ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין דגימות דנ א מזון, סביבתית microbiomes זיהוי מתואמת, subtyping של חיידקי סלמונלה דרך רצף quasimetagenomic. שימוש משולב של העשרת תרבות, immunomagnetic ההפרדה (IMS) ועקירה מרובים הגברה (מד א) מאפשרת ריכוז אפקטיבי של DNA גנומי סלמונלה מזון ודוגמאות סביבתיים.

Abstract

רצף קוואזי-metagenomics מתייחס ניתוח המבוסס על רצף של microbiomes שונה של מזון ודוגמאות סביבתיים. ב פרוטוקול זה, microbiome השינוי נועד להתרכז הדנ א של מזהם הפתוגן והקאה היעד כדי להקל על הזיהוי ו subtyping לנגיף בזרימת עבודה בודד. כאן, אנחנו מסבירים ומדגימים הצעדים הכנה דגימה לניתוח קוואזי-metagenomics של סלמונלה enterica מן המזון נציג ודוגמאות סביבתי כולל נבטי אלפלפה, פלפל שחור גרוס, בשר בקר, עוף חזה מטליות סביבתיים. דוגמאות הן נתון קודם העשרת תרבות של סלמונלה עבור מקוצר, הניתנים לשינוי משך (h 4 – 24). סלמונלה תאים ואז באופן סלקטיבי נלכדים מתרבות העשרה על-ידי immunomagnetic ההפרדה (IMS). לבסוף, הזחה מרובים הגברה (מד א) מבוצע כדי להגביר את ה-DNA של התאים שנתפסו-IMS. פלט ה-DNA של פרוטוקול זה יכול רציף על ידי פלטפורמות רצף תפוקה גבוהה. ניתן לבצע ניתוח ה-PCR כמותי אופציונלי כדי להחליף את רצף לגילוי סלמונלה או להעריך את הריכוז של סלמונלה DNA לפני רצף.

Introduction

Metagenomics רצף תיאורטית מאפשר זיהוי מתואמת subtyping של פתוגנים והקאה. עם זאת, דוגמאות מזון מציגים אתגרים לניתוח הפתוגן על ידי רצף ישירה של microbiome האוכל. ראשית, והקאה פתוגנים נוכחים לעתים קרובות ברמות נמוכות בדגימות מזון. רוב השיטות לזיהוי מהיר זמינים מסחרית עדיין דורשים h 8 – 48 culturing להעשיר את הפתוגן לתאים לזיהוי רמה¹. שנית, מזונות רבים מכילים תאים microflora שופע ו/או מזון שהופך והקאה הפתוגן DNA חלק קטן של מזון metagenome, יעד חמקמק עבור זיהוי ו subtyping ישיר metagenomic רצף ה-DNA.

שינוי של מזון microbiomes דווחה כדי לאפשר ריכוז משמעותי של פתוגן והקאה דנ א כדי להקל על זיהוי מבוסס על רצף של שיגה לייצור הרעלן Escherichia coli^2,3 ו- סלמונלה enterica⁴. כי שינוי המזון microbiomes הם עדיין תערובות של מינים שונים של חיידקים, רצף שלהם נקראת כמו ניתוח קוואזי-metagenomic⁴. Microbiome השינוי יכול להתבצע על ידי תרבות העשרה לבד^2,3 או בשילוב עם immunomagnetic ההפרדה (IMS), מספר הזחה הגברה (מד א)^4,5. IMS יכול ללכוד באופן סלקטיבי תאים הפתוגן מתרבות ההעשרה בעזרת מצופים נוגדן beads מגנטי. מד א ניתן להפיק כמויות מספיקות של דנ א גנומי רצף דרך ה-DNA פולימראז יעילים ביותר ɸ29⁶. מד א-IMS אפשרה זיהוי הפתוגן תלויית תרבות של דגימות קליניות⁷, וקיצור של העשרת תרבות לגילוי קוואזי-metagenomic subtyping של חיידקי סלמונלה דגימות מזון⁴.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להכין את ה-DNA קוואזי-metagenomic של דוגמאות מזון כדי לאפשר ריכוז ממוקד של דנ א גנומי סלמונלה וזיהוי הבאים subtyping של החומר סלמונלה על ידי רצף. בהשוואה בשיטות הרגילות סלמונלה זיהוי^8,9 , subtyping¹⁰, הגישה quasimetagenomic יכול לקצר משמעותית את משך העבודה של מזון מזוהם ודוגמאות הסביבה כדי מולקולרית תתי סוגים של המחלה על ידי המאחד השני בדרך כלל מופרדים ניתוחים לתוך זרימת עבודה יחידה. שיטה זו שימושית במיוחד עבור יישומים כגון והקאה פרוץ התגובה אחרים חקירות האחורי של מעקב שבו פתוגן עמיד subtyping נדרש בנוסף זיהוי הפתוגן, אספקה מהיר אנליטי הוא חשוב.

Protocol

1. הכנת הדוגמא

הערה: דוגמאות מזון מוכנים מראש העשרה לפי המדריך מעבדה מיקרוביולוגיה (מלג) של ארצות הברית מחלקת של חקלאות בטיחות המזון ואת פיקוח שירות (USDA-FSIS)¹¹ בקטריולוגית ידני אנליטי (BAM) של המזון, סמים המינהל (FDA)¹².

1. גילוח ורחיצה כירורגית מקום חלק 25 גרם מזון דגימת כגון פלפל שחור, חזה עוף, בשר בקר טחון, נבטי אלפלפה או ספוגית סביבתיים לתוך שקית בלנדר המעבדה סטרילית עם מסנן מובנה. הכן של ספוגית סביבתיים על ידי גילוח ורחיצה כירורגית הרטבה ספוג עם מרק העשרה (רפפורט-Vassiliadis, RV). לאחר מכן, גרור את הספוגית מעל כל פני השטח או אזור מוגדר מראש ומקם אותה לתוך שקית בלנדר מעבדה.

איור 1: מזון נציג ודוגמאות סביבתיים זיהוי קוואזי-metagenomics, subtyping של חיידקי סלמונלה. דוגמאות מוצבים שקיות מסנן סטרילי צנטריפוגות יחד עם מרק RV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. לערבב ביסודיות כל מדגם 25 גרם 225 מ ל RV העשרה מרק באמצעות עיסוי בלנדר או יד מעבדה עבור 30 s.
   הערה: וריאציות של מרק RV כמומלץ על ידי מלג ובום עשוי לשמש בהתאם סוגי מדגם.
3. דגירה להעשרת-דוגמת מרק תערובת ב חממה מעבדה ב 42 ° C עבור 4 – 24 h.
4. לאחר דגירה, לאסוף subsample 50 מ ל מרק העשרה מהצד המסוננת של התיק בשפופרת צנטרפוגה נפרד 50 מ.
5. Centrifuge את הצינור ב- 100 גרם x 10 דקות להוציא פסולת מוצקה homogenate.
6. לשחזר את תגובת שיקוע בקפידה כדי 50 מ ל חדש צנטריפוגה שפופרת ואת centrifuge הצינורות ב 3,000 – 6,000 g x 10 דקות להתאושש תא גלולה.
7. (אופציונלי) למחוק את תגובת שיקוע לשטוף בגדר על ידי re-השעיה ב 5 מ של מים Peptone Buffered (BPW), centrifuge הצינורות ב 3,000 – 6,000 g × 10 דקות.
   הערה: BPW יכול שהוכנו על ידי המסת 10 גרם של peptone, 5 גר' נתרן כלורי, 3.5 g של ניתרן פוספט, ו- 1.5 גר' monopotassium פוספט 1 L של מים מזוקקים. ה-pH הסופי צריך להתאימו כך 7.2 ± 0.2 ב 25 º C. ניתן להשתמש גם אוטוקלב-121 ºC במשך 15 דקות BPW זמינים מסחרית.
8. למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 5 מ של BPW.

2. Immunomagnetic (IMS) והגליונות הזחה מרובים הגברה (מד א)

הערה: למניעת זיהום צולב בין דגימות, בעבודות אבטחה של ארון, לשנות פיפטה טיפים לכל שפופרת, להימנע מלגעת ברכבת התחתית עם פיפטה וכן אין מקום צינורות צמודים מעמד מגנטי במהלך השלב כביסה.

1. להפשיר מראש המאגר מדגם ועל המאגר התגובה הערכה מד א על קרח או ב 4 ° C.
2. לערבב 1 מ"ל של תא מחדש על תנאי הצניפה ב BPW עם μL 20 שלסלמונלה חרוזים אנטי - 1.5 mL microcentrifuge צינורות ומניחים אותו על המיקסר מסתובבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: פלורה תחרותי חלקיקים שומן, חלבונים בבגדר resuspended יכולים להפריע IMS. דילול של גלולה תא מחדש על תנאי ב BPW שימושי להפחית את אובדןסלמונלה מתחמי חרוז - מדוכן מגנטי במהלך שטיפת מדרגות.
3. להכניס הצינורות הדוכן מגנטי ולאפשר 3 דקות עבור התאוששות נאותה של חרוזים על-ידי היפוך ארון התקשורת מספר פעמים לרכז את החרוזים לתוך גלולה בצד של הצינור.
4. לשמור על הצינורות על הדוכן מגנטי. האחות וזורקים את תגובת שיקוע כל שפופרת, כמו גם את הנוזל הנותר ב קאפ כל שפופרת.
   הערה: יש להיזהר לא להפריע בגדר של חרוזים IMS על הקיר בצד של הצינור נגד המגנט.
5. הסר בעל שפופרת של הדוכן מגנטי להוסיף 1 מ"ל שטיפת מאגר (PBS המכילה 0.05% (v/v) polysorbate 20), היפוך מספר פעמים כדי להסיר הלא ספציפית מחייבת חיידקים מן המתחם.
6. חזור על שלבים 2.3-2.5 פעמיים.
7. לאחר לשטוף את 3^rd , לבצע הפרדה מגנטית הסופי של חרוזים מאת לחזור על השלבים 2.3 – 2.4. להסיר את צינורות מתלה מגנטי ומניחים microfuge 1 s כדי לסובב את החרוזים. אז, במקום הצינורות בארון מגנטי במשך 3 דקות לפני הסרת כל מאגר לשארי שטיפת.
8. מחדש להשעות אתסלמונלה מתחמי חרוז - ב-9 μL דוגמת המאגר, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות עבור דנטורציה.
9. לאחר קירור עד 4 ° C על קרח, לשלב עם μL 9 תגובה מאגר פלוס 1 μL של האנזים לערבב ולהשאיר על קרח.
10. ב הצנטרפוגה תרמי, דגירה צינורות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 h עבור הגברה, ואחריו חימום-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית את האנזים וקריר עד 4 ° C על קרח.
11. להעריך את כמות ואיכות המוצרים מד א על ידי מדידת את ריכוז הדנ א ואת טוהר (260/280 יחס > 1.8) על מכשיר fluorospectrometer.
    הערה: בגלל הכריכה לא ספציפית של חרוזים IMS, הדנ א של אורגניזמים שאינם סלמונלה עשויה להיות נוכח המוצרים מד א, אך זה אינו משפיע על ניתוח במורד הזרם.
12. חנות המוצרים הסופיים (20 μL) ב-20 ° C עד לשימוש בזמן אמת PCR ו/או ספריה לקראת רצף quasimetagenomics.

3. בזמן אמת PCR

הערה: שלב זה הוא אופציונלי עבור 1) מזהה את סלמונלה ללא subtyping, ו- 2) הערכת איכות מדגם לפני רצף quasimetagenomics.

1. להכין μL 18 של תערובת PCR לכל דגימה, המכיל מאסטר PCR אוניברסלי לערבב (10 μL), להעביר פריימר (2 μL, 900 ננומטר), הפוך פריימר (2 μL, 900 ננומטר), בדיקה (2 μL, 250 nM), ומים כיתה מולקולרית (2 μL).
   הערה: סלמונלה-לנוקלאוטידים ספציפי (לפנים: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, הפוך: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC), בדיקה נועדו להגביר את רצף 94-bp בתוך הגן ttr (GenBank ההצטרפות לא. AF 282268)¹³.
2. לערבב את המוצר מד א מ שלב 2.12 על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטהסלמונלה מתחמי חרוז - יחד עם נוזלי כדי ליצור השעיה. להוסיף 2 μL של ההשעיה לתוך μL 18 תערובת PCR.
3. הפעלת PCR בזמן אמת באמצעות פרוטוקול ה-PCR אופטימיזציה בזמן אמת, קביעת שתי תקופות המעצר, אחד ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות והשני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C 60 s.
4. חישוב מחזור הסף (Ct), שהוא מספר מחזורים הדרושות על ידי קרינה פלואורסצנטית מהדנ מוגבר לחצות את קו סף.
   הערה: נקבע קו סף בשלב ליניארי בין קו הבסיס הרמה של החלקות הגברה של דגימות. תוצאות שליליות תואמות לערכים Ct מעל 40 או דגימות עם Ct ערכים גבוהים יותר של שליטה שלילי.

4. ספריית לקראת רצף Quasimetagenomic

הערה: המוצרים מד א יכול להיות רציף על ידי שני קצר לקרוא, לקרוא הרבה זמן (nanopore) רצף פלטפורמות. להשתמש בגירסה העדכנית ביותר של ה-DNA ספריית ערכות ההכנה שסופקו על-ידי היצרנים של פלטפורמות רצף. לבצע הכנה ספריית דנ א על פי הוראות היצרנים. השתמש 2D נמוך קלט גנומית DNA בפרוטוקול להכנה ספריית פלטפורמה רצף ארוך-קריאה⁵. הכנה ספריה עבור פלטפורמת רצף קצר-קריאה, שינויים מזעריים פרוטוקול של היצרן ניתנים להלן.

1. עקוב אחר שיטות הכנה ספרייה תקנית על-ידי הוספת מאגר פתרונות ריאגנטים מוצרים מד א. ΜL 40 של המוצרים מד א רצף מוכנה להעביר צלחת חדשה ולהוסיף 20 μL של ה-PCR טיהור חרוזים מכל קידוח.
2. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מבלי לרעוד.
3. לשטוף את החרוזים עם 80% אתנול ויבש את החרוזים למשך 12 דקות.
4. מחדש להשעות חרוזים יבשים ב- 53 μL resuspension מאגר, דגירה למשך 2 דקות מבלי לרעוד.
5. לדלל, מאגר ספריות בעקבות ההוראה של היצרן.
   הערה: pM 10 איחדו, ספריית שפגע בסימני מוכן כעת היה לסדרם.

תוצאות

לפני quasimetagenomic רצף, ניתן להעריך את הכמות הכוללת ואת טוהר המוצרים IMS-מד א על-ידי fluorospectrometer (טבלה 1).

...

העשרה זמן (h)

ערך ct

ריכוז (ng/ul)

טוהר (260/280)

Discussion

בשל שפע לעתים קרובות נמוכה נוכחות בהומוגנית של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות, העשרת תרבות לפני IMS-מד א הכרחי עדיין זיהוי סלמונלה , subtyping; לכן שלב קריטי של הפרוטוקול. כדי לזהות תנאים אופטימליים כדי להגביר את השפע של סלמונלה יחסית דוגמת רקע פלורה, עשויים להעריך העשרה שונים מדיה ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory blender bag w/filter	VWR	10048-886
Buffered peptone water	Oxoid Micorbiology Products	CM0509
Rappaport Vassiliadis broth	Neogen Acumedia	7730A
Polysorbate 20	Millipore Sigma	P9416	Tween 20
Stomacher blender	Seward	30010108
Centrifuge	Fisher Scientific	75005194
50ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-6
Thermal Cycler	Techne Prime	EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler	Applied Biosystems	4.76357
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit	Illumina	FC-131-1024	Store at -80C
MinIon library prep kit	Oxford Nanopore	SQK-LSK108	Store at -80C
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads	Applied Biosystems	71002	Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix	GE Healthcare	25-6600-30	Store at -80C
HulaMixer	Invitrogen	15920D
DynaMag magnetic rack	Invitrogen	12321D
TaqMan Universal PCR mastermix	Applied Biosystems	4304437	Mix well before use; store at 4C
Microfuge	Fisher Scientific	05-090-100