Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

요약

현재 학문 vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 시간이 지나면 소재 관련 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 설명 합니다. 이 모델은 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 마우스 모델 같은 포유류 동물 모델을 보완 하는 유망한 시스템.

초록

소재 관련 감염 (바이) 바이오/의료 장치 실패의 주요 원인입니다. 황색 포도상구균 바이에 주요 병원 중 하나입니다. 현재 실험 바이 포유류 동물 모델 같은 마우스 모델은 비용이 많이 드는 고 어렵고, 따라서 높은 처리량 분석에 적합 하지 않은. 따라서, 바이 vivo에서 조사에 대 한 보완 시스템으로 새로운 동물 모델 원하는 됩니다. 현재의에서 연구, vivo에서 시각화 및 형광 현미경 검사 법에 따라 생체의 세균성 감염의 intravital 분석을 위한 zebrafish 태아 모델을 개발 하는 목적으로 우리. 또한, 만들었다 대 식 세포 반응 연구 했다. 이 위해, 우리는 형광 단백질을 표현 S. 구 균 및 그들의 세포에서 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 zebrafish 태아를 사용 하 고 근육에 혼자 또는 스피어 함께 박테리아를 주입 하는 절차를 개발 태아 조직 시간이 지남에 라이브 배아에서 세균 감염 진행을 모니터링 하려면 우리는 형광 박테리아의 미세한 득점의 간단 하지만 신뢰할 수 있는 방법을 고안. 미세한 점수에서 결과 20 이상 식민지 형성 단위 (CFU) 박테리아의 모든 배아 박테리아의 긍정적인 형광 신호를 굴복 했다. 감염에 생체의 잠재적인 효과 연구, 우리는 결정 S. 구 균 의 CFU 숫자와 10 μ m의 폴리스 티 렌 스피어 (PS₁₀) 없이 배아 생체 재료 모델. 또한, 우리 시간이 지남에 PS₁₀ 없이 S. 구 균 감염의 형광 강도 계량 ObjectJ 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest" ImageJ에서 사용. 두 방법의 결과 보다는 소재에 존재 증가 감염 민감성을 나타내는 스피어 없이 배아에 스피어와 감염 된 태아 S. 구 균 수가 보였다. 따라서, 현재 연구 여기 개발 방법으로 바이 공부 zebrafish 태아 모델의 잠재력을 보여줍니다.

서문

다양 한 의료 기기 ("바이오" 라고도 함) 점점을 복원 하거나 인체 부품¹현대 의학에서 사용 하 고 있습니다. 그러나, 생체 이식 감염, 불리는 소재 관련 감염 (바이), 임 플 란 트 수술에서의 주요 합병증에 환자를 걸리기. 포도 상 구 균 그리고 포도 상 구 균 epidermidis 두 개의 가장 널리 퍼진 세균 종 바이^2,,34,,56에 대 한 책임입니다. 이식 생체 재료 형태 표면 세균의 biofilm 형성에 취약 합니다. 또한, 로컬 면역 반응은 일으키는 세균성 클리어런스의 감소 효과 이식된 생체 재료에 의해 미친 수 있습니다. 박테리아 감염의 초기 허가 강하게 존재는 삽입 된 살 균 용량 감소 또는 이식 소재⁷호 중구 침투에 의해 주로 수행 됩니다. 또한, 후에 호 중구의 초기 유입 나머지 박테리아 phagocytose 것 있지만 수 없습니다 효과적으로 조직에 침투 하는 세포 그들을 죽 일 침,의 결합 된 존재의 결과 이다 미친된 면역 신호 때문 소재 및 박테리아⁸. 따라서, 생체 재료의 존재는 박테리아^{9,10,11,12,13} , biofilm 형성에는 이식의 세포내 생존을 촉진할 수 있다 바이오^4,14. 따라서, 바이 실패 이어질 수 있으며 추가 비용^2,15증가 병 적 상태와 사망률과 장기 입원을 일으키는 이식된 생체 재료의 교체에 대 한 필요.

개발된^2,,1617안티 바이 전략의 수가 증가 되. 이러한 전략 관련 동물 모델에서의 효능의 vivo에서 평가 필수적 이다. 그러나, 전통적인 실험적인 바이 동물 모델 (예:, 마우스 모델)은 일반적으로 비용이 많이 드는, 어렵고, 따라서 여러 전략¹⁸의 높은 처리량 테스트에 적합 하지 않은. 발광/형광 호스트 세포와 박테리아의 라벨에 따라 바이오 광 이미징 기술의 최근 발전 한 작은 동물에서 바이 진행 및 호스트 재료 호스트 병원 체 상호 작용의 지속적인 모니터링에 대 한 수 있습니다. 같은 쥐^18,19,,2021. 그러나,이 기술은 상대적으로 복잡 하 고, 그것의 초기 단계에 아직도 이며 바이¹⁸의 정량 분석에 대 한 몇 가지 문제를 해결 해야 합니다. 예를 들어, 높은 도전 복용량은 세균성 식민지를 시각화 해야 합니다. 또한, 비 산 빛을 생물 발광/형광 신호 포유류 테스트 또한 있어야 동물의 조직에의 흡착 처리^18,,1921. 따라서, 소설, 시간이 지남에 intravital 시각화 및 정량 분석에 허용 된 동물 모델에는 바이 vivo에서 공부에 대 한 귀중 한 보완 시스템입니다.

Zebrafish (배아) 호스트 병원 체 상호 작용 및 mycobacteria²², 녹 농 균²³, 등 여러 가지 세균의 감염 병 인을 해 부에 대 한 다양 한 생체 조건 도구로 사용 되었습니다. 대장균²⁴, Enterococcus faecalis²⁵, 그리고 포도 상 구 균^,2627. Zebrafish 태아 광학 투명도, 상대적으로 낮은 유지 보수 비용, 및 포유류^28,29에 매우 비슷한 면역 시스템의 같은 많은 이점이 있다. 이로써 zebrafish 태아 intravital 시각화 및 감염 진행과 관련 된 호스트 응답^28,29의 분석에 매우 경제, 생활 모형 유기 체. 셀 동작의 시각화 vivo에서, 유전자 변형 zebrafish 라인 (예:, 대 식 세포와 호 중구) 면역 세포의 종류와 고도 붙일 태그가 subcellular 구조 되었습니다^{28 개발 29}. 또한, zebrafish의 높은 복제 율 높은 처리량 테스트 시스템 자동화 로봇 주입, 자동된 형광 정량화, 그리고 RNA 순서 분석^27, 을 개발의 가능성을 제공 ³⁰.

현재 연구에 우리 형광 이미징 기술을 사용 하 여 소재 관련 감염을 위한 zebrafish 태아 모델 개발을 목적으로. 이 위해, 우리 zebrafish 태아의 근육 조직으로 소재 스피어의 박테리아 (S. 구 균)을 주입 하는 절차를 개발. S. 구 균 RN4220 표현 mCherry 형광 단백질 (균 S.-mCherry), 다른 미 균 스트레인^10,31에 대 한 설명 되어 있는 대로 만들어진 사용 했습니다. 유전자 변형 zebrafish 라인 (mpeg1: UAS/단풍나무) 표현 하는 데 녹색 형광 단백질은 세포³² 와 파란색 형광 폴리스 티 렌 스피어에 사용 되었다. 이전 연구에서 우리가 모방 소재 이식 zebrafish 태아에 스피어의 근육 주사 가능³³는 것으로 나타났습니다. 바이의 진행과 시간이 지남에 단일 배아에 관련 된 세포 침투 양적 분석을 사용 하는 척도의 형광 강도를 "ObjectJ" (플러그인 ImageJ) 내에서 운영 되는 "제 브라-Immunotest" 프로젝트 파일 있는 박테리아 그리고 세포 침투 하는 스피어³³의 사출 사이트 주변. 또한, 우리는 식민지 형성의 숫자를 결정 단위의 (CFU) 존재와 배아에 스피어의 부재에 박테리아 감염에 생체의 잠재적인 효과 공부 하. 우리의 현재 연구는 여기 개발 방법, zebrafish 태아는 소재 관련 감염 vivo에서 공부에 대 한 약속, 소설 척추 동물 모델을 보여 줍니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 로컬 동물 복지 위원회에 의해 승인 된 성인 zebrafish의 유지 보수 로컬 동물 복지 규정입니다. 배아 실험 2010/63/EU 지침에 따라 수행 했다.

1. "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 정지의 준비

참고: MCherry 형광 성 단백질 (S. 구 균-mCherry)를 표현 하는 S. 구 균 RN4220 스트레인 사용 됩니다. S. 구 균 RN4220 긴장 독성 레 귤 레이 터 유전자 아그라 (액세서리 유전자 A 레 귤 레이 터)³⁴에 돌연변이 그리고 그러므로 zebrafish 태아 모델에 상대적으로 낮은 독성을 할 수 있습니다. 다른 미 균 긴장 또는 다른 세균 종 바이 대 한 사용할 수 있습니다.

1. 10 µ g/mL 페니 보충 tryptic 콩 한 천 배양 배지에서 미 균 RN4220 박테리아의 4 ~ 5 식민지 고 중반 대 수 성장 단계 tryptic 간장 국물 10 µ g/mL와 보충의 10 mL에 박테리아 문화 떨고에서 37 ° C에서 페니입니다.
   1. 문화, 동안 100 µ L 900 µ L의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 620에서 광학 밀도 (OD) 측정 베트 (1 cm의 폭)에 있는 세균 현 탁 액의 희석 nm (OD₆₂₀). 문화는 박테리아 OD₆₂₀ 0.4-0.8에 도달할 때까지.
      참고: 0.1의 OD₆₂₀ 일반적으로 3.0 x 10에 해당⁷ CFU/mL S. 구 균. 중앙 대 수 성장 단계에 있는 박테리아의 inoculum의 OD₆₂₀ 0.4-0.8 사이입니다. 경작에 대 한 다른 기간 다른 종과 박테리아의 변종에 대 한 필요할 수 있습니다.
2. 3500 x g 10 분 동안에 박테리아를 원심 하 고 다시 살 균 PBS의 1 mL에 수송과 박테리아를 일시 중단. 이후 PBS 2 번 살 균과 박테리아를 세척 하 고 마지막으로 다시 PBS에 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone₄₀ (PVP₄₀) 솔루션의 1.1 mL에 박테리아를 중단.
3. 소용돌이이 세균성 펜션과 멧 세₆₂₀ 측정에 대 한 살 균 PBS의 900 µ L에서 현 탁 액의 희석 100 µ L. PVP₄₀ 솔루션 세균 현 탁 액의 농도 조정 합니다. 이것은 "박테리아 전용" 서 스 펜 션입니다.
4. 바이오는 세균 현 탁 액과 섞어 자유롭게 선택할 수 있습니다. 현재 연구에서 상용 폴리스 티 렌 (PS) 스피어 (파란색 형광, 10 µ m) 사용 됩니다. 박테리아-스피어 정지를 생성 하려면 1000 x g, 실 온에서 1 분 동안 스피어 원심 하 고 삭제는 상쾌한 다시 (PVP₄₀ 솔루션)에 "박테리아 전용" 서 스 펜 션에는 스피어를 중단.
5. 스피어의 부재와 존재에 박테리아의 약 복용량을 주사 하기 위하여 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 필요 (없이 "박테리아 전용" 현 탁 액의 농도의 2/3 스피어)입니다. 이 PVP₄₀ 솔루션의 0.5 볼륨 박테리아 스피어 정지를 diluting 하 여 이루어집니다. Vortexing에 의해 정지를 믹스. 메모의이 비율 (2/3)는 되었습니다 부과 S. 구 균에 대 한 있습니다. 그것은 또한 S. epidermidis, 적합 하지만 여부이 비율에도 적용 됩니다 다른 세균성 종 및 다른 (10 µ m) 보다 크기 또는 모양 (스피어) 보다 생체 재료의 주입을 확인 하는 것이 좋습니다.
6. 아래와 같이 10 직렬 희석의 양적 문화 "박테리아 전용" 및 박테리아 스피어 현 탁 액의 농도 확인: 96 잘 접시와 10 µ L aliquots의 전송 하 여 순차적으로 희석 정지의 전송 100 µ L를 살 균 PBS의 90 µ L에 현 탁 액입니다. Agarose 접시에 undiluted 및 희석 정지의 중복 10 µ L aliquots 접시, 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어, 식민지를 계산 및 박테리아 (콜로 니 형성 단위 숫자를 계산. CFU)입니다.

2. 번 식, 수확, 그리고 Zebrafish 태아의 유지 보수

1. 수정 아래에 설명 된 일반적인 절차 설명된 이전^35,36 번 식, 수확, 그리고 zebrafish 태아의 유지 보수에 대 한 따릅니다. 교차 하는 야생 타입 Tupfel 긴 탄 미 익 (TL) zebrafish 또는 선택 된 유전자 변형 선의 zebrafish의 가족 (여기, Mpeg1: 단풍나무) 유도 빛 켜 후 계란을 생산 하는 성인 여성에 추가 그물과 탱크, 다음 별도 성인 생산된 계란에서.
2. 다음 날 배아를 수집 하 고 가능한 되지 않은 투명 하지 않은 것 들을 삭제. E3 매체³⁷ 페 트리 접시 (직경에서 100 m m) 당 약 60 배아를 유지 하 고 28 ° c.에 품 어 죽은 고 비정상적인 배아를 제거 하 고 E3 매체를 매일 새로 고침.

3입니다. 주사 바늘의 준비

1. 유리 microcapillary 바늘 주입 micropipette 끌어당기는 악기를 사용 하 여에 대 한 준비. 다음 설정을 사용 합니다: 열: 772, 풀: 100, 벨: 200, 시간: 40, 가스: 75.
2. 바늘은 안구에서 눈금 막대와 가벼운 현미경을 사용 하 여 (10 µ m 스피어), 대 한 약 20 µ m의 외부 직경을가지고 위치에 집게와 바늘 팁을 휴식. 그들은 배아의 생존은 타협을 매우 큰 오프닝 크기 바늘을 하지 마십시오.
   참고: 오프닝은 작은 또는 큰 주입을 생체 재료의 형태와 크기에 따라 선택할 수 있습니다. 문학에서 주사 바늘을 사용 하 여 약 50 µ m의 개통을 가진 배아 생존³⁸에 상당한 감소를 일으키는 원인이 되기 위하여 보고 되었다.

4. "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 정지에 주입 Zebrafish 태아

1. Agarose 솔루션 (1-1.5% (wt) 데 미 물에)가 열 전자 레인지를 사용 하 여 및 100 mm 페 트리 접시에 부 어. Agarose 솔루션 위에 플라스틱 금형 서식 파일을 적절 한 위치에 배아를 배치 하 여 촉진 주사 agarose에 들여쓰기를 만들 페 트리 접시에 놓습니다. 실 온에서 incubate 고 agarose 솔루션은 고형화 하는 때 금형을 제거 합니다.
2. 3 일 후 수정에서 배아 0.02% (w/v) 3 aminobenzoic 산 (Tricaine) 그들을 anaesthetize에 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 놓습니다. 5 분 후 0.02% (w/v) Tricaine 포함 하는 E3 매체와 겹쳐 agarose 접시에 배아를 전송 하 고 주입에 대 한 한 방향으로 그들을 정렬 합니다. Mpeg1에 대 한:가 유전자 변형 라인 먼저 배아 E3 매체 포함 0.02% (w/v) tricaine에 anaesthetize. 스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 녹색 형광 단백질을 표현 하는 배아를 선택 합니다.
3. Microloader 피 펫 팁을 사용 하 여 "박테리아 전용" 또는 박테리아 스피어 현 탁 액의 약 10 µ L로 바늘을 로드 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다. 인젝터 여기 (재료의 표 참조)를 사용 하 여 다음 설정을 사용 2-3 nL의 주사에 대 한 대 한: 압력: 300-350, 다시 압력: 0 시간: 2ms.
   참고: 마이크로-인젝터에 대 한 설정을 사용 하는 인젝터에 따라 달라 집니다. 인젝터 설정을 다른 모양 또는 크기와 생체 재료와 혼합 하는 박테리아의 주사에 대 한 조정 될 필요가 있습니다.
   1. "박테리아 전용" 펜션과 박테리아 스피어 현 탁 액의 주입을 위해 같은 열기와 함께 바늘을 사용 합니다. 바늘 깨진 막힌 경우 항상 추가 주사에 대 한 새로운 바늘에 대 한 변경.
4. 태아의 몸과 바늘 사이 45-60 °의 각도에서 가벼운 현미경 (그림 1), 태아의 근육 조직에 바늘을 삽입 합니다. 부드럽게 앞뒤로 이동 하 여 조직에서 바늘의 위치를 조정 합니다. 마이크로-인젝터에 연결 하는 발 페달을 사용 하 여 배아를 주사.
5. 형광 박테리아의 주입, 후 성공적인 감염 스테레오 형광 현미경에 대 한 배아를 점수. 배아 득점 네거티브 (보이는 형광 박테리아 없음 또는 없음 보이는 형광 스피어)을 삭제 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.

5. 배아, 미세한 점수, 및 박테리아의 양적 문화의 분쇄

1. 스테레오 형광 현미경, 주사, 직후와 배아 양적 문화에 대 한 무작위로 선택 됩니다 때까지 각 후속 하루에 시작을 사용 하 여 형광 박테리아의 존재에 대 한 모든 배아를 현미경으로 점수.
2. 임의로 주입 직후 몇 라이브 감염 된 배아 (5 ~ 6 현재 연구에)을 선택 하 고 개별적으로 별도 2 mL microtubes 멸 균 팁을 사용 하 여 그들을 전송. 매체를 제거 하 고 부드럽게 살 균 PBS 가진 배아를 한 번 씻어 균 PBS의 100 µ L를 추가 합니다.
3. 각 유리병에 2-3 살 균 지 르 코니 아 구슬 (직경에서 2mm)을 추가 하 고 분쇄는 균질 화기를 사용 하 여 배아 ( 재료의 표참조) 30 3500 rpm에서 1.3 단계에서 설명한 대로 양적 s. 문화는 homogenate.
   참고: 다른 균질 다른 설정이 필요할 수 있습니다.
4. 단계 5.3에 따라 양적 문화에 대 한 주입 후에 후속 일에 여러 개의 배아를 임의로 선택 합니다.

6. 감염 진행 및 Zebrafish 태아에 있는 자극된 세포 침투의 형광 현미경 검사 법

1. Anaesthetize 배아 단계 4.2에서에서 설명한 대로. 0.02% (w/v) Tricaine E3 매체를 포함 하는 배양 접시에 PBS-2% (wt) 메 틸 셀 룰 로스 솔루션의 500 µ L 플라스틱. 메 틸 셀 룰 로스 솔루션에 배아를 놓고 직선과 수평 그들을 유지 합니다.
   참고: 메 틸 셀 룰 로스 솔루션은 "접착제", 그것의 점성으로 인해 일시적으로 영상에 대 한 최고의 방향에 배아를 무력화 할 수 있는 데 사용 됩니다.
2. 스테레오 형광 현미경을 사용 하 여 밝은 분야, mCherry, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 UV 필터 동일한 최적화 된 설정 (예:, , 이득, 강도와 노출 시간) 160 x 배율에서 이미지 개별 배아를 장착 . 주입으로 인 한 조직 손상 밝은 분야 필터를 사용 하 여 초점에 초점 평면을 설정 합니다. 3 연속 이미지의 녹음 수 있는 5 µ m에서 10 µ m 및 단계 크기에서 Z-스택 깊이 설정 합니다.
3. 이미지 개별 배아 일단 5 h까지 2 일 후 주입 후 주입에서 매일. 추가 영상 및 분석에 대 한 죽은 태아 (하트 비트 또는 배아 분할 저하)을 제외 합니다. 48-잘 접시에 E3 매체에 개별적으로 배아를 유지 합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다.

7. 감염 진행 및 개체 J 프로젝트 파일 "제 브라-Immunotest"를 사용 하 여 자극된 세포 침투의 형광 강도의 정량 분석

1. 링크에서 다운로드 "제 브라-Immunotest"와 상세한 설명서: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, 이전 연구³³에 설명 된 대로. 간단 하 게, "제 브라-Immunotest", 프리웨어 프로그램 이미지 제이 운영 분석에 대 한 이미지를 엽니다 각 로드 된 이미지에 수동으로 배아의 관찰된 조직 손상에 따라 사출 사이트를 표시 합니다.
   참고: 표시 된 사이트 50 µ m의 거리 내에서 형광 피크 검출을 중심점으로 "제 브라-Immunotest"에 의해 사용 됩니다. 검색 된 형광 피크는 형광 측정을 위한 표준화 된 지역 (100 µ m의 직경)의 중심으로 사용 됩니다.
2. 여러 채널에 대 한 형광 측정을 실행 하는 경우, 자동으로 모든 이미지에 대 한 개체 J 메뉴에서 "계산"을 클릭 합니다. 데이터를 내보내고 적절 한 통계 테스트 방법으로 분석.

결과

현재 연구 소재 관련 감염 조사에 대 한 새로운 척추 동물 모델 zebrafish 태아의 적용 평가. Microinjection 기술은 zebrafish 태아 감염^{22,,2627,30,36}원인 세균성 종 주입 하 일반적으로 사용 되었습니다. 그림 1에 표시 된 절차를 사용 하 ?...

토론

소재 관련 감염 (바이) 심각한 임상 합병증 이다. Vivo에서 바이의 pathogenesis의 이해 바이의 치료와 예방을 개선 하기 위해 새로운 통찰력을 제공할 것 이다. 그러나, murine 모델 현재 바이 동물 모델 실험 비용, 노동 집약적인, 그리고 복잡 한 수술 기술 전문된 인력 훈련 필요. 따라서, 이러한 모델 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 현재 연구 평가 여부 zebrafish 태아 바이 vivo에서, 보완 조사 소?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic soya agar	BD Difco	236950	Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth	BD Difco	211825
Polyvinylpyrrolidone40	Applichem	A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)	Life technology/ThemoFisher	F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)	Harvard Apparatus	30-0038
Micropipette puller instrument	Sutter Instrument Inc	Flaming p-97
Light microscope LM 20	Leica	MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80	Leica	MDG3610450126
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand	World Precision Instruments	00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector	Eppendorf	5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Zirconia beads	Bio-connect	11079124ZX
MagNA lyser	Roche	41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)	Biomerieux	43671	Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth)	New Brunswick Scientific	G10
Zebrafish incubator	VWR	Incu-line
Cuvettes	BRAND	759015
Centrifuge	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spectrometer	Pharmacia biotech	Ultrospec®2000
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 well-plates	Greiner bio-one	677180
96 well-plates	Greiner bio-one	655161
Petri-dish	Falcon	353003
Petri-dish	Biomerieux	NL-132
ImageJ	Not applicable	Not applicable	link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prism	Not applicable