاد أجنة ميتة (لا ضربات القلب أو الجنين جزئيا المتدهورة) لمواصلة التصوير والتحليل. الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.

7-التحليل الكمي لكثافة Fluorescence تطور العدوى وتسلل خلية تسبب استخدام كائن ي ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست"

1. تحميل "الزرد-إيمونوتيست"، ودليل تفصيلي من الارتباط: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>، كما هو موضح في دراسة سابقة³³. باختصار، فتح الصور للتحليل مع "الزرد-إيمونوتيست"، يعمل بموجب برنامج مجاني "صورة ج." في كل صورة تم تحميلها، يدوياً علامة الحقن استناداً إلى تلف الأنسجة الملحوظ للأجنة.
   ملاحظة: يستخدم الموقع ملحوظة "الزرد-إيمونوتيست" كنقطة المركز للكشف عن ذروة الأسفار على مسافة 50 ميكرومتر. ثم يتم استخدام ذروة fluorescence تم الكشف عنها كمركز لمنطقة موحدة (قطرها 100 ميكرومتر) لقياس الأسفار.
2. انقر فوق "حساب" في القائمة "كائن ي" لتشغيل قياس الفلورسنت لقنوات متعددة، إذا كان ذلك ممكناً، لكل الصور تلقائياً. تصدير البيانات وتحليلها بطرق الاختبار الإحصائية المناسبة.

النتائج

هذه الدراسة تقييم مدى انطباق الزرد الأجنة كنموذج حيوانات الفقارية رواية للتحقيق في الإصابة المرتبطة بمادة بيولوجية. قد استخدمت تقنية microinjection عادة لمختلف أنواع الجراثيم بحقن الأجنة الزرد تسبب الإصابة^22،،من^2627،?...

Discussion

العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) مضاعفات سريرية خطيرة. فهم أفضل للآلية المرضية بأي المجراة في أن يوفر رؤى جديدة لتحسين الوقاية والعلاج بأي. بيد أن الحالية تجريبية بأي نماذج حيوانية مثل نماذج مورين هي مكلفة وتتطلب عمالة مكثفة، وتتطلب تدريب العاملين المتخصصين في التقنيات الجراحية المع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic soya agar	BD Difco	236950	Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth	BD Difco	211825
Polyvinylpyrrolidone40	Applichem	A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)	Life technology/ThemoFisher	F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)	Harvard Apparatus	30-0038
Micropipette puller instrument	Sutter Instrument Inc	Flaming p-97
Light microscope LM 20	Leica	MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80	Leica	MDG3610450126
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand	World Precision Instruments	00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector	Eppendorf	5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Zirconia beads	Bio-connect	11079124ZX
MagNA lyser	Roche	41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)	Biomerieux	43671	Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth)	New Brunswick Scientific	G10
Zebrafish incubator	VWR	Incu-line
Cuvettes	BRAND	759015
Centrifuge	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spectrometer	Pharmacia biotech	Ultrospec®2000
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 well-plates	Greiner bio-one	677180
96 well-plates	Greiner bio-one	655161
Petri-dish	Falcon	353003
Petri-dish	Biomerieux	NL-132
ImageJ	Not applicable	Not applicable	link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prism	Not applicable