Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Resumen

El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Resumen

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una causa importante del fracaso de los dispositivos médicos y biomateriales. Staphylococcus aureus es uno de los principales patógenos en BAI. Animal mamífero del BAI experimental actual modelos como modelos de ratón son costosos y desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para el análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, se desean que los nuevos modelos animales como sistemas complementarios para la investigación de BAI en vivo. En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infección bacteriana en presencia de biomateriales basados en la microscopía de fluorescencia. Además, se estudió la respuesta de macrófagos provocada. Para ello, utilizan fluorescentes expresando proteína de S. aureus y embriones de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en los macrófagos y desarrolló un procedimiento para inyectar bacterias solas o junto con microesferas en el músculo tejido de embriones. Para supervisar la progresión de la infección bacteriana en embriones vivos con el tiempo, ideamos un método simple pero confiable de puntuación microscópica de bacterias fluorescentes. Los resultados de puntuación microscópica demostraron que todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias dio como resultado una señal fluorescente positiva de las bacterias. Para estudiar los posibles efectos de los biomateriales en la infección, se determinó el número de UFC de S. aureus con y sin 10 μm microesferas de poliestireno (PS₁₀) como biomateriales de modelo en los embriones. Por otra parte, se utilizó el archivo de proyecto ObjectJ "Pez cebra-Immunotest" en ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de la infección de S. aureus con y sin PS₁₀ con el tiempo. Resultados de ambos métodos mostraron mayor números de S. aureus en los embriones infectados con microesferas que en embriones sin microesferas, que indica una susceptibilidad creciente de la infección en presencia de biomaterial. Así, el presente estudio muestra el potencial del modelo de embrión de pez cebra para estudiar BAI con los métodos desarrollados aquí.

Introducción

Una variedad de dispositivos médicos (que se refiere como "biomateriales") se utilizan cada vez más en la medicina moderna para restaurar o reemplazar partes del cuerpo humano¹. Sin embargo, la implantación de biomateriales predispone a un paciente a la infección, llamada una infecciones asociadas a biomateriales (BAI), que es una importante complicación de implantes en cirugía. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis son dos especies bacterianas más frecuentes responsables de BAI^2,3,4,5,6. Implantado de forma de biomateriales una superficie susceptible a la formación de biopelículas bacterianas. Por otra parte, respuesta inmune local puede ser trastornada por los biomateriales implantados, que reducirá la eficacia de remoción bacteriana. La separación inicial de infectar a las bacterias se realiza principalmente por infiltración de neutrófilos, que han fuertemente reducido capacidad bactericida en presencia de un insertado o implantan biomaterial⁷. Por otra parte, los macrófagos que infiltran el tejido después de la llegada inicial de neutrófilos a fagocitar las bacterias restantes pero no efectivamente matan intracelularmente, por desquiciados inmune señalando que es una consecuencia de la presencia combinada de el biomaterial y bacterias⁸. Así, la presencia de biomateriales puede facilitar la supervivencia intracelular de bacterias^{9,10,11,12,13} y biofilm formación en los implantados Biomateriales^4,14. En consecuencia, BAI puede llevar a la insuficiencia y necesidad de reemplazo de biomateriales implantados, causando aumento de la morbilidad y la mortalidad y la hospitalización prolongada con costes adicionales^2,15.

Un número creciente de estrategias anti-BAI está siendo desarrollados^2,16,17. Evaluación in vivo de la eficacia de estas estrategias en los modelos animales relevantes es esencial. Sin embargo, tradicional BAI animales modelos experimentales (e.g. modelos del ratón de, ) son generalmente costosos, desperdiciadores de tiempo y por lo tanto no es adecuado para las pruebas de alto rendimiento de múltiples estrategias¹⁸. Desarrollo reciente de técnicas de imagen bio-óptico basado en etiquetado fluorescente bioluminiscente de las bacterias y las células del huésped puede permitir el monitoreo continuo de las interacciones de progresión y huésped-patógeno-host-material BAI en solo animales pequeños como ratones^18,19,20,21. Sin embargo, esta técnica es relativamente compleja y aún en su infancia, y se deben abordar varios temas para el análisis cuantitativo de BAI¹⁸. Por ejemplo, una dosis de desafío alta es necesaria para visualizar la colonización bacteriana. Además, la luz dispersa y adsorción de bioluminiscencia/fluorescencia señales en tejidos de mamífero prueba animales también deben ser abordados^18,19,21. Por lo tanto, modelos animales novedosos y rentables permitiendo la visualización intravital y análisis cuantitativo en el tiempo son valiosos sistemas complementarios para el estudio in vivo de BAI.

Pez cebra (embriones) se han utilizado como una herramienta versátil en vivo para disección huésped-patógeno y patogenia de la infección de varias especies bacterianas como micobacterias²², aeruginosa de los Pseudomonas²³, Escherichia coli²⁴, Enterococcus faecalis²⁵y estafilococos^26,27. Embriones de pez cebra tienen muchas ventajas tales como transparencia óptica, un relativamente bajo coste de mantenimiento y de posesión de un sistema inmune muy similar a la de mamíferos^28,29. Esto hace que los embriones de pez cebra un organismo modelo muy económico, vivir para intravital visualización y análisis de la progresión de la infección y host asociado respuestas^28,29. Para permitir la visualización del comportamiento de la célula líneas de pez cebra transgénico, en vivo con diferentes tipos de células inmunes (por ejemplo,, los macrófagos y neutrófilos) e incluso con estructuras subcelulares fluorescencia de etiquetado han sido desarrollado^{28 ,29}. Además, la tasa alta de reproducción del pez cebra ofrece la posibilidad de desarrollar sistemas de prueba de alto rendimiento con inyección robótica automatizada, cuantificación de fluorescencia automatizada y RNA secuencia análisis^{27, 30}.

En el presente estudio, el objetivo fue desarrollar un modelo de embrión de pez cebra para infecciones asociadas a biomateriales usando técnicas de imágenes de fluorescencia. Para ello, hemos desarrollado un procedimiento para inyectar bacterias (S. aureus) en presencia de microesferas de biomaterial en el tejido muscular de los embriones de pez cebra. Utilizamos S. aureus RN4220 expresando mCherry proteína fluorescente (S. aureus- mCherry), que fue construida como se describe en otra parte de otra cepa de S. aureus ^10,31. La línea de pez cebra transgénico (mpeg1: UAS/Kaede) expresando Kaede se utilizaron proteína verde fluorescente en los macrófagos³² y azul fluorescente poliestireno microesferas. En un estudio previo, hemos demostrado que la inyección intramuscular de microesferas en embriones de pez cebra para imitar la implantación del biomaterial es factible³³. Para analizar cuantitativamente la progresión de BAI y la infiltración de la célula asociada en embriones solo con el tiempo, se utilizó el archivo de proyecto "Pez cebra-Immunotest" que funciona dentro de "ObjectJ" (un plug-in para ImageJ) para cuantificar la intensidad de fluorescencia de las bacterias que residen y macrófagos infiltración en las cercanías del sitio de la inyección de microesferas³³. Además, se determinó el número de la Colonia formando unidades (UFC) de bacterias en presencia y ausencia de microesferas en los embriones para estudiar posibles efectos de los biomateriales en la infección. El presente estudio demuestra que con los métodos desarrollados aquí, el embrión de pez cebra es un prometedor novela vertebrado animal modelo para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Protocolo

En este protocolo, mantenimiento del pez cebra adulto es conforme a las normas locales de bienestar animal aprobado por el Comité de bienestar de los animales locales. Se realizaron experimentos con embriones según la Directiva 2010/63/UE.

1. preparación de ""las bacterias-sólo y suspensiones de microesferas de bacterias

Nota: Se utiliza la cepa de S. aureus RN4220 expresan la proteína fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry). La cepa de S. aureus RN4220 mutada en el gen regulador de virulencia agrA (gene accesorio regulador A)³⁴y por lo tanto puede tener relativamente baja virulencia en el modelo de embrión de pez cebra. Pueden utilizarse otras cepas de S. aureus o especies bacterianas para BAI.

1. Tomar 4 a 5 colonias de bacterias de Staphylococcus aureus RN4220 de soja tríptica placas agar suplidas con cloranfenicol 10 de μg/mL de y cultura de las bacterias en fase de crecimiento medio logarítmicos en 10 mL de caldo de soja tríptica suplementado con 10 μg/mL cloranfenicol a 37 ° C bajo agitación.
   1. En cultura, diluir 100 μl de la suspensión bacteriana en 900 μl de tampón de fosfato estéril salino (PBS) en una cubeta (ancho de 1 cm) para una medición de la densidad óptica (OD) a 620 nm (OD₆₂₀). Las bacterias de la cultura hasta el OD₆₂₀ alcanza 0,4 – 0,8.
      Nota: Un OD₆₂₀ de 0.1 corresponde generalmente a 3.0 x 10⁷ UFC/mL de S. aureus. OD₆₂₀ de un inóculo de bacterias en fase de crecimiento logarítmico media está entre 0.4-0.8. Diferentes períodos de tiempo para el cultivo pueden ser necesaria para otras especies y cepas de bacterias.
2. Centrifugue las bacterias a 3.500 x g por 10 min y resuspender las bacterias concentradas en 1 mL de PBS estéril. Posteriormente Lave las bacterias con estéril PBS 2 veces y finalmente resuspender las bacterias en 1.1 mL de solución al 4% (w/v) polivinilpirrolidona₄₀ (PVP₄₀) en PBS.
3. Vórtice de esta suspensión bacteriana y diluir 100 μl de la suspensión en 900 μl de PBS estéril en una cubeta para la medición de OD₆₂₀ . Ajustar la concentración de la suspensión bacteriana con solución de₄₀ de PVP. Se trata de la suspensión "Sólo en bacterias".
4. Biomateriales se pueden elegir libremente para mezclar con la suspensión bacteriana. En el presente estudio, se utilizan microesferas de poliestireno comercial (PS) (fluorescente azul, 10 μm). Para generar una suspensión de microesferas de bacterias, las microesferas durante 1 min a 1.000 x g, temperatura de la centrífuga, deseche el sobrenadante y resuspender las microesferas en suspensión "Sólo las bacterias" (en la solución de₄₀ de PVP).
5. Con el fin de inyectar dosis aproximadamente iguales de bacterias en presencia y en ausencia de microesferas, la concentración de la suspensión de microesferas de bacterias debe ser dos tercios de la concentración de la suspensión "Sólo las bacterias" (sin microesferas). Esto se logra mediante la dilución de la suspensión de microesferas de bacterias con 0,5 volumen₄₀ de PVP. Mezclar las suspensiones con un vórtex. De la nota, esta relación (dos tercios) se ha evaluado para S. aureus. También es apropiado para S. epidermidis, pero se aconseja comprobar si esta relación también se aplica a otras especies bacterianas y otros tamaños (a 10 μm) o formas de biomateriales (que microesferas) que se inyecta.
6. Compruebe la concentración de la suspensión "Sólo bacterias" y microesferas de bacterias por cultivo cuantitativo de diluciones seriadas 10 veces como abajo: transferir 100 μl de las suspensiones a un 96 placa de la pozo y diluidas en serie transfiriendo 10 alícuotas de μl de la suspensión en 90 μl de PBS estéril. Placa duplicados partes alícuotas de 10 μl de las suspensiones sin diluir y diluidas en las placas de agarosa, incubar las placas a 37 ° C durante la noche, contar las colonias y calcular el número de bacterias (unidades formadoras de colonias. UFC).

2. crianza, cosecha y mantenimiento de los embriones de pez cebra

1. Siga el procedimiento general descrito anterior^35,36 para cría, cosecha y mantenimiento de embriones de pez cebra, con las modificaciones que se describen a continuación. Cruz de una familia de pez cebra de aleta larga (TL) de Tupfel tipo salvaje o pez cebra de la línea transgénica seleccionada (aquí, Mpeg1: Kaede) en un tanque con una red añadido para inducir a las hembras para producir huevos después de que la luz se enciende, luego separar adultos de los huevos producidos.
2. Recoger los embriones el día siguiente y descartar las no transparentes que no son viables. Mantener aproximadamente 60 embriones por placa de Petri (100 mm de diámetro) en el E3 media³⁷ e incubar a 28 ° C. Eliminar embriones muertos y anormales y actualizar diariamente el medio de E3.

3. preparación de agujas de inyección

1. Preparar las agujas de microcapillary de vidrio para la inyección con un instrumento de tirador de la micropipeta. Utilice la siguiente configuración: calor: 772, pull: 100, vel: 200, tiempo: 40, gas: 75.
2. Romper la punta de la aguja con pinzas en la posición donde la aguja tiene un diámetro exterior de aproximadamente 20 μm (para 10 μm microesferas), utilizando un microscopio de luz con una barra de escala en el ocular. Evite las agujas con un tamaño de abertura muy grande, ya que pondrá en peligro la supervivencia de los embriones.
   Nota: La apertura puede ser escogida para ser más o menos grandes, dependiendo del tamaño y forma de biomateriales que se inyecta. En la literatura, las inyecciones con agujas con una abertura de aproximadamente 50 μm se han divulgado para causar una disminución significativa en la supervivencia de embriones³⁸.

4. inyección de ""bacterias-sólo o suspensión de microesferas de bacterias en embriones de pez cebra

1. Calentar la solución de agarosa (1 – 1,5% en peso en agua desmineralizada) usando un horno de microondas y verter en un plato de Petri de 100 mm. Coloque una plantilla de plástico encima de la solución de agarosa en la caja Petri para crear indentaciones en la agarosa para la colocación de embriones en posición adecuada, facilitar las inyecciones. Incubar a temperatura ambiente y retire el molde cuando la solución de agarosa ha solidificado.
2. En la post-fertilización 3 d, coloque los embriones en caja Petri de 100 mm que contiene 0.02% (w/v) 3-aminobenzoico ácido (Metanosulfonato) para anestesiarlos. Después de 5 min, transferir los embriones a la placa de agarosa con E3 media que contiene 0,02% (p/v) Metanosulfonato y alinearlos en una orientación para la inyección. Para el Mpeg1: línea transgénica Kaede anestesiar primero embriones en E3 media Metanosulfonato de 0.02% (w/v) que contiene. Seleccionar embriones que expresan proteínas fluorescentes verdes usando un microscopio de fluorescencia estéreo.
3. Carga de la aguja con aproximadamente 10 μl de la suspensión "Sólo bacterias" o microesferas de bacterias utilizando una pipeta de microloader. Coloque la aguja sobre un micromanipulador conectado al inyector de micro. Para el inyector usado aquí (véase tabla de materiales), uso la siguiente configuración para las inyecciones de 2 – 3 nL: presión: 300 – 350, presión: 0, tiempo: 2 ms.
   Nota: La configuración de la micro-inyector depende el inyector utilizado. Configuración del inyector deba ajustarse a las inyecciones de bacterias mezcladas con biomateriales con otras formas o tamaños.
   1. Utilizar agujas con la misma apertura para la inyección de la suspensión de ""las bacterias-sólo y la suspensión de microesferas de bacterias. Si la aguja está rota u obstruida, cambie siempre una aguja nueva para más inyecciones.
4. Inserte la aguja en el tejido muscular de embriones bajo un microscopio de luz (figura 1), en un ángulo de 45 – 60 ° entre la aguja y el cuerpo de los embriones. Ajustar la posición de la aguja en el tejido moviéndolo suavemente hacia adelante y hacia atrás. Inyectar los embriones mediante un pedal conectado al inyector de micro.
5. Después de la inyección de bacterias fluorescentes, anotar los embriones para infección exitosa bajo un microscopio de fluorescencia estéreo. Deseche la negativa de embriones anotadas (ningunas bacterias fluorescentes visibles o no visibles microesferas fluorescentes). Mantener embriones individualmente en E3 medio en placas de 48 pocillos. Actualizar diariamente el medio.

5. trituración de embriones puntuación microscópica y cultivo cuantitativo de bacterias

1. Anotar todos los embriones microscópicamente para detectar la presencia de bacterias fluorescentes utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo, comenzando inmediatamente después de las inyecciones y en cada día subsiguiente hasta que los embriones se seleccionan aleatoriamente para cultivo cuantitativo.
2. Al azar seleccione unos embriones infectados vivo (5 a 6 en el presente estudio) poco después de la inyección y transferirlos individualmente para microtubos de 2 mL separadas con puntas estériles. Quiten el medio los embriones suavemente con PBS estéril una vez y añadir 100 μl de PBS estéril.
3. Añadir granos de zirconia estéril de 2 – 3 (a 2 mm de diámetro) a cada vial y aplastar a los embriones con el homogenizador (véase Tabla de materiales) a 3.500 rpm durante 30 s. cultura el homogeneizado cuantitativamente como se describe en el paso 1.3.
   Nota: Otros homogeneizadores pueden necesitar ajustes diferentes.
4. Al azar seleccione múltiples embriones en días posteriores después de la inyección de la cultura cuantitativa según paso 5.3.

6. fluorescencia microscopía de la progresión de la infección y la infiltración celular provocada en embriones de pez cebra

1. Anestesiar los embriones como se describe en el paso 4.2. Pipetear 500 μl de una solución de PBS - 2% (peso) metil celulosa en una placa Petri conteniendo medio de E3 con 0,02% (p/v) Metanosulfonato. Coloque los embriones en la solución de metil celulosa y mantenerlas rectas y horizontales.
   Nota: Solución de celulosa de metilo se utiliza como un "pegamento", que debido a su viscosidad, puede inmovilizar temporalmente embriones en la mejor orientación para la proyección de imagen.
2. Uso un microscopio de fluorescencia estéreo equipado con campo brillante, mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) y UV filtros a los embriones individuales imagen idéntica configuración optimizado (e.g., intensidad, aumento y exposición tiempo) con 160 aumentos . Establecer el plano focal de forma que el daño tisular causado por la inyección es en el foco, utilizando el filtro de campo brillante. Ajuste la profundidad de Z-stack 10 tamaño μm y paso a 5 μm, que permite la grabación de 3 imágenes consecutivas.
3. Imagen individual los embriones una vez al día de la inyección después de 5 h hasta después de la inyección 2 días. Excluir embriones muertos (ningún latido del corazón o embrión parcialmente degradados) para más imágenes y análisis. Mantener embriones individualmente en E3 medio en placas de 48 pocillos. Actualizar diariamente el medio.

7. análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia de progresión de la infección e infiltración celular provocado con objeto J archivo de proyecto "Pez cebra-Immunotest"

1. Descargar "Pez cebra-Immunotest" y el manual detallado del enlace: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, como se describe en un anterior estudio³³. En Resumen, abrir imágenes para el análisis con "Pez cebra-Immunotest", bajo el programa freeware imagen J. En cada imagen cargada, marcar manualmente el sitio de la inyección basado en el daño tisular observado de embriones.
   Nota: El sitio marcado se utiliza por "Pez cebra-Immunotest" como el punto central para detectar el pico de fluorescencia a una distancia de 50 μm. El pico de fluorescencia detectado se utiliza entonces como el centro de un área estandardizada (diámetro de 100 μm) para medición de fluorescencia.
2. Haga clic en "cálculo" en el menú objeto J para ejecutar la medición fluorescente para múltiples canales, si procede, automáticamente todas las imágenes. Exportar los datos y analizar por métodos de la prueba estadística apropiada.

Resultados

El presente estudio evaluó la aplicabilidad de los embriones de pez cebra como modelo animal vertebrado novela para investigar infecciones asociadas a biomateriales. Técnica de la microinyección se ha utilizado comúnmente para inyectar diferentes especies bacterianas en embriones de pez cebra para causar infección^{22,26,27,30,36<...}

Discusión

Infecciones asociadas a biomateriales (BAI) es una complicación clínica grave. Una mejor comprensión de la patogenesia del BAI en vivo ofrecería nuevas ideas para mejorar la prevención y tratamiento de BAI. Sin embargo, experimental BAI animales modelos actuales como modelos murinos son costosos, que requieren mucho trabajo y requieren personal especializado entrenado en las técnicas quirúrgicas complejas. Por lo tanto, estos modelos no son adecuados para el análisis de alto rendimiento. Requisitos para modelos d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptic soya agar	BD Difco	236950	Media preparation unit at AMC
Tryptic soya broth	BD Difco	211825
Polyvinylpyrrolidone40	Applichem	A2259.0250
10 µm diameter polystyrene microspheres (blue fluorescent)	Life technology/ThemoFisher	F8829
Glass microcapilary (1 mm O.D. x 0.78 mm I.D.)	Harvard Apparatus	30-0038
Micropipette puller instrument	Sutter Instrument Inc	Flaming p-97
Light microscope LM 20	Leica	MDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Stereo fluorescent microscope LM80	Leica	MDG3610450126
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulator M3301 with M10 stand	World Precision Instruments	00-42-101-0000
FemtoJet express micro-injector	Eppendorf	5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Zirconia beads	Bio-connect	11079124ZX
MagNA lyser	Roche	41416401
MSA-2 plates (Mannitol Salt Agar-2)	Biomerieux	43671	Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Gyrotory shaker (for bacterial growth)	New Brunswick Scientific	G10
Zebrafish incubator	VWR	Incu-line
Cuvettes	BRAND	759015
Centrifuge	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spectrometer	Pharmacia biotech	Ultrospec®2000
Forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 well-plates	Greiner bio-one	677180
96 well-plates	Greiner bio-one	655161
Petri-dish	Falcon	353003
Petri-dish	Biomerieux	NL-132
ImageJ	Not applicable	Not applicable	link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prism	Not applicable