Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar amostras de DNA de alimentos e ambiental microbiomes para detecção concertada e subtipos de salmonelas através do sequenciamento de quasimetagenomic. O uso combinado de enriquecimento da cultura, separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA) permite a concentração eficaz de salmonelas de DNA genômico de amostras ambientais e alimentos.

Resumo

Sequenciamento de quasi-metagenomics refere-se à análise baseada no sequenciamento de microbiomes modificada de alimentos e amostras ambientais. Neste protocolo, modificação de microbiome é projetada para concentrar o DNA genômico de um contaminante de patógeno de origem alimentar alvo para facilitar a detecção e subtipos do patógeno em um único fluxo de trabalho. Aqui, vamos explicar e demonstrar as etapas de preparação de amostra para análise de Salmonella typhi quasi-metagenômica de representante alimentos e amostras ambientais, incluindo os rebentos de alfafa, pimenta preta moída, carne à terra, peito de frango e amostras ambientais. Amostras são submetidas primeiro para o enriquecimento da cultura de Salmonella para uma duração encurtada e ajustável (4 – 24 h). Células de Salmonella são então seletivamente capturadas da cultura enriquecimento por Fima separação (IMS). Finalmente, vários deslocamento amplificação (MDA) é executada para amplificar o DNA das células IMS-capturado. A saída de DNA do presente protocolo pode ser sequenciada por plataformas de sequenciamento de alto rendimento. Uma análise PCR quantitativa opcional pode ser realizada para substituir o sequenciamento para a deteção de Salmonella ou avaliar a concentração de salmonela DNA antes de sequenciamento.

Introdução

Metagenômica sequenciamento teoricamente permite a deteção concertada e subtipos de agentes patogénicos de origem alimentar. No entanto, amostras de alimentos apresentam desafios para a análise de patógeno por sequenciamento direto de microbiome a comida. Primeiro, agentes patogénicos de origem alimentar estão frequentemente presentes em níveis baixos em amostras de alimentos. A maioria dos métodos de detecção rápida disponível comercialmente ainda exige 8 – 48 h cultivo para enriquecer as células do patógeno a um nível detectável¹. Em segundo lugar, muitos alimentos contêm células microflora abundante e/ou comida DNA, fazendo o DNA de patógeno de origem alimentar uma pequena fração de metagenome de comida e um alvo evasivo para deteção e subtipos directo por sequenciamento de metagenomic.

Modificação de microbiomes de alimentos tem sido relatada para permitir uma concentração substancial de patógeno de origem alimentar DNA para facilitar a detecção baseada em sequenciamento de Shiga toxina-produzindo Escherichia coli^2,3 e Salmonella typhi⁴. Porque os alimentos modificados microbiomes ainda são misturas de diferentes espécies microbianas, seu sequenciamento é denominado como análise de quasi-metagenomic⁴. Microbiome modificação pode ser executada por cultura enriquecimento sozinho^2,3 , ou em combinação com separação Fima (IMS) e vários deslocamento amplificação (MDA)^4,5. IMS seletivamente pode capturar células do patógeno de cultura de enriquecimento através de grânulos magnéticos revestido de anticorpo. MDA pode gerar quantidades suficientes de DNA genômico para sequenciamento através de de DNA polimerase o altamente eficiente ɸ29⁶. IMS-MDA permitiu a deteção do agente patogénico independente de cultura de amostras clínicas⁷e encurtamento do enriquecimento da cultura para a deteção de quasi-metagenomic e subtipos de salmonelas em alimentos amostras⁴.

O objetivo geral deste método é preparar DNA quasi-metagenomic de amostras de alimentos para permitir a concentração alvo de DNA genômico de Salmonella e detecção subsequente e subtipos do contaminante Salmonella por sequenciamento. Em comparação com métodos padrão para a deteção de Salmonella ^8,9 e¹⁰de subtipos, a abordagem quasimetagenomic substancialmente pode encurtar o tempo de retorno de alimentos contaminados e amostras ambientais para subtipos moleculares do patógeno Unificando os dois normalmente separaram análises em um único fluxo de trabalho. Este método é particularmente útil para aplicações como reação a epidemias transmitidas por alimentos e outras investigações de volta de rastreamento onde patógeno robusto subtipos é necessário além de deteção de patógenos e rápida reversão analítica é importante.

Protocolo

1. preparação da amostra

Nota: Amostras de alimentos preparadas para pré-enriquecimento de acordo com o guia de laboratório de microbiologia (MLG) do Estados Unidos Departamento de agricultura da segurança alimentar e Inspection Service (USDA-FSIS)¹¹ e bacteriológica manual analítico (BAM) do alimento de Estados Unidos e Drug Administration (FDA)¹².

1. Assepticamente, coloque uma porção de 25 g de amostra de alimentos como pimenta preta, peito de frango, carne moída e brotos de alfafa ou um cotonete ambiental em um saco de liquidificador de laboratório estéril com um filtro incorporado. Prepare um cotonete ambiental assepticamente umedecendo uma esponja com caldo de enriquecimento (Rappaport-Vassiliadis, RV). Em seguida, arraste o swab sobre toda a superfície ou área pré-determinada e colocá-lo em um saco de liquidificador de laboratório.

Figura 1: representante alimentos e amostras ambientais para detecção de quasi-metagenômica e subtipos de salmonelas. As amostras são colocadas em sacos de filtro estéril stomacher juntamente com caldo de RV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Misturar cuidadosamente cada 25 g amostra com 225 mL de enriquecimento RV caldo usando uma massagem de liquidificador ou mão de laboratório por 30 s.
   Nota: Variantes de caldo de RV, tal como recomendado pelo MLG e BAM podem ser utilizadas dependendo tipos de amostra.
3. Incube a mistura amostra-enriquecimento caldo em uma incubadora de laboratório a 42 ° C para 4 – 24 h.
4. Após a incubação, colete uma subamostra de 50 mL de caldo de enriquecimento do lado filtrado do saco em um tubo de centrífuga de 50ml separado.
5. Centrifugar o tubo a 100 x g durante 10 minutos remover os resíduos sólidos no homogeneizado.
6. Recupere o sobrenadante cuidadosamente para um novo 50ml centrifugar o tubo e centrifugar os tubos em 3.000-6.000 x g durante 10 minutos recuperar centrifugado.
7. (Opcional) Desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento por re-suspensão em 5 mL de água peptona tamponada (BPW) e centrifugar os tubos a 3.000-6.000 × g por 10 min.
   Nota: BPW pode preparado pela dissolução de 10 g de peptona, 5 g de cloreto de sódio, 3,5 g de dissódico fosfato, e 1,5 g de Fosfato monopotássico em 1 L de água destilada. O pH final deve ser ajustado para 7,2 ± 0,2 a 25 ° C. Autoclave a 121 ° c durante 15 min. BPW comercialmente disponível também pode ser usado.
8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de água peptonada tamponada.

2. Fima separação (IMS) e vários deslocamento Amplification (MDA)

Nota: Para evitar a contaminação cruzada entre amostras, trabalhar em uma armário de biossegurança, mudar pontas de pipeta para cada tubo, evite tocar o tubo com a pipeta e não coloque os tubos juntos em suporte magnético durante a etapa de lavagem.

1. Descongele os buffers de amostra e a reação do kit de MDA no gelo ou a 4 ° C com antecedência.
2. Misturar 1 mL de célula re-suspensa em BPW de pelotas com 20 μL de anti -Salmonella grânulos em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque-o sobre o misturador rotativo durante 30 min à temperatura ambiente.
   Nota: Flora competitiva, partículas de gordura e proteínas em ressuspenso podem interferir com a IMS. Diluição de centrifugado re-suspenso em água peptonada tamponada é útil para reduzir a perda dos grânulo -Salmonella complexos do suporte magnético durante as etapas de lavagem.
3. Inserir os tubos magnético stand e permitir que 3 min para a correcta recuperação dos grânulos do rack várias vezes por inversão para concentrar as contas em uma bolinha no lado do tubo.
4. Manter os tubos sobre o suporte magnético. Aspirar e desprezar o sobrenadante de cada tubo, bem como o líquido restante na tampa de cada tubo.
   Nota: Tenha cuidado para não perturbar a pelota de grânulos IMS na parede lateral do tubo contra o ímã.
5. Retire o suporte de tubo do suporte magnético e adicionar 1 mL de tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% (v/v) polissorbato 20) e inverter várias vezes para remover bactérias de ligação não específica do complexo.
6. Repita as etapas de 2.3-2.5 duas vezes.
7. Após a lavagem 3^rd , realizar a separação magnética final de contas, repetindo as etapas 2.3 – 2.4. Retire os tubos do magnética cremalheira e colocá-los em uma microcentrífuga para 1 s para spin para baixo de grânulos. Em seguida, coloque os tubos no suporte magnético para 3 min antes de remover qualquer tampão de lavagem residual.
8. Ressuspender os grânulo - complexos deSalmonella em 9 μL de tampão de amostra e incubar a 95 ° C por 3 min para desnaturação.
9. Após refrigerar a 4 ° C, no gelo, combinar com 9 μL de tampão de reação mais 1 μL de enzima misturar e manter no gelo.
10. Em um termociclador, incube os tubos a 30 ° C, durante 2 h para amplificação, seguida de aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos para inativar a enzima e legal a 4 ° C no gelo.
11. Avalie a quantidade e a qualidade dos produtos MDA medindo-se a concentração de DNA e pureza (260/280 relação > 1.8) em um instrumento de fluorospectrometer.
    Nota: Por causa da ligação não-específica dos grânulos IMS, DNA genômico de organismos que não a Salmonella é susceptível de estar presente nos produtos da MDA, mas não afeta a jusante análise.
12. Armazene os produtos finais (20 μL) a-20 ° C até o uso de PCR em tempo real e/ou elaboração de biblioteca para o sequenciamento de quasimetagenomics.

3. real-time PCR

Nota: Este passo é opcional para a detecção de Salmonella sem subtipos, 1) e 2) avaliar a qualidade da amostra antes da sequenciação de quasimetagenomics.

1. Preparar 18 μL de mistura PCR por amostra, contendo Universal PCR Master Mix (10 μL), em frente a primeira demão (2 μL, 900 nM), reverter a primeira demão (2 μL, 900 nM), sonda (2 μL, 250 nM) e água da classe molecular (2 μL).
   Nota: Salmonella-primeiras demão do oligonucleotide específica (para a frente: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, reverso: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) e sonda foram concebidos para amplificar uma sequência dentro do gene ttr (GenBank adesão n 94. AF 282268)¹³.
2. Misture o produto MDA da etapa 2.12 pipetando delicadamente acima e abaixo do grânulo -Salmonella complexos junto com líquido para criar uma suspensão. Adicione 2 µ l da suspensão em 18 μL de mistura PCR.
3. Executar o PCR em tempo real, usando um protocolo otimizado de PCR em tempo real, especificar dois períodos de exploração, uma a 50 ° C por 2 min e outra a 95 ° C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 60 s.
4. Calcule o ciclo de limiar (Ct), que é o número de ciclos necessários para a fluorescência de DNA amplificado para cruzar a linha de limite.
   Nota: A linha de limite é definida na fase linear entre a linha de base e planalto dos lotes de amplificação das amostras. Resultados negativos correspondem aos valores de Ct por 40 ou amostras com valores de Ct maiores do que a do controlo negativo.

4. Biblioteca preparação para o sequenciamento de Quasimetagenomic

Nota: Os produtos MDA podem ser sequenciados por ambos curto ler e ler muito tempo (nanopore) plataformas de sequenciamento. Use a versão mais recente dos kits de preparação de biblioteca DNA fornecidas pelos fabricantes das plataformas de sequenciamento. Execute a preparação de biblioteca de DNA de acordo com as instruções dos fabricantes. Use o protocolo de DNA genômico baixa-entrada 2D para preparação de biblioteca para o sequenciamento de leitura longa plataforma⁵. Para a preparação de biblioteca para a plataforma de sequenciamento de curto-leitura, pequenas modificações ao protocolo do fabricante são fornecidas abaixo.

1. Segui métodos de preparação de biblioteca padrão, adicionando soluções tampão e reagentes para produtos MDA. Transferir 40 μL dos produtos MDA sequenciamento preparado para um novo prato e adicionar 20 μL de grânulos de purificação de PCR para cada poço.
2. Incube a placa na temperatura de quarto por 10 min sem tremer.
3. Lave os grânulos com 80% de etanol e secar as contas por 12 min.
4. Re-suspender grânulos secos em 53 μL de tampão de ressuspensão e incubar por 2 min sem tremer.
5. Diluir e bibliotecas, seguindo as instruções do fabricante da piscina.
   Nota: Uma 22:00 em pool e desnaturada biblioteca está agora pronta a ser sequenciado.

Resultados

Antes de sequenciamento de quasimetagenomic, a quantidade e a pureza dos produtos IMS-MDA geral podem ser avaliadas por fluorospectrometer (tabela 1).

...

	Tempo de enriquecimento (h)	Valor de CT	Concentração (ng/ul)	Pureza (260/280)

Discussão

Por causa da abundância, muitas vezes de baixa e homogênea em presença de salmonelas em alimentos e amostras ambientais, enriquecimento de cultura antes de IMS-MDA é ainda necessário para a detecção de Salmonella e subtipos; é, portanto, uma etapa crítica do protocolo. Para identificar as condições ideais para aumentar a abundância de Salmonella em relação à flora de fundo de amostra, mídia de enriquecimento diferentes pode ser avaliadas para amostras específicas. De acordo com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory blender bag w/filter	VWR	10048-886
Buffered peptone water	Oxoid Micorbiology Products	CM0509
Rappaport Vassiliadis broth	Neogen Acumedia	7730A
Polysorbate 20	Millipore Sigma	P9416	Tween 20
Stomacher blender	Seward	30010108
Centrifuge	Fisher Scientific	75005194
50ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-6
Thermal Cycler	Techne Prime	EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler	Applied Biosystems	4.76357
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit	Illumina	FC-131-1024	Store at -80C
MinIon library prep kit	Oxford Nanopore	SQK-LSK108	Store at -80C
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads	Applied Biosystems	71002	Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix	GE Healthcare	25-6600-30	Store at -80C
HulaMixer	Invitrogen	15920D
DynaMag magnetic rack	Invitrogen	12321D
TaqMan Universal PCR mastermix	Applied Biosystems	4304437	Mix well before use; store at 4C
Microfuge	Fisher Scientific	05-090-100