تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإعداد عينات من الحمض النووي من المواد الغذائية والبيئية ميكروبيوميس لكشف متضافرة و subtyping السالمونيلا عن طريق التسلسل كواسيميتاجينوميك. الاستخدام المشترك لإثراء الثقافة والفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتشرد متعددة يسمح التضخيم (MDA) فعالية تركيز الحمض النووي السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية.

Abstract

التسلسل ظاهرياً-ميتاجينوميكس يشير إلى تحليل على أساس التسلسل ميكروبيوميس المعدلة للغذاء والعينات البيئية. ويهدف تعديل ميكروبيومي في هذا البروتوكول، تركيز الحمض النووي من ملوث مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية المستهدفة تيسير الكشف عن و subtyping من مسببات المرض في سير عمل واحد. نشرح هنا، وإظهار خطوات إعداد نموذج لتحليل شبه ميتاجينوميكس انتيريكا السالمونيلا من التمثيل الغذائي والعينات البيئية بما في ذلك براعم البرسيم، فلفل أسود مطحون، الأرض لحوم البقر، الدجاج الثدي ومسحات البيئية. وتخضع عينات أولاً في إثراء الثقافة السالمونيلا لمدة أقصر وقابل للتعديل (ح 4 – 24). ثم بشكل انتقائي خلايا السالمونيلا يتم التقاطها من ثقافة الإثراء بفصل إيمونوماجنيتيك (IMS). وأخيراً، يتم التضخيم التشرد متعددة (MDA) لتضخيم الحمض النووي من الخلايا التي تم الاستيلاء عليها نظام الرصد الدولي. يمكن تسلسل إخراج الحمض النووي لهذا البروتوكول بمنصات تسلسل إنتاجية عالية. يمكن إجراء تحليل PCR كمي اختياري لاستبدال تسلسل للكشف عن السالمونيلا أو تقييم تركيز السالمونيلا الحمض النووي قبل التسلسل.

Introduction

نظرياً يسمح تسلسل Metagenomics كشف متضافرة و subtyping من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية. ومع ذلك، عينات المواد الغذائية تحديات لتحليل العوامل الممرضة حسب التسلسل مباشرة من ميكروبيومي الغذائية. أولاً، مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية غالباً ما تكون الحالي عند مستويات منخفضة في عينات المواد الغذائية. تتطلب معظم الأساليب المتاحة تجارياً الكشف السريع لا يزال ح 8 – 48 استزراع لإثراء الممرض الخلايا إلى مستوى الاكتشاف¹. ثانيا، الكثير من الأطعمة تحتوي على خلايا النبت وفيرة و/أو الطعام الحمض النووي، مما يجعل DNA مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية نسبة ضئيلة من المواد الغذائية ميتاجينومي وهدفا بعيد المنال عن الكشف و subtyping مباشرة التسلسل الجينومية.

تم الإبلاغ عن تعديل للمواد الغذائية ميكروبيوميس السماح بتركيز كبير من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الحمض النووي لتسهيل الكشف على أساس تسلسل شيغا السمية المنتجة الإشريكيّة القولونية^2،3 و انتيريكا السالمونيلا⁴. نظراً لأن تعديل المواد الغذائية ميكروبيوميس لا يزال مخاليط أنواع الميكروبية المختلفة، ويطلق على تسلسل شبه الجينومية تحليل⁴. يمكن إجراء تعديل ميكروبيومي بإثراء الثقافة وحدها^2،3 ، أو في تركيبة مع فصل إيمونوماجنيتيك (IMS) ومتعددة التشرد التضخيم (MDA)^4،5. يمكن التقاط نظام الرصد الدولي بشكل انتقائي خلايا الممرض من ثقافة الإثراء عن طريق الخرز المغناطيسي المغلفة بالأجسام المضادة. نجمة داود الحمراء يمكن أن تولد كميات كافية من الحمض النووي للتسلسل عن طريق بوليميراز الدنا ɸ29 ذات كفاءة عالية⁶. نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء أتاح كشف الممرض ثقافة مستقلة من⁷من العينات السريرية، وتقصير لإثراء الثقافة لكشف شبه الجينومية و subtyping السالمونيلا في الغذاء عينات⁴.

والهدف العام لهذا الأسلوب إعداد شبه ميتاجينوميك الحمض النووي من عينات الأغذية للسماح بتركيز المستهدفة السالمونيلا المجينية الحمض النووي والكشف عن اللاحقة و subtyping الملوث السالمونيلا بالتسلسل. مقارنة بالأساليب القياسية للكشف عن السالمونيلا ^8،9 subtyping¹⁰، ونهج كواسيميتاجينوميك يمكن اختصار إلى حد كبير الزمنية اللازمة من الأغذية الملوثة، والعينات البيئية إلى الأنواع الفرعية الجزيئية لمسببات المرض بتوحيد البلدين عادة فصل التحليلات إلى سير عمل واحد. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص للتطبيقات مثل الاستجابة لمقتضيات الفاشية المنقولة وأخرى تتبع التحقيقات مرة أخرى حيث subtyping الممرض قوية مطلوب بالإضافة إلى الكشف عن العوامل الممرضة والتداول التحليلية السريع المهم.

Protocol

1. إعداد نموذج

ملاحظة: تعد العينات الغذائية لتخصيب اليورانيوم قبل وفقا لدليل مختبر الميكروبيولوجيا (MLG) من "الإدارة الأميركية لسلامة الأغذية الزراعة" و "دائرة التفتيش" (وزارة الزراعة-فوزية)¹¹ ودليل التحليل البكتريولوجي (BAM) من "الولايات المتحدة للأغذية" و المخدرات الإدارة (FDA)¹².

1. أسيبتيكالي مكان جزء 25 جرام من عينة غذائية مثل فلفل أسود والدجاج واللحم، وبراعم البرسيم أو مسحه بيئية داخل كيس خلاط مختبر عقيمة مع عامل تصفية مضمن. إعداد مسحه بيئية التي أسيبتيكالي يبلل الأسفنج مع مرق تخصيب اليورانيوم (فاسيلياديس رابابورت، RV). ثم اسحب المسحة على كامل سطح أو منطقة محددة سلفا ووضعه داخل كيس خلاط مختبر.

رقم 1: التمثيل الغذائي والعينات البيئية لكشف شبه ميتاجينوميكس و subtyping من السالمونيلا. توضع العينات في أكياس ستوماتشير تصفية العقيمة جنبا إلى جنب مع مرق RV. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. مزيج دقيق كل عينة ز 25 مع 225 مل إثراء RV مرق باستخدام مختبر خلاط أو من ناحية تدليك لمدة 30 ثانية.
   ملاحظة: يمكن استخدام متغيرات مرق RV حسبما أوصت به MLG وأم تبعاً لأنواع العينات.
3. احتضان خليط مرق تخصيب عينة في حاضنة مختبر في 42 درجة مئوية ح 4 – 24.
4. بعد الحضانة، جمع عينة فرعية 50 مل من مرق الإثراء من الجانب الذي تم تصفيته من الحقيبة في أنبوب الطرد مركزي منفصلة 50 مل.
5. الطرد المركزي الأنبوب في 100 غ س لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام الصلبة في هوموجيناتي.
6. استعادة المادة طافية بعناية للطرد المركزي جديد 50 مل أنبوب والطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,000 – 6,000 س ز لمدة 10 دقيقة لاستعادة خلية بيليه.
7. (اختياري) تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه بإعادة تعليق في 5 مل من الماء ببتون مخزنة (الاتحاد) والطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,000 – 6,000 × ز لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: الاتحاد يمكن إعداد حل 10 غم من ببتون، 5 غ كلوريد الصوديوم، g 3.5 من ثنائي الفوسفات، و 1.5 غرام فوسفات مونوبوتاسيوم في 1 لتر من الماء المقطر. ينبغي تعديل درجة الحموضة نهائياً إلى 7.2 ± 0.2 عند 25 درجة مئوية. يمكن أيضا استخدام اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية عن 15 دقيقة الاتحاد المتاحة تجارياً.
8. تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 5 مل الاتحاد.

2-الفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتضخيم التشرد متعددة (MDA)

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل بين العينات، العمل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء تغيير نصائح الماصة لكل أنبوبة، تجنب لمس الأنبوب مع ماصة ولا تضع أنابيب قريبة من بعضها البعض في موقف المغناطيسي أثناء الخطوة الغسيل.

1. ذوبان الجليد المخزن المؤقت الذي عينة ورد فعل المخزن المؤقت من الطقم MDA على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في وقت مبكر.
2. بيليه في الاتحاد مع 20 ميكروليتر من مكافحةالسالمونيلا الخرز في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مل 1 ميكس إعادة تعليق خلية ووضعه في خلاط الدورية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: النباتات قادرة على المنافسة والجسيمات الدهون والبروتينات في بيليه ريسوسبينديد يمكن أن تتداخل مع نظام الرصد الدولي. تمييع بيليه إعادة تعليق خلية في الاتحاد مفيدة الحد من الخسائر في المجمعاتالسالمونيلا حبة-من موقف المغناطيسي أثناء الغسيل الخطوات.
3. إدراج هذه الأنابيب في موقف المغناطيسية والسماح 3 دقيقة لاسترداد الخرز السليم بعكس الرف عدة مرات إلى تركيز الخرز في بيليه على جانب الأنبوب.
4. تبقى الأنابيب على الوقوف المغناطيسية. نضح وتجاهل المادة طافية من كل أنبوبة، فضلا عن السائل المتبقي في كاب كل أنبوبة.
   ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم تعكير بيليه حبات IMS على الجدار الجانبي للأنبوب ضد المغناطيس.
5. إزالة أنبوب حامل من موقف المغناطيسية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% (v/v) بوليسوربيت 20) وعكس عدة مرات لإزالة البكتيريا الملزمة غير تحديداً من المجمع.
6. كرر الخطوات من 2، 3 – 2.5 مرتين.
7. بعد الغسيل 3^rd ، إجراء فصل المغناطيسية النهائي الخرز بتكرار الخطوات 2، 3 – 2.4. إزالة أنابيب من الرف المغناطيسية ووضعها في [ميكروفوج] 1 s تدور أسفل الخرز. ثم، ضع الأنابيب في الرف المغناطيسية لمدة 3 دقائق قبل إزالة أي المخزن المؤقت غسيل المتبقية.
8. إعادة تعليق المجمعاتالسالمونيلا حبة-في 9 ميكروليتر من عينة المخزن المؤقت، واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تمسخ.
9. بعد التبريد إلى 4 درجات مئوية على الجليد، الجمع بين 9 ميكروليتر من المخزن المؤقت لرد فعل زائد 1 ميكروليتر من إنزيم مزيج والحفاظ على الجليد.
10. في cycler حرارية، احتضان أنابيب عند 30 درجة مئوية ح 2 للتضخيم، متبوعاً بتدفئة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط الإنزيم وباردة إلى 4 درجات مئوية على الجليد.
11. تقييم كمية ونوعية المنتجات نجمة داود الحمراء بقياس تركيز الحمض النووي والنقاء (260/280 نسبة > 1.8) على صك فلوروسبيكتروميتير.
    ملاحظة: بسبب الربط غير محددة من نظام الرصد الدولي الخرز، الحمض النووي من الكائنات الحية عدا السالمونيلا المحتمل أن تكون موجودة في منتجات جمعية نجمة داود الحمراء، ولكن فإنه لا يؤثر على تحليل المتلقين للمعلومات.
12. تخزين المنتجات النهائية (20 ميكروليتر) في-20 درجة مئوية حتى استخدام PCR الوقت الحقيقي و/أو إعداد المكتبة للتسلسل كواسيميتاجينوميكس.

3. في الوقت الحقيقي بكر

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ل 1) الكشف عن السالمونيلا دون subtyping، و 2) تقييم نوعية العينة قبل التسلسل كواسيميتاجينوميكس.

1. إعداد 18 ميكروليتر مزيج PCR كل عينة، تتضمن العالمي بكر سيد مزيج (10 ميكروليتر)، إلى الأمام التمهيدي (2 ميكروليتر، 900 نانومتر)، عكس التمهيدي (2 ميكروليتر، 900 نانومتر)، مسبار (2 ميكروليتر، 250 نانومتر)، والمياه الصف الجزيئية (2 ميكروليتر).
   ملاحظة: السالمونيلا-كبسولة تفجير اليغنوكليوتيد محددة (إلى الأمام: كتكاككاجاجاتاكاكاتج، عكس: أجكتكاجاككاااجتجاككاتك) وصممت مسبار لتضخيم تسلسل 94-بي بي داخل الجينات بعد (لا الانضمام إلى بنك الجينات. AF 282268)¹³.
2. مزيج المنتج MDA من الخطوة 2.12 بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاًالسالمونيلا مجمعات حبة-جنبا إلى جنب مع سائل لإنشاء تعليق. إضافة 2 ميكروليتر من التعليق إلى 18 ميكروليتر من مزيج PCR.
3. تشغيل PCR الوقت الحقيقي استخدام بروتوكول PCR الوقت الحقيقي أمثل، تحديد فترات عقد اثنين، واحد في 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وأخرى عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية ل 60 ثانية.
4. حساب عتبة دورة (Ct)، وهو عدد الدورات اللازمة للأسفار من تضخيم الحمض النووي لعبور خط العتبة.
   ملاحظة: يتم تعيين عتبة الخط في المرحلة الخطية بين خط الأساس والهضبة قطع التضخيم من العينات. نتائج سلبية تتوافق مع القيم المقطعية أكثر من 40 أو عينات بالأشعة المقطعية قيم أعلى من المراقبة السلبية.

4-المكتبة إعداد تسلسل كواسيميتاجينوميك

ملاحظة: يمكن متسلسلة منتجات جمعية نجمة داود الحمراء بكل قصيرة قراءة وقراءة طويلة (نانوبوري) منصات التسلسل. استخدام أحدث إصدار من الحمض النووي مجموعات المكتبة الإعدادية المقدمة من الشركات المصنعة لمنصات التسلسل. القيام بإعداد مكتبة الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. استخدام بروتوكول الحمض النووي الجينومي 2D المدخلات المنخفضة لإعداد مكتبة ل منصة طويلة-قراءة التسلسل⁵. لإعداد مكتبة لمنصة قراءة قصيرة التسلسل، وإجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة ترد أدناه.

1. اتباع أساليب إعداد المكتبة القياسية بإضافة حلول العازلة والمواد الكاشفة لمنتجات جمعية نجمة داود الحمراء. نقل 40 ميكروليتر من المنتجات MDA التسلسل هيأهم للوحة جديدة وإضافة 20 ميكروليتر من PCR تنقية حبات لكل بئر.
2. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق دون المصافحة.
3. أغسل حبات مع الإيثانول 80% وجاف الخرز لمدة 12 دقيقة.
4. إعادة تعليق الخرز المجففة في ميكروليتر 53 من المخزن المؤقت لاستثارة واحتضان لمدة 2 دقيقة دون أن تهتز.
5. تمييع وتجمع مكتبات اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: 10:00 م المجمعة ومكتبة التشويه والتحريف جاهز الآن لتكون متسلسلة.

النتائج

قبل التسلسل كواسيميتاجينوميك، يمكن تقييم مجمل كمية ونقاء المنتجات نظام الرصد الدولي-جمعية نجمة داود الحمراء التي فلوروسبيكتروميتير (الجدول 1).

وقت التخصيب (ح)

قيمة الأشعة ال...

Discussion

بسبب وفرة منخفضة كثيرا ومتجانسة في وجود السالمونيلا في الغذاء والعينات البيئية، إثراء الثقافة أمام جمعية نجمة داود الحمراء--نظام الرصد الدولي ما زال ضروريا للكشف عن السالمونيلا و subtyping؛ ولذلك خطوة حاسمة للبروتوكول. تحديد الشروط المثلى لزيادة الوفرة من السالمونيلا بالنسبة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory blender bag w/filter	VWR	10048-886
Buffered peptone water	Oxoid Micorbiology Products	CM0509
Rappaport Vassiliadis broth	Neogen Acumedia	7730A
Polysorbate 20	Millipore Sigma	P9416	Tween 20
Stomacher blender	Seward	30010108
Centrifuge	Fisher Scientific	75005194
50ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-6
Thermal Cycler	Techne Prime	EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler	Applied Biosystems	4.76357
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit	Illumina	FC-131-1024	Store at -80C
MinIon library prep kit	Oxford Nanopore	SQK-LSK108	Store at -80C
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads	Applied Biosystems	71002	Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix	GE Healthcare	25-6600-30	Store at -80C
HulaMixer	Invitrogen	15920D
DynaMag magnetic rack	Invitrogen	12321D
TaqMan Universal PCR mastermix	Applied Biosystems	4304437	Mix well before use; store at 4C
Microfuge	Fisher Scientific	05-090-100