食品和环境样品中沙门氏菌的准总体基因体分析

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 准备从食物和环境微生物群 DNA 样本, 以协同检测和子类型沙门氏菌通过 quasimetagenomic 测序。结合使用培养富集、免疫磁分离 (IMS) 和多重置换扩增 (MDA), 可有效地将沙门氏菌基因组 DNA 从食物和环境样本中浓缩。

摘要

准宏基因组测序是指基于测序分析的食品和环境样品的改性微生物群。在本协议中, 微生物菌群的改性是为了集中于目标食源性致病菌污染物的基因组 DNA, 以便在单个工作流程中检测和子类型病原体。在这里, 我们解释并演示了样品制备步骤, 对代表性食品和环境样品中沙门氏菌起因的准宏基因组分析, 包括苜蓿芽、黑胡椒粉、地牛肉、鸡胸肉和环境拭子。样本首先受到沙门氏菌的培养富集的缩短和可调的持续时间 (4–24 h)。然后通过免疫磁分离 (IMS) 选择性地从浓缩培养中捕获沙门氏菌细胞。最后, 进行多位移扩增 (MDA), 以放大来自 IMS 捕获细胞的 DNA。该协议的 DNA 输出可以通过高通量测序平台进行排序。可进行定量 PCR 分析, 以取代沙门氏菌检测的测序, 或在测序前评估沙门氏菌DNA 浓度。

引言

宏基因组测序理论允许对食源性病原体进行协同检测和子类型。然而, 食品微生物群的直接测序对病原体分析提出了挑战。首先, 食源性病原体经常存在于食物样本的低水平。大多数商业上可用的快速检测方法仍然需要 8–48 h 培养, 以丰富病原细胞到可检测的¹级。其次, 许多食物含有丰富的菌群细胞和/或食物 dna, 使食源性病原体 dna 成为食物宏基因组的一小部分, 并且是通过直接总体基因体测序检测和子类型的难以捉摸的目标。

据报道, 食品微生物群的改性允许大量食源性病原体 DNA 的浓度, 以方便测序检测滋贺毒素产生的大肠杆菌^2、3和沙门氏菌起因⁴。由于改性食品微生物群仍然是不同微生物种类的混合物, 它们的测序被称为准总体基因体分析⁴。微生物菌群的改性可通过培养富集单独^2、3或与免疫磁分离 (IMS) 和多位移扩增 (MDA)^4、5相结合进行。IMS 可以通过抗体涂层磁珠选择性地从浓缩培养中捕获病原细胞。MDA 可以通过高效的ɸ29 dna 聚合酶⁶生成足够数量的基因组 DNA 进行测序。IMS-MDA 允许从临床样本⁷的独立于文化的病原体检测, 并缩短食品样本⁴中沙门氏菌的准总体基因体检测和子类型的培养富集。

该方法的总体目标是从食物样本中制备准总体基因体 DNA, 以使沙门氏菌基因组 dna 的靶向浓度和随后的检测和子类型沙门氏菌污染物的测序。与沙门氏菌检测^8、9和子类型¹⁰的标准方法相比, quasimetagenomic 方法可以大大缩短污染食品和环境样品的周转时间, 从而病原体的分子亚型通过将两个典型的分离分析统一为一个工作流。这种方法特别适用于诸如食源性暴发反应和其他追溯调查, 在这种情况下, 除了病原体检测和快速分析周转, 还需要强健的病原体子类型。

研究方案

1. 样品制备

注: 根据美国农业部食品安全和检验服务部 (USDA-FSIS)¹¹的微生物学实验室指南 (MLG) 和美国食品和细菌分析手册 (BAM), 准备食品样品以进行预浓缩。药物管理局 (FDA)¹²。

1. 无菌将 25 g 部分的食物样本, 如黑胡椒, 鸡胸肉, 牛肉, 苜蓿芽或环境拭子放入一个无菌实验室搅拌机袋与内置过滤器。无菌用浓缩汤 (拉帕波特-绿, RV) 滋润海绵, 准备环境拭子。然后, 将棉签拖到整个表面或预先确定的区域, 然后放入实验室搅拌机袋中。

图 1: 对沙门氏菌进行准宏基因组检测和子类型的代表性食品和环境样品。样品放置在无菌过滤器抹胸袋和 RV 汤。请点击这里查看这个数字的更大版本.

2. 三十年代使用实验室搅拌机或手部按摩, 将每25克样品与225毫升 RV 浓缩液彻底混合。
   注意: 根据样品类型的不同, MLG 和 BAM 推荐的 RV 汤的变种可能会被使用。
3. 在42摄氏度的实验室培养箱中孵育样品浓缩汤混合物, 4–24 h。
4. 孵化后, 收集50毫升小子的浓缩液从袋子的过滤侧在一个单独的50毫升离心管。
5. 离心管在 100 x g 10 分钟, 以去除匀浆中的固体碎片。
6. 仔细恢复上清液到一个新的50毫升离心管和离心管在 3,000–6,000 x g 10 分钟, 以恢复细胞颗粒。
7. 可选丢弃上清液, 并在5毫升缓冲的蛋白胨水 (BPW) 中重新悬浮液洗涤颗粒, 并在 3,000–6,000 x g 离心管10分钟。
   注: BPW 可以通过溶解10克的蛋白胨, 5 克氯化钠, 3.5 克磷酸二钠, 1.5 克单钾盐磷酸盐为 1 L 的蒸馏水制备。最终 pH 值应调整为7.2 ± 0.2 (25 摄氏度)。热压罐在 121 oc 15 分钟. 商业上可用的 BPW 也可以使用。
8. 丢弃上清液, 并在5毫升的 BPW 中重新悬浮颗粒。

2. 免疫磁分离 (IMS) 和多位移放大 (MDA)

注意: 为了防止样品间交叉污染, 在生物安全柜中工作, 更换每个管子的移液器提示, 避免用吸管接触管子, 在洗涤步骤中不要将管放在磁性支架上。

1. 在冰上或提前4摄氏度解冻样品缓冲液和反应缓冲液 (MDA 试剂盒)。
2. 在 BPW 中混合1毫升的再悬浮细胞颗粒, 20 微升的1.5 毫升微量离心管中的抗沙门氏菌珠, 在室温下将其放在旋转搅拌机上30分钟。
   注: 重悬颗粒中的竞争性菌群、脂肪微粒和蛋白质会干扰 IMS。在 BPW 中, 再悬浮细胞颗粒的稀释有助于在洗涤步骤中减少磁性支架上的珠子-沙门氏菌复合物的流失。
3. 将管插入磁性支架, 并允许3分钟的正确恢复珠子通过反相机架几次, 以集中的珠子在管侧的颗粒。
4. 把管子放在磁性支架上。从每个管子中吸出和丢弃上清液, 以及每个管帽中的剩余液体。
   注意: 小心不要在管子的侧壁上对磁体干扰 IMS 珠子的颗粒。
5. 从磁性支架上取下管座, 然后添加1毫升洗涤缓冲液 (PBS 包含 0.05% (a/v) 聚山梨酯 20), 并多次反转, 以去除复杂的非特异性结合细菌。
6. 重复步骤2.3–2.5 两次。
7. 在 3^路洗涤后, 通过重复步骤2.3–2.4 执行磁珠的最终磁性分离。从磁性机架上取下管子, 将它们放在微量离心中, 1 秒即可旋转珠子。然后, 将管子放在磁性机架上3分钟, 然后取出任何残余洗涤缓冲液。
8. 将9微升样品缓冲液中的珠沙门氏菌配合物重新挂起, 在95摄氏度孵育3分钟进行变性。
9. 冷却至4摄氏度后, 结合9微升的反应缓冲液加1微升的酶混合物并保持在冰上。
10. 在热循环仪中, 孵育管在30摄氏度为 2 h 为放大, 然后加热在65摄氏度10分钟, 以禁用酶和冷却到4摄氏度冰上。
11. 通过测量 fluorospectrometer 仪器上的 DNA 浓度和纯度 (260/280 比例 > 1.8) 来评估 MDA 产品的数量和质量。
    注意: 由于 IMS 磁珠的非特异性结合, 从沙门氏菌以外的生物体的基因组 DNA 很可能存在于 MDA 产品中, 但不影响下游分析。
12. 将最终产品 (20 微升) 存储在-20 摄氏度, 直到用于 quasimetagenomics 测序的实时 PCR 和/或库准备。

3. 实时 PCR

注意: 此步骤是可选的 1) 检测沙门氏菌无子类型, 2) 在 quasimetagenomics 测序前评估样品质量。

1. 每样制备18微升 pcr 混合物, 包含通用 pcr 主混合物 (10 微升)、正向底漆 (2 微升、900 nm)、反向底漆 (2 微升、900 nm)、探针 (2 微升、250 nm) 和分子级水 (2 微升)。
   注意:沙门氏菌特异寡核苷酸引物 (向前: CTCACCAGGAGATTACAACATGG, 反转: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC) 和探针被设计为放大ttr基因中的 94-bp 序列 (GenBank 加入 no。AF 282268)¹³。
2. 将 MDA 产品从步骤2.12 中混合, 轻轻移除微珠-沙门氏菌复合物和液体, 形成悬浮液。将悬浮液中的2微升加入18微升 PCR 混合物中。
3. 使用优化的实时 pcr 协议运行实时 pcr, 指定两个保持期, 一个在50摄氏度2分钟, 另一个在95摄氏度10分钟, 后跟40个周期95摄氏度, 十五年代和60摄氏度六十年代。
4. 计算阈值周期 (Ct), 这是所需的周期数的荧光从放大的 DNA 跨越阈值线。
   注: 阈值线设置在样本的放大图的基线和高原之间的线性相位中。阴性结果对应于40以上的 ct 值或 ct 值高于阴性对照的样品。

4. Quasimetagenomic 测序的库准备

注: MDA 产品可以通过短读和长读 (纳米孔) 测序平台进行排序。使用序列化平台制造商提供的最新版本的 DNA 库准备工具包。根据制造商的指示执行 DNA 库准备工作。使用2D 低输入基因组 DNA 协议为长读测序平台⁵的库准备工作。对于短读测序平台的库准备, 下面提供了对制造商协议的细微修改。

1. 通过向 MDA 产品添加缓冲液和试剂, 遵循标准库制备方法。将40微升的测序准备好 MDA 产品到一个新的板上, 并在每个井中添加20微克的 PCR 纯化珠。
2. 在室温下孵育10分钟, 不摇晃。
3. 用80% 乙醇清洗珠子, 将珠子干12分钟。
4. 在53微升的再悬浮缓冲液中重新悬浮干珠子, 孵育2分钟而不摇晃。
5. 根据制造商的指示稀释和池库。
   注意: 下午10点汇集和变性库现在已准备好进行排序。

结果

在 quasimetagenomic 测序之前, 可通过 fluorospectrometer (表 1) 评估 IMS MDA 产品的总数量和纯度。

	浓缩时间 (h)	Ct 值	浓度 (ng/ul)	纯度 (260/280)
品牌 A	4	...

讨论

由于食品和环境样品中沙门氏菌的丰度和均质性存在, 在沙门氏菌检测和子类型的同时, 还需要对其进行培养;因此, 这是该议定书的一个关键步骤。为了确定最佳条件以增加沙门氏菌相对于样本背景菌群的丰度, 可以对不同的富集介质进行特定样品的评估。根据 MLG 和 BAM 的规定, 如 RV 汤和非选择性培养基, 如缓冲的蛋白胨水和乳糖汤, 可用于食品样本中的沙门氏菌浓缩。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laboratory blender bag w/filter	VWR	10048-886
Buffered peptone water	Oxoid Micorbiology Products	CM0509
Rappaport Vassiliadis broth	Neogen Acumedia	7730A
Polysorbate 20	Millipore Sigma	P9416	Tween 20
Stomacher blender	Seward	30010108
Centrifuge	Fisher Scientific	75005194
50ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-6
Thermal Cycler	Techne Prime	EW-93945-13
StepOne Real-Time Thermal cycler	Applied Biosystems	4.76357
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	PCR purification beads; mix well before use; store at 4C
Nextera XT library prep kit	Illumina	FC-131-1024	Store at -80C
MinIon library prep kit	Oxford Nanopore	SQK-LSK108	Store at -80C
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Dynabead Anti-Salmonella beads	Applied Biosystems	71002	Vortex well prior to use
Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix	GE Healthcare	25-6600-30	Store at -80C
HulaMixer	Invitrogen	15920D
DynaMag magnetic rack	Invitrogen	12321D
TaqMan Universal PCR mastermix	Applied Biosystems	4304437	Mix well before use; store at 4C
Microfuge	Fisher Scientific	05-090-100