Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni di DNA da alimentare e ambientale microbiomi per rilevamento concertato e tipizzazione di Salmonella mediante sequenziamento di quasimetagenomic. L'uso combinato di arricchimento della cultura, separazione immunomagnetica (IMS) e cilindrata più amplificazione (MDA) permette efficace concentrazione del DNA genomico di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.

Abstract

Quasi-metagenomica sequenziamento si riferisce all'analisi basata su sequenziamento dei microbiomi modificate di cibo e campioni ambientali. In questo protocollo, microbiome modificazione è progettato per concentrare il DNA genomico di un contaminante di agente patogeno alimentare destinazione per facilitare l'individuazione e definizione di sottotipo dell'agente patogeno in un unico flusso di lavoro. Qui, spiegare e dimostrare la procedura di preparazione del campione per l'analisi metagenomica quasi di Salmonella enterica da alimentari rappresentativi e campioni ambientali tra cui germogli di erba medica, pepe nero macinato, macinato di manzo, petto di pollo e tamponi ambientali. Campioni vengono prima sottoposti all'arricchimento della cultura della Salmonella per una durata ridotta e regolabile (4 – 24 h). Salmonella cellule quindi vengono acquisite in modo selettivo dalla coltura di arricchimento di separazione immunomagnetica (IMS). Infine, amplificazione multipla di cilindrata (MDA) viene eseguita per amplificare il DNA dalle cellule di IMS-catturato. L'output di DNA del presente protocollo possa essere sequenziato da piattaforme di sequenziamento di throughput elevato. Un'analisi PCR quantitativa opzionale può essere eseguita per sostituire sequenziamento per rilevamento di Salmonella o valutare la concentrazione di Salmonella del DNA prima di sequenziamento.

Introduzione

Metagenomica sequenziamento permette teoricamente di rilevamento concertato e tipizzazione di agenti patogeni di origine alimentare. Tuttavia, campioni alimentari presentano sfide all'analisi dell'agente patogeno mediante sequenziamento diretto del microbioma cibo. In primo luogo, patogeni di origine alimentare sono spesso presenti a livelli bassi in campioni alimentari. La maggior parte dei metodi di rilevazione rapida commercialmente disponibili ancora richiedono 8 – 48 h coltura per arricchire patogeni e cellule a un livello rilevabile¹. In secondo luogo, molti alimenti contengono abbondante microflora cellule e/o cibo del DNA, che rende il DNA di agenti patogeni di origine alimentare una piccola frazione del metagenoma di cibo e un obiettivo sfuggente per rilevazione e definizione di sottotipo di metagenomica sequenziamento diretto.

Modifica del cibo microbiomi è stato segnalato per consentire la notevole concentrazione di patogeni di origine alimentare DNA per facilitare il rilevamento basato sul sequenziamento di Shiga tossina Escherichia coli^2,3 e Salmonella enterica⁴. Perché alimenti microbiomi sono ancora miscele di differenti specie microbiche, loro sequenziamento è definito come di analisi metagenomica quasi⁴. Microbioma modifica può essere eseguita da cultura arricchimento da solo^2,3 , o in combinazione con separazione immunomagnetica (IMS) e più cilindrata amplificazione (MDA)^4,5. IMS è in grado di catturare in modo selettivo patogeni e cellule dalla coltura di arricchimento tramite biglie magnetiche rivestite con anticorpo. MDA può generare una quantità sufficiente di DNA genomico per la sequenza attraverso il ɸ29 altamente efficiente della polimerasi del DNA⁶. IMS-MDA ha permesso il rilevamento del patogeno coltura-indipendente da campioni clinici⁷e accorciando l'arricchimento della cultura per il rilevamento di quasi-metagenomica e tipizzazione di Salmonella in campioni di cibo⁴.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preparare quasi metagenomici DNA da campioni di alimenti per consentire mirate concentrazione del DNA genomico di Salmonella e successivo rilevamento e sottotipizzazione del contaminante Salmonella mediante sequenziamento. Paragonato ai metodi standard per Salmonella rilevamento^8,9 e¹⁰di sottotipizzazione, l'approccio di quasimetagenomic sostanzialmente possibile accorciare i tempi di turnaround da alimenti contaminati ed i campioni ambientali sottotipi molecolari dell'agente patogeno unificando i due in genere separata analisi in un unico flusso di lavoro. Questo metodo è particolarmente utile per applicazioni come risposta alle epidemie trasmesse da alimenti e altre indagini di schiena traccia dove robusto patogeno sottotipizzazione è richiesto oltre al rilevamento del patogeno e rapida inversione di tendenza analitica è importante.

Protocollo

1. preparazione del campione

Nota: Campioni di prodotti alimentari sono preparati per pre-arricchimento secondo la Guida di laboratorio di microbiologia (MLG) di Stati Uniti Dipartimento di agricoltura sicurezza alimentare e Inspection Service (USDA-FSIS)¹¹ e manuale analitico batteriologico (BAM) della US Food e Drug Administration (FDA)¹².

1. Asetticamente posto una porzione di 25 g di campione di cibo come il pepe nero, petto di pollo, carne macinata e germogli di erba medica o un tampone ambientale in un sacchetto di laboratorio sterile frullatore con un filtro incorporato. Preparare un tampone ambientale inumidendo asetticamente una spugna con brodo di arricchimento (Rappaport-Vassiliadis, RV). Trascinare il tampone su tutta la superficie o area predeterminata, quindi metterlo in un sacchetto di frullatore di laboratorio.

Figura 1: alimentari rappresentativi e campioni ambientali per il rilevamento di quasi-metagenomica e tipizzazione di Salmonella. I campioni vengono inseriti in sacchetti stomacher filtro sterile insieme al brodo di RV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Miscelare accuratamente ogni campione di 25 g con 225 mL di arricchimento RV brodo utilizzando un massaggio di blender o mano di laboratorio per 30 s.
   Nota: Varianti di brodo RV come consigliato da MLG e BAM possono essere utilizzati a seconda dei tipi di campione.
3. Incubare la miscela di brodo di arricchimento del campione in un incubatore da laboratorio a 42 ° C per 4 – 24 h.
4. Dopo l'incubazione, è necessario raccogliere un sottocampione di 50 mL di brodo di arricchimento dal lato filtrato della borsa in una provetta da centrifuga separata 50 mL.
5. Centrifugare la provetta a 100 x g per 10 min rimuovere detriti solidi nell'omogeneato.
6. Recuperare il surnatante attentamente per un nuovo 50 mL Centrifugare la provetta e centrifugare le provette a 3.000-6.000 x g per 10 min recuperare il pellet cellulare.
7. (Opzionale) Scartare il surnatante e lavare la pallina di risospensione in 5ml di Buffered Peptone Water (BPW) e centrifugare le provette a 3.000-6.000 × g per 10 min.
   Nota: BPW può preparato dalla dissoluzione 10 g di peptone, 5 g di cloruro di sodio, 3,5 g di disodio fosfato, e 1,5 g di fosfato monopotassico in 1 L di acqua distillata. Il pH finale deve essere regolato a 7,2 ± 0,2 a 25 ° C. Utilizzabile anche sterilizzare in autoclave a 121 ° c per 15 min. BPW commercialmente disponibili.
8. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di BPW.

2. immunomagnetica separazione (IMS) e amplificazione multipla di cilindrata (MDA)

Nota: Per evitare contaminazioni tra campioni, lavorare in una cappa di biosicurezza, cambiare i puntali delle pipette per ogni tubo, evitare di toccare il tubo con la pipetta e non collocare tubi ravvicinati in stand magnetico durante la fase di lavaggio.

1. Scongelare la sample buffer e il buffer di reazione dal kit di MDA in ghiaccio o a 4 ° C in anticipo.
2. Mescolare 1 mL di ri-sospensione cellulare a pellet a BPW con 20 μL di anti -Salmonella perline in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionarlo sul miscelatore rotante per 30 min a temperatura ambiente.
   Nota: Flora competitiva, particelle di grasso e proteine nel sedimento risospeso possono interferire con IMS. Diluizione di pellet cellulare risospeso in BPW è utile per ridurre la perdita dei complessi perle -Salmonella dal supporto magnetico durante fasi di lavaggio.
3. Inserire le provette nel supporto magnetico e consentire 3 min per il corretto recupero dei branelli capovolgendo il rack diverse volte a concentrare le perle in una pallina sul lato del tubo.
4. Mantenere le provette sul supporto magnetico. Aspirare e scartare il surnatante da ciascuna provetta, come pure il liquido restante nel tappo di ogni tubo.
   Nota: Fare attenzione a non disturbare il pellet di perline IMS sulla parete laterale del tubo contro il magnete.
5. Rimuovere il supporto del tubo dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (PBS contenente 0,05% (v/v) polisorbato 20) e capovolgendo per rimuovere batteri di legame non specifico dal complesso.
6. Ripetere i passaggi da 2.3 – 2.5 due volte.
7. Dopo il lavaggio 3^rd , eseguire la definitiva separazione magnetica di perline ripetendo i passaggi 2.3 – 2.4. Rimuovere i tubi dal rack magnetico e metterli in un microfuge per 1 s per far girare giù perline. Quindi, posizionare i tubi nel rack magnetico per 3 minuti prima di togliere qualsiasi residuo di tampone.
8. Risospendere i complessi diSalmonella perle - in 9 μL di tampone del campione e incubare a 95 ° C per 3 min per denaturazione.
9. Dopo raffreddamento a 4 ° C il ghiaccio, si combinano con 9 μL di tampone di reazione più 1 μL di enzima mescolare e tenere sul ghiaccio.
10. In un termociclatore, incubare le provette a 30 ° C per 2 h per l'amplificazione, seguita da riscaldamento a 65 ° C per 10 min per inattivare l'enzima e raffreddare a 4 ° C sul ghiaccio.
11. Valutare la quantità e la qualità dei prodotti MDA misurando la concentrazione del DNA e la purezza (260/280 ratio > 1,8) su uno strumento di fluorospectrometer.
    Nota: A causa del legame non specifico di perline IMS, DNA genomico da organismi diversi da Salmonella è probabile che sia presente nei prodotti di MDA, ma non influisce sulla analisi a valle.
12. Conservare i prodotti finali (20 μL) a-20 ° C fino a uso per PCR Real-Time e/o preparazione di libreria per il sequenziamento di quasimetagenomics.

3. Real-Time PCR

Nota: Questo passaggio è facoltativo per 1) rilevazione di Salmonella senza sottotipi e 2) valutare la qualità del campione prima del sequenziamento di quasimetagenomics.

1. Preparare 18 μL di miscela PCR per campione, contenente Universal PCR Master Mix (10 μL), forward primer (2 μL, 900 nM), reverse primer (2 μL, 900 nM), sonda (2 μL, 250 nM) e acqua di grado molecolare (2 μL).
   Nota: Salmonella-iniettori del oligonucleotide specifico (in avanti: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, reverse: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) e sonda sono stati progettati per amplificare una sequenza di 94 punti di ebollizione all'interno del gene ttr (accessione no. AF 282268)¹³.
2. Mescolare il prodotto MDA dal punto 2.12 pipettando delicatamente su e giù per perle -Salmonella complessi con liquido per creare una sospensione. Aggiungere 2 μL della sospensione in 18 μL di miscela PCR.
3. Eseguire PCR in tempo reale utilizzando un protocollo PCR in tempo reale ottimizzato, specificando due periodi di detenzione, uno a 50 ° C per 2 min e un altro a 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 60 s.
4. Calcolare il ciclo soglia (Ct), che è il numero di cicli necessari per la fluorescenza da DNA amplificato per attraversare la linea di soglia.
   Nota: La linea di soglia è impostata nella fase lineare tra la linea di base e Altopiano degli appezzamenti amplificazione di campioni. Risultati negativi corrispondono a valori Ct su 40 o campioni con valori di Ct superiori a quella del controllo negativo.

4. Biblioteca preparazione per il sequenziamento di Quasimetagenomic

Nota: I prodotti MDA possono essere ordinati in sequenza da entrambi breve leggere e lungo leggere (nanopore) piattaforme di sequenziamento. Utilizzare l'ultima versione del kit di preparazione libreria del DNA forniti dai produttori delle piattaforme di sequenziamento. Eseguire la preparazione libreria DNA seguendo le istruzioni dei produttori. Utilizzare il protocollo di DNA genomico basso input 2D per la preparazione di libreria per il sequenziamento di lungo-ha letto piattaforma⁵. Per la preparazione di biblioteca per la piattaforma di sequenziamento di breve-lettura, piccole modifiche al protocollo del produttore sono fornite di seguito.

1. Seguire metodi di preparazione di libreria standard con l'aggiunta di soluzioni tampone e reagenti ai prodotti MDA. Trasferimento 40 μL di sequenziamento prepped MDA prodotti per una nuova piastra e aggiungere 20 μL di perle di purificazione di PCR in ciascun pozzetto.
2. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 min senza agitare.
3. Le perline con 80% di etanolo di lavare e asciugare le perline per 12 min.
4. Risospendere secchi perline in 53 μL di tampone di risospensione e incubare per 2 minuti senza agitazione.
5. Diluire e librerie seguendo le istruzioni del fabbricante della piscina.
   Nota: Un 22 riuniti e Biblioteca denaturato è ora pronto ad essere sequenziata.

Risultati

Prima del sequenziamento di quasimetagenomic, la quantità e la purezza dei prodotti IMS-MDA globale possono essere valutate dal fluorospectrometer (tabella 1).

...

Tempo di arricchimento (h)

Valore di CT

Concentrazione (ng/ul)

Purezza (260/280)

Discussione

A causa della spesso-bassa abbondanza e omogenei in presenza di Salmonella negli alimenti e nei campioni ambientali, arricchimento di cultura prima di IMS-MDA è ancora necessario per il rilevamento di Salmonella e subtyping; è quindi un passo fondamentale del protocollo. Per identificare le condizioni ottimali per aumentare l'abbondanza di Salmonella relativa flora sfondo campione, media diversi arricchimento può essere valutata per gli esempi specifici. Secondo MLG e BAM, sia terreno selett...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory blender bag w/filter	VWR	10048-886
Buffered peptone water	Oxoid Micorbiology Products	CM0509
Rappaport Vassiliadis broth	Neogen Acumedia	7730A
Polysorbate 20	Millipore Sigma	P9416	Tween 20
Stomacher blender	Seward	30010108
Centrifuge	Fisher Scientific	75005194
50ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-6
Thermal Cycler	Techne Prime	EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler	Applied Biosystems	4.76357
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit	Illumina	FC-131-1024	Store at -80C
MinIon library prep kit	Oxford Nanopore	SQK-LSK108	Store at -80C
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads	Applied Biosystems	71002	Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix	GE Healthcare	25-6600-30	Store at -80C
HulaMixer	Invitrogen	15920D
DynaMag magnetic rack	Invitrogen	12321D
TaqMan Universal PCR mastermix	Applied Biosystems	4304437	Mix well before use; store at 4C
Microfuge	Fisher Scientific	05-090-100