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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente studio descrive un modello di embrione di zebrafish per videomicroscopia analisi di biomateriale infezione nel corso del tempo basato su microscopia di fluorescenza e la visualizzazione in vivo. Questo modello è un promettente sistema integrando modelli animali mammiferi quali modelli murini per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

Abstract

Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è delle principali cause del fallimento di biomateriali/dispositivi medici. Lo Staphylococcus aureus è uno dei principali patogeni a BAI. Corrente sperimentale animale mammifero di BAI modelli come modelli murini sono costosi e che richiede tempo e quindi non è adatto per analisi di rendimento elevato. Così, nuovi modelli animali come sistemi complementari per lo studio in vivo di BAI sono desiderati. Nel presente studio, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per la visualizzazione in vivo e videomicroscopia analisi dell'infezione batterica in presenza di biomateriali basati su microscopia di fluorescenza. Inoltre, è stata studiata la risposta dei macrofagi provocata. A tal fine, abbiamo usato fluorescente che esprimono proteine S. aureus e gli embrioni di zebrafish transgenici che esprimono le proteine fluorescenti in loro macrofagi e sviluppato una procedura per iniettare i batteri da soli o insieme a microsfere nel muscolo tessuto di embrioni. Per monitorare la progressione della infezione batterica negli embrioni dal vivo nel corso del tempo, abbiamo messo a punto un metodo semplice ma affidabile di scoring microscopica di batteri fluorescenti. I risultati di segnare al microscopio ha mostrato che tutti gli embrioni con più di 20 unità formanti colonie (CFU) di batteri ha prodotto un positivo segnale fluorescente di batteri. Per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione, abbiamo determinato i numeri CFU di S. aureus con e senza microsfere di 10 µm in polistirene (PS10) come biomateriali modello negli embrioni. Inoltre, abbiamo usato il file di progetto ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" operano in ImageJ per quantificare l'intensità della fluorescenza di S. aureus infezione con e senza PS10 nel corso del tempo. Risultati da entrambi i metodi hanno mostrato un numero maggiore di S. aureus infetti embrioni con microsfere che negli embrioni senza microsfere, che indica una suscettibilità aumentato di infezione in presenza il biomateriale. Così, lo studio presente indica il potenziale del modello di embrione di zebrafish per studiare BAI con i metodi sviluppati qui.

Introduzione

Una varietà di dispositivi medici (denominato "biomateriali") sono sempre più utilizzati nella medicina moderna per ripristinare o sostituire parti di corpo umano1. Tuttavia, l'impianto di biomateriali predispone un paziente all'infezione, chiamato un infezione biomateriale-collegata (BAI), che è una complicazione importante di impianti in chirurgia. Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sono due specie di batteri più prevalente responsabile BAI2,3,4,5,6. Impiantato forma biomateriali una superficie sensibile alla formazione di biofilm batterico. Inoltre, la risposta immunitaria locale può essere squilibrato di biomateriali impiantati, causando ridotta efficacia della clearance batterica. Il gioco iniziale di infettare i batteri viene eseguito principalmente da infiltrazione dei neutrofili, che hanno fortemente ridotto la capacità battericida in presenza di un inserito o impiantati biomateriale7. Inoltre, i macrofagi infiltranti il tessuto dopo l'iniziale afflusso dei neutrofili verrà fagocitare i batteri rimanenti ma non può efficacemente si uccidono intracellulare, dovuto immunitario squilibrato di segnalazione che è una conseguenza della presenza combinata di il biomateriale e batteri8. Così, la presenza di biomateriali può facilitare la sopravvivenza intracellulare di batteri9,10,11,12,13 e biofilm formazione sull'impiantati biomateriali4,14. Di conseguenza, BAI potrebbe portare al fallimento e bisogno per la sostituzione dei biomateriali impiantati, causando un aumento della morbilità e mortalità e l'ospedalizzazione prolungata con costi aggiuntivi2,15.

Un numero crescente di strategie anti-BAI è stati sviluppati2,16,17. Valutazione in vivo dell'efficacia di queste strategie in modelli animali pertinenti è essenziale. Tuttavia, tradizionale BAI modelli animali (es. modelli di mouse, ) sono solitamente costosi, che richiede tempo e quindi non adatti per elevato throughput test di più strategie18. Recente sviluppo di tecniche di imaging bio-ottico basato su bioluminescenti/fluorescente etichettatura di batteri e cellule dell'ospite può permettere per il monitoraggio continuo delle interazioni di progressione e materiale-ospite-agente patogeno/host BAI in singoli piccoli animali come topi18,19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è relativamente complessa e ancora nella sua infanzia, e diversi problemi devono essere affrontati per l'analisi quantitativa di BAI18. Per esempio, per visualizzare la colonizzazione batterica è necessaria una dose alta sfida. Inoltre, light scattering e adsorbimento di bioluminescenza/fluorescenza segnali nei tessuti dei mammiferi: saggio gli animali devono anche essere affrontate18,19,21. Di conseguenza, romanzo, conveniente modelli animali, consentendo la visualizzazione videomicroscopia e analisi quantitativa nel corso del tempo sono sistemi complementari importanti per lo studio in vivo di BAI.

Zebrafish (embrioni) sono stati usati come uno strumento versatile in vivo per la dissezione interazioni ospite-patogeno e patogenesi di infezione di varie specie batteriche come micobatteri22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25e stafilococchi26,27. Embrioni di zebrafish presentano molti vantaggi quali trasparenza ottica, un relativamente basso costo di manutenzione e possesso di un sistema immunitario molto simile a quella di mammiferi28,29. Questo rende gli embrioni di zebrafish organismo modello altamente economica, living per videomicroscopia visualizzazione e l'analisi della progressione di infezione e host associato risposte28,29. Per permettere la visualizzazione del comportamento delle cellule in vivo, transgenici zebrafish linee con diversi tipi di cellule del sistema immunitario (per esempio, macrofagi e neutrofili) e anche con strutture subcellulari fluorescente contrassegnati sono stati sviluppati28 ,29. Inoltre, il tasso di riproduzione alta di zebrafish fornisce la possibilità di sviluppare sistemi di test di velocità effettiva elevata con iniezione robot automatizzati, quantificazione automatizzata di fluorescenza e RNA sequenza analisi27, 30.

Nello studio presente, abbiamo mirato a sviluppare un modello di embrione di zebrafish per infezione biomateriale-collegata usando tecniche di imaging di fluorescenza. A tal fine, abbiamo sviluppato una procedura per iniettare batteri (Staphylococcus aureus) alla presenza di microsfere di biomateriale nel tessuto muscolare di embrioni di zebrafish. Abbiamo usato lo Staphylococcus aureus RN4220 esprimenti mCherry proteina fluorescente (s. aureus- mCherry), che è stata costruita come descritto altrove per10,un altro ceppo di Staphylococcus aureus 31. La linea di zebrafish transgenici (mpeg1: UAS/Kaede) esprimendo Kaede proteina verde fluorescente in macrofagi32 e blu fluorescente microsfere in polistirolo sono stati usati. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che l'iniezione intramuscolare di microsfere negli embrioni di zebrafish per imitare l'impianto biomateriale è fattibile33. Per analizzare quantitativamente la progressione di BAI e infiltrazione delle cellule associato a singoli embrioni nel corso del tempo, abbiamo usato il file di progetto "Zebrafish-Immunotest" che è gestito all'interno di "ObjectJ" (un plug-in per ImageJ) per quantificare l'intensità di fluorescenza di batteri che risiedono e macrofagi che si infiltrano nelle vicinanze del sito di iniezione di microsfere33. Inoltre, abbiamo determinato i numeri delle formanti colonie unità (CFU) di batteri in presenza ed assenza di microsfere negli embrioni per studiare gli effetti potenziali di biomateriali sull'infezione. Il nostro studio presente dimostra che con i metodi sviluppati qui, l'embrione di zebrafish è un promettente, romanzo vertebrato modello animale per lo studio delle infezioni associate al biomateriale in vivo.

Protocollo

In questo protocollo, manutenzione di zebrafish adulto è nel rispetto delle normative locali benessere degli animali, come approvato dal comitato locale benessere degli animali. Esperimenti con embrioni sono stati eseguiti secondo la direttiva 2010/63/UE.

1. preparazione del "Solo batteri" e sospensioni di batteri-microsfere

Nota: Il ceppo di S. aureus RN4220 espressione della proteina fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) è usato. Il ceppo di RN4220 di S. aureus è mutato il gene regolatore di virulenza agrA (regolatore genico accessorio A)34e di conseguenza potrebbe essere relativamente bassa virulenza nel modello di embrione di zebrafish. Altri ceppi di S. aureus o altre specie batteriche per BAI può essere utilizzato.

  1. Prendere 4-5 colonie di batteri di RN4220 di S. aureus da piastre di coltura agar soia triptico completati con cloramfenicolo di 10 µ g/mL e cultura i batteri alla fase di crescita metà-logaritmica in 10 mL di brodo di soia triptico completato con 10 µ g/mL cloramfenicolo a 37 ° C in agitazione.
    1. Durante la coltura, diluire 100 µ l della sospensione batterica in 900 µ l di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) in una provetta (larghezza di 1 cm) per una misurazione di densità ottica (OD) a 620 nm (OD620). Fino a quando raggiunge il OD620 0,4 – 0,8 della coltura i batteri.
      Nota: Un OD620 di 0.1 corrisponde generalmente a 3.0 x 107 CFU/mL S. aureus. Il OD620 di un inoculo di batteri in fase di crescita logaritmica metà è compreso tra 0.4-0.8. Periodi di tempo diversi per la coltura possono essere necessari per altre specie e ceppi di batteri.
  2. Centrifugare i batteri a 3.500 x g per 10 min e risospendere i batteri pellettati in 1 mL di PBS sterile. Successivamente lavare i batteri con sterile PBS 2 volte e infine Risospendere i batteri in 1,1 mL di soluzione al 4% (p/v) polivinilpirrolidone40 (PVP40) in PBS.
  3. Vortice questa sospensione batterica e diluito 100 µ l della sospensione in 900 µ l di PBS sterile in una cuvetta per la misurazione di620 OD. Regolare la concentrazione della sospensione batterica con soluzione di PVP40 . Questa è la sospensione "Solo batteri".
  4. Biomateriali possono essere scelto liberamente di mescolare con sospensione batterica. Nello studio presente, microsfere commerciale polistirolo (PS) (fluorescente blu, 10 µm) sono utilizzate. Per generare una sospensione di batteri-microsfere, centrifugare le microsfere per 1 min a 1.000 x g, temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere le microsfere in sospensione "Batteri-only" (nella soluzione di40 PVP).
  5. Al fine di iniettare dosi approssimativamente uguali di batteri in presenza e in assenza di microsfere, la concentrazione di batteri-microsfere sospensione deve essere due terzi della concentrazione della sospensione "Batteri-only" (senza microsfere). Ciò si ottiene diluendo la sospensione di batteri-microsfere con 0,5 volume di soluzione di PVP40 . Mescolare le sospensioni nel Vortex. Di nota, questo rapporto (due terzi) è stato valutato per S. aureus. È inoltre opportuno per S. epidermidis, ma si consiglia di verificare se questo rapporto vale anche per altre specie batteriche e altri formati (superiore a 10 µm) o forme di biomateriali (rispetto a microsfere) deve essere iniettato.
  6. Controllare la concentrazione della sospensione "Solo batteri" e microsfere di batteri da coltura quantitativa di 10 volte diluizioni seriali come di seguito: trasferire 100 µ l delle sospensioni a un 96-pozzetti e in serie diluire trasferendo 10 aliquote µ l della sospensione in 90 µ l di PBS sterile. Piastra duplicati 10 aliquote µ l delle sospensioni non diluite e diluite sui piatti dell'agarosi, incubare le piastre a 37 ° C durante la notte, la conta delle colonie e calcolare il numero di batteri (unità formanti colonie. CFU).

2. allevamento, raccolta e la manutenzione di embrioni di Zebrafish

  1. Seguire le procedure generali descritte precedenti35,36 per allevamento, la raccolta e la manutenzione di embrioni di zebrafish, con le modifiche descritte di seguito. Attraversare una famiglia di tipo selvaggio Tupfel lunga pinna (TL) zebrafish o Danio rerio del selezionato linea transgenica (qui, Mpeg1: Kaede) in un serbatoio con una rete aggiunto per indurre le femmine adulte per produrre uova dopo la luce si accende, quindi separare gli adulti dalle uova prodotte.
  2. Raccogliere gli embrioni il giorno successivo e scartare quelli non trasparenti che non sono sostenibili. Tenere circa 60 embrioni per piastra di Petri (100 mm di diametro) in E3 Media37 e incubare a 28 ° C. Rimuovere gli embrioni morti e anormali e aggiornare quotidianamente il mezzo di E3.

3. preparazione di aghi per iniezione

  1. Preparare i vetro microcapillary aghi per iniezione utilizzando uno strumento di estrattore micropipetta. Utilizzare le seguenti impostazioni: calore: 772, pull: 100, vel: 200, tempo: 40, gas: 75.
  2. Rompere la punta dell'ago con una pinza nella posizione dove l'ago ha un diametro esterno di circa 20 µm (per 10 µm microsfere), utilizzando un microscopio ottico con una barra di scala nell'oculare. Evitare aghi con una dimensione di apertura molto ampio, in quanto compromettono la sopravvivenza degli embrioni.
    Nota: L'apertura può essere scelti per essere più piccolo o più grande, secondo la dimensione e la forma dei biomateriali da iniettare. Nella letteratura, iniezioni con aghi con un'apertura di circa 50 µm sono state segnalate per causare una diminuzione significativa nell'embrione sopravvivenza38.

4. iniezione di "Sola batteri" o batteri-microsfere sospensione negli embrioni di Zebrafish

  1. Riscaldare la soluzione di agarosio (1 – 1,5% (wt) in demi-acqua) utilizzando un forno a microonde e versare in un piatto di Petri di 100 mm. Inserire un modello di muffa di plastica sopra la soluzione di agarosio in di Petri per creare rientranze in agarosio per posizionare gli embrioni in posizioni adeguate, facilitando le iniezioni. Incubare a temperatura ambiente e rimuovere lo stampo quando la soluzione di agarosio ha solidificato.
  2. Al momento della post-fecondazione d 3, posizionare gli embrioni in una capsula Petri 100 mm contenente 0,02% (p/v) 3-aminobenzoico (tricaina) per anestetizzare li. Dopo 5 min, trasferire gli embrioni alla piastra dell'agarosi overlaid con E3 mezzo contenente 0,02% (p/v) tricaina e allinearli con un orientamento per l'iniezione. Per il Mpeg1: Kaede transgenico linea prima anestetizzare gli embrioni in E3 Media contenente 0,02% (p/v) tricaina. Quindi selezionare embrioni che esprimono le proteine fluorescenti verde utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo.
  3. Caricare l'ago con circa 10 µ l della sospensione "Solo batteri" o batteri-microsfere utilizzando un puntale di microloader. Montare l'ago su un micromanipolatore collegato al micro-iniettore. Per l'iniettore usato qui (Vedi tabella materiali), utilizzare le seguenti impostazioni per le iniezioni di 2 – 3 nL: pressione: 300 – 350, pressione: 0, tempo: 2 ms.
    Nota: Le impostazioni per il micro-iniettore dipendono l'iniettore utilizzato. Impostazioni di iniettore potrebbero essere necessario essere regolata per iniezioni dei batteri misti con biomateriali con altre forme o dimensioni.
    1. Utilizzare aghi con la stessa apertura per l'iniezione della sospensione "Solo batteri" e la sospensione di batteri-microsfere. Se l'ago è rotto o intasato, sempre cambiare per un nuovo ago per ulteriori iniezioni.
  4. Inserire l'ago nel tessuto del muscolo di embrioni sotto un microscopio chiaro (Figura 1), ad un angolo di 45 ° – 60 ° tra l'ago e il corpo di embrioni. Regolare la posizione dell'ago nel tessuto spostandolo delicatamente avanti e indietro. Iniettare gli embrioni utilizzando un comando a pedale collegato al micro-iniettore.
  5. Dopo iniezione di batteri fluorescenti, segnare gli embrioni per infezione successo sotto un microscopio a fluorescenza stereo. Scartare il negativo di embrioni segnati (nessun batterio fluorescente visibile o non visibile microsfere fluorescenti). Mantenere gli embrioni individualmente in E3 media a 48 pozzetti. Aggiornare il mezzo ogni giorno.

5. frantumazione degli embrioni, segnando al microscopio e coltura quantitativa di batteri

  1. Punteggio ottenuto tutti gli embrioni microscopicamente la presenza di batteri fluorescenti utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo, a partire immediatamente dopo le iniezioni e ogni giorno successivo fino a quando gli embrioni sono scelti a caso per coltura quantitativa.
  2. In modo casuale selezionare alcuni embrioni infetti dal vivo (da 5 a 6 nello studio presente) poco dopo l'iniezione e trasferirli singolarmente separato 2 mL microprovette usando puntali sterili. Rimuovere il mezzo, lavare gli embrioni delicatamente con PBS sterile una volta e aggiungere 100 µ l di PBS sterile.
  3. Aggiungere microsfere di zirconio sterile di 2 – 3 (2 mm di diametro) per ogni flaconcino e schiacciare gli embrioni utilizzando l'omogeneizzatore (Vedi Tabella materiali) a 3.500 rpm per 30 s. cultura omogeneato quantitativamente come descritto al punto 1.3.
    Nota: Altri omogeneizzatori possono richiedere impostazioni diverse.
  4. Selezionare casualmente più embrioni nei giorni successivi dopo l'iniezione per coltura quantitativa secondo punto 5.3.

6. fluorescenza microscopia di progressione di infezione e l'infiltrazione delle cellule ha provocato negli embrioni di Zebrafish

  1. Anestetizzare gli embrioni come descritto al punto 4.2. Pipettare 500 µ l di una soluzione di PBS - 2% (wt) metil cellulosa in una piastra Petri contenente mezzo E3 con 0,02% (p/v) tricaina. Posizionare gli embrioni nella soluzione metil cellulosa e tenerli diritta e orizzontale.
    Nota: Metil cellulosa soluzione viene utilizzata come una "colla", che grazie alla sua viscosità, può temporaneamente immobilizzare gli embrioni migliori orientamento per l'imaging.
  2. Uso un microscopio a fluorescenza stereo dotata di campo luminoso, mCherry, proteina fluorescente verde (GFP) e UV filtri agli embrioni singoli immagine sotto impostazioni ottimizzate identiche (ad esempio, tempo di intensità, guadagno ed esposizione) a ingrandimento x 160 . Impostare il piano focale che il danno di tessuto causato tramite l'iniezione è a fuoco, utilizzando il filtro del campo luminoso. Impostare la profondità dello stack Z a 10 µm e passo dimensioni a 5 µm, che permette la registrazione di 3 immagini consecutive.
  3. Embrioni individuali di immagine una volta al giorno da 5 h post-iniezione fino al post-iniezione di 2 giorni. Escludere gli embrioni morti (nessun battito cardiaco o embrione parzialmente degradato) per ulteriori di formazione immagine e l'analisi. Mantenere gli embrioni individualmente in E3 media a 48 pozzetti. Aggiornare il mezzo ogni giorno.

7. analisi quantitativa dell'intensità di fluorescenza della progressione di infezione e l'infiltrazione delle cellule provocata mediante File di progetto oggetto J "Zebrafish-Immunotest"

  1. Scarica "Zebrafish-Immunotest" e il manuale dettagliato dal link: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, come descritto in un precedente studio33. In breve, aprire immagini per analisi con "Zebrafish-Immunotest", operante sotto il programma freeware Image J. In ogni immagine caricata, contrassegnare manualmente il sito di iniezione, basato sul danno tissutale osservato degli embrioni.
    Nota: Il sito contrassegnato è utilizzato da "Zebrafish-Immunotest" come punto centrale per rilevare il picco di fluorescenza all'interno di una distanza di 50 µm. Il picco di fluorescenza rilevati viene quindi utilizzato come centro di una zona standardizzata (diametro di 100 µm) per la misura della fluorescenza.
  2. Fare clic su "calcolo" nel menu oggetto J per eseguire le misure in fluorescenza per più canali, se applicabile, automaticamente per tutte le immagini. Esportare i dati e analizzare con metodi di test statistici appropriati.

Risultati

Il presente studio ha valutato l'applicabilità degli embrioni di zebrafish come modello animale vertebrato romanzo per indagare infezione biomateriale-collegata. Tecnica di microiniezione è stato comunemente utilizzato per iniettare diverse specie batteriche negli embrioni di zebrafish di causare infezione22,26,27,30,36. Util...

Discussione

Infezione di biomateriale-collegata (BAI) è una grave complicazione clinica. Una migliore comprensione della patogenesi di BAI in vivo sarebbe fornire nuove conoscenze per migliorare la prevenzione e il trattamento di BAI. Tuttavia, corrente modelli animali sperimentali BAI come modelli murini sono costosi, laborioso e richiedono personale specializzato addestrato nelle tecniche chirurgiche complesse. Di conseguenza, questi modelli non sono adatti per alta analisi di rendimento. Poiché i requisiti per i modelli di embr...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato finanziariamente supportato dal progetto IBIZA del programma materiale biomedico (BMM) e co-finanziato dal Ministero olandese degli affari economici. Gli autori desidera ringraziare il Dr. Graham Lieschke da Monash University, Australia per fornire la linea transgenica di zebrafish (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptic soya agarBD Difco236950Media preparation unit at AMC
Tryptic soya brothBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidone40ApplichemA2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)Life technology/ThemoFisherF8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)Harvard Apparatus30-0038
Micropipette puller instrumentSutter Instrument IncFlaming p-97
Light microscope LM 20LeicaMDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80LeicaMDG3610450126
Microloader pipette tipsEppendorf5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 standWorld Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injectorEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2ml ppSarstedt72.693.005
Zirconia beadsBio-connect11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)Biomerieux43671Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth)New Brunswick ScientificG10
Zebrafish incubatorVWRIncu-line
CuvettesBRAND759015
CentrifugeHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
SpectrometerPharmacia biotechUltrospec®2000
ForcepsSigma-AldrichF6521-1EA
48 well-platesGreiner bio-one677180
96 well-platesGreiner bio-one655161
Petri-dishFalcon353003
Petri-dishBiomerieuxNL-132
ImageJNot applicableNot applicablelink: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrismNot applicable

Riferimenti

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