JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول تحليل المقصورات داخل الخلايا التي تحمل علامة الفلورسنت في الخميرة الناشئة باستخدام مجهرية متعددة الألوان 4D (الفاصل الزمني 3D). يتم اختيار معلمات التصوير لالتقاط إشارات كافية مع الحد من الأضرار الضوئية. تسمح الإضافات المخصصة لـ ImageJ بتتبع الهياكل المسماة وتحليلها كمياً.

Abstract

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كيفية تشكيل مقصورات الغشاء وتحويلها في الخلايا الحية من الخميرة الناشئة. العديد من المقصورات داخل الخلايا في الخميرة ديناميكية، وفهم كامل لخصائصها يتطلب التصوير بفاصل زمني. مجهري الفلورية البؤرية ثنائية الجوانب متعددة الألوان هي طريقة قوية لتتبع سلوك وتكوين المقصورة داخل الخلايا على مقياس زمني من 5-15 دقيقة. المقاطع. ولتحقيق هذا الهدف، يتم تقليل ابيضاض الصور والسمية الضوئية عن طريق المسح الضوئي بسرعة بقوة ليزر منخفضة جداً، ويتم تعيين أبعاد البكسل والفواصل الزمنية لخطوات Z إلى أكبر القيم المتوافقة مع أخذ عينات من الصورة بدقة كاملة. مجموعات البيانات 4D الناتجة صاخبة ولكن يمكن تمهيدها عن طريق deconvolution. حتى مع بيانات عالية الجودة، فإن مرحلة التحليل صعبة لأن الهياكل داخل الخلايا غالباً ما تكون عديدة وغير متجانسة ومتحركة. لتلبية هذه الحاجة، تمت كتابة الإضافات ImageJ المخصصة إلى مجموعة البيانات 4D على شاشة الكمبيوتر، وتحديد الهياكل ذات الأهمية، تحرير البيانات لعزل الهياكل الفردية، وقياس الدورات الزمنية الفلورة، وجعل الأفلام من مكدسات Z المتوقعة. الأفلام 4D مفيدة بشكل خاص للتمييز بين مقصورات مستقرة من مقصورات عابرة التي تتحول عن طريق النضج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأفلام لوصف أحداث مثل الانصهار مقصورة، واختبار آثار طفرات محددة أو اضطرابات أخرى.

Introduction

مقصورات نظام الغشاء الداخلي في تدفق مستمر، وتوصيفها الكامل يتطلب التصوير بالخلايا الحية. يوصف هنا هو البروتوكول الذي يستخدم 4D (الفاصل الزمني 3D) مجهرية البؤرة لتصور المقصورات وصفت الفلورسنت في الخمائر الناشئة. وقد وضعت هذه الطريقة لتتبع ديناميات المقصورات السرية في Pichia pastoris وSaccharomyces cerevisiae1،2،3. يركز هذا البروتوكول على S. cerevisiaه، الذي يحتوي على غولجي غير مكدسة التي cisternae الفردية هي قابلة للحل بصريا4. منظمة غولجي غير عادية في S. cerevisiae تمكين مظاهرة عن طريق الفحص المجهري 4D أن تفيجبالا غولجي تسميات في البداية مع البروتينات غولجي المقيمة في وقت مبكر، ومن ثم يفقد تلك البروتينات في حين الحصول على البروتينات غولجي المقيمة في وقت متأخر3 ،5. ويمكن تصور هذا الانتقال عن طريق خلق سلالة التي يتم تسمية البروتين غولجي في وقت مبكر Vrg4 مع GFP في حين يتم تسمية البروتين غولجي في وقت متأخر Sec7 مع بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي. عندما يتم تعقب التصهريج الفردية، ويلاحظ النضج كتحويل الأخضر إلى الأحمر3. هذا النوع من التحليل يمكن أن توفر معلومات قيمة حول توطين البروتين وهوية المقصورة. على سبيل المثال، قد يظهر بروتينان مع إزاحة طفيفة لأوقات الوصول والمغادرة في بعض الأحيان لتسمية مقصورات مختلفة في صور ثابتة، ولكن يمكن رؤيتها في أفلام 4D لتسمية نفس المقصورة في نقاط زمنية مختلفة6،7 . وهكذا، يكشف الفحص المجهري 4D الظواهر التي لن تكون واضحة خلاف ذلك.

يمكن تحقيق مجهرية 4D مفيدة من مقصوراتالخميرة مع الإجراءات المناسبة والمعدات 2. كلما كان ذلك ممكنا، يتم وضع العلامات البروتين الفلورسنت عن طريق استبدال الجينات8 لتجنب القطع الأثرية الإفراط في التعبير. نظرًا لأن الهياكل داخل الخلايا غالبًا ما تكون ديناميكية جدًا، فهناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد لضمان تتبع البنية بشكل موثوق مع مرور الوقت. البروتوكول الموصوف هنا يستخدم مجهر ضوئي ضوئي مسح بالليزر مجهز بكاشفات حساسية عالية. مع هذا الجهاز، يمكن تصوير حجم الخلية بالكامل من S. cerevisiae عن طريق الفحص المجهري البؤري تقريبا كل 1-3 ق، مع فترات 2 ق يجري نموذجية. يمكن جمع البيانات لمدة تصل إلى 5-15 دقيقة اعتمادا على كثافات وضع العلامات من الفلوروفوريس وخصائصها البيوفيزيائية الضوئية. العقبة الرئيسية هي تقليل تبييض الصور. ولهذا الغرض، يتم الاحتفاظ بكثافة الليزر في أدنى مستوى ممكن، وتُزيد سرعة المسح الضوئي البؤري إلى أقصى حد، وتُمكَّن المعلمات البصرية للصورة عند حد Nyquist من أجل التقاط المعلومات ذات الصلة مع تجنب التعرض المفرط للضوء. ومن المتوقع أيضا أن تخفف هذه الإعدادات من السمية الضوئية، وهو عامل غالبا ما يتم تجاهله أثناء تصوير الخلايا الحية9و10و11. تتم معالجة البيانات الصاخبة الناتجة عن ذلك مع تصحيح التبييض وخوارزميات التناقص لتسهيل القياس الكمي لكثافة الفلورة.

حتى مع أفلام 4D عالية الجودة، والتحليل صعب لأن مقصورات الخميرة تميل إلى أن تكون عديدة، غير متجانسة، والمحمول. نظرًا للقيود الجوهرية للتنظير المجهري البؤري والإعدادات غير المثلى المطلوبة للتصوير ثلاثي الأبعاد لفترات طويلة، يصعب حل هياكل الفلورسنت القريبة من بعضها البعض. ويمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال التركيز على عدد قليل من الهياكل الفلورية التي لا تزال قابلة للحل بصريا لمدة فترة وضع العلامات، مع افتراض أن تلك الهياكل تمثل جميع السكان من المسمى المقصورات. يتم تحديد مقصورات الفلورسنت التي يمكن تعقبها بشكل موثوق عن طريق عرض الأفلام من مكدسات Z المتوقعة وعن طريق إنشاء سلسلة من المونتاج الذي يتم تجميع المقاطع البصرية لكل نقطة زمنية على شاشة الكمبيوتر. يستخدم هذا التحليل الإضافات المخصصة ImageJ12، والتي تسمح بتتبع بنية فردية في عزلة.

أوراق الأساليب الأخيرة غطت استخدام البروتينات الفلورية في الخميرة13 وكذلك نظرية وممارسة التصوير البؤري 4D من خلايا الخميرة2. يركز هذا البروتوكول على الجوانب العملية الرئيسية لتجربة التصوير رباعية الأبعاد. وهو يتضمن بعض التحسينات على الإجراءات الموصوفة سابقا، فضلا عن الإصدارات المحدثة من رمز البرنامج المساعد ImageJ والوثائق. المثال المعروض يركز على ديناميات غولجي، ولكن هذا البروتوكول هو على قدم المساواة مناسبة لتصوير مقصورات الخميرة الأخرى.

Protocol

1- الإعداد

  1. جعل غير الفلورسنتالحد الأدنى NSD المتوسطة 2. ومن المتوقع أن يؤدي غياب الريبوفلافين إلى الحد من الفلورة الخضراء داخل الخلايا الخلفية والسمية الضوئية المرتبطة بها.
  2. تنمو سلالة الخميرة بين عشية وضحاها في ~ 23 درجة مئوية إلى مرحلة لوغاريتمية في 5 مل NSD في قارورة 50 مل حيرة مع تأين جيد. حوالي 3-4 ح قبل التحليل، تمييع ثقافة الخميرة في NSD الطازجة بحيث ODالنهائي 600 سيكون 0.5-0.8 في وقت التصوير.
  3. إعداد محلول 2 ملغ / مل من كونكافالين A (كونا). إذا رغبت في ذلك، تجميد aliquots من هذا الحل في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. تدور الحل كونا لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق لإزالة الجسيمات التي قد تتداخل مع التصوير. ثم إضافة 250 درجة مئوية من supernatant إلى نظيفة 35 مم coverglass أسفل طبق الفحص المجهري. بعد 15 دقيقة، يغسل 2-3 مرات مع 2 مل من dH2O والسماح للجفاف.
  5. إضافة 250 درجة مئوية من ثقافة الخميرة إلى طبق المغلفة كونا، والانتظار 10 دقيقة للسماح للخلايا التمسك، وغسل بلطف 2-3 مرات مع 2 مل NSD. تغطية الخلايا مع 2 مل NSD الطازجة.

2. التصوير

  1. استخدم عدسة غمر الزيت 63x أو 100x. ويكفي وجود فتحة رقمية (NA) تبلغ 1.40، ولكن يمكن أيضاً استخدام عدسة NA أعلى.
  2. تنسيق حجم الإطار إلى 256 × 128 (العرض × الارتفاع). إذا كانت هناك حاجة إلى حجم إطار أكبر، فإن زيادة العرض لن يقلل من سرعة المسح الضوئي طالما تم تجهيز المجهر البؤري مع الماسح الضوئي الرنانة.
  3. ضبط عامل التكبير لجعل حجم بكسل ~ 80 نانومتر.
  4. استخدم أقصى سرعة مسح، والتي عادة ما تكون في حدود 8 كيلوهرتز. قم بتشغيل المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه إذا كان متوفرًا، وإذا أكدت تجارب التحكم أن عمليات المسح الضوئي من الاتجاهين مسجلة.
  5. تعيين تراكم الخط إلى 4 أو 6. تأكد من استخدام التراكم (الجمع) بدلاً من المتوسط.
  6. تعيين الثقب إلى 1.2 وحدات متجدد الهواء. من الناحية التجريبية، عند تصوير خلايا الخميرة الحية، يلتقط هذا الإعداد المزيد من الفوتونات من الاختيار القياسي لوحدة متجددة الهواء 1.0 بينما لا يسبب أي فقدان ملموس للدقة.
  7. لكل قناة الفلورة، تعيين الطول الموجي الإثارة، تعيين كاشف حساسية عالية، وتعيين نطاق الطول الموجي الانبعاثات، وبدوره على وضع العد الفوتون إذا كان متوفرا. سوف تعتمد خيارات الطول الموجي على الفلوروفور. على سبيل المثال, إثارة الفلورة GFP في 485 نانومتر وجمع من 495-550 نانومتر, وتثير الفلورة mScarlet في 555 نانومتر وجمع من 562-625 نانومتر.
  8. تعيين كثافة كل ليزر لتكون منخفضة قدر الإمكان. يجب تحديد هذا الإعداد تجريبياً. وكثافة مناسبة تؤدي إلى التقاط تسلسل صورة صاخبة ولكن قابلة للتفسير، مع إشارة الفلورة تبييض لا يزيد عن 50٪ بحلول نهاية فيلم 5 دقائق. على المجهر البؤري المستخدمة هنا (انظر جدولالمواد)، وهذه الكثافة يتوافق مع إعداد قوة الليزر على ترتيب 5٪.
  9. استخدم فلاتر الشق أو زمع الوقت لتجنب التقاط الضوء المنعكس من غطاء الغلاف. في حالة توفر الوقت، قم بتعيين إطار gating إلى 0.6-10.0 ns.
  10. قم بتشغيل التصوير الساطع واستخدم كاشف حساسية منخفض لجمع البيانات. تعيين الكسب إلى مستوى يجعل الخلايا مرئية بوضوح. لا تستخدم تباين التداخل التفاضلي (DIC) لأن المنشور سيتداخل مع التقاط بيانات الفلورة الموثوق بها.
  11. تعيين الفاصل الزمني الخطوة Z إلى 0.25-0.35 ميكرومتر. حدد اتجاه التصوير بحيث يتحرك "لأسفل" نحو غطاء الغلاف.
  12. لفيلم نموذجي، تعيين الفاصل الزمني بين Z-مكدسات إلى 2 ق وتعيين مدة الفيلم إلى 5 إلى 10 دقيقة. ديناميات بطيئة نسبيا.
  13. حفظ الفيلم كملف LIF مع الصور brightfield في القناة الأخيرة. أعماق بت أعلى غير ضرورية في هذه المرحلة، ويتم تكوين خط أنابيب المعالجة لقبول بيانات TIFF 8 بت.

3. Deconvolution

  1. قم بتشغيل برنامج deconvolution (راجع جدولالمواد)، باستخدام خوارزمية تقدير الاحتمال الأقصى الكلاسيكية.
  2. افتح مجموعة البيانات التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.13. حدد "معالج Deconvolution". فحص القيم المعروضة في "معالج المعلمة". يجب الكشف عن معلمات التصوير وعرضها بشكل صحيح. تحت "فهارس الانكسار"، تغيير قيمة "تضمين ميد." إلى 1.40 لتقريب السيتوبلازم الخميرة. ضمن "غطاء"، حدد "محرر الإطلاق" و "تقدير الموضع" و"موافق" لتعيين موضع غطاء. حدد "تعيين الكل الذي تم التحقق منه" و "قبول".
  3. المضي قدما من خلال "معالج Deconvolution" لكل قناة الفلورة. حدد "يدوي" كوضع لتقدير الخلفية. فحص ملف تعريف كثافة الفلورة البيانات الخام لتحديد قيمة الخلفية المقدرة، والتي عادة حوالي 0.1.
  4. في قائمة إعداد deconvolution، أدخل قيمة "الحد الأقصى للتكرارات" 40 ثم قم بإيقاف تشغيل تصحيح التبييض. أدخل قيمة SNR المقدرة، والتي عادةً حوالي 5.0. انقر فوق "Deconvolve".
  5. إذا لزم الأمر، العودة إلى ملف البيانات الأصلي، وضبط الخلفية وقيم SNR، وتكرار deconvolution، حتى يتم إزالة الضوضاء بما فيه الكفاية دون القضاء على الفلورة الأصلية من الهياكل الخافتة.
  6. دمج قنوات الفلورة المشرقة وdeconvolved. لخطوات تحرير الأفلام اللاحقة في ImageJ، قم بترتيب القنوات التي تكون حمراء أولاً، وخضراء (إذا كانت موجودة) هي التالية، والأزرق (إذا كان موجوداً) هو التالي، وbrightfield هو الأخير. حفظ تسلسل الصورة كملف TIFF 8 بت.

4. تصحيح التبييض وتوليد الأفلام

  1. استيراد تسلسل الصورة deconvolved في ImageJ وتحويلها إلى hyperstack عن طريق اختيار صورة > Hyperstacks > كومة إلى Hyperstack. حدد "xyzct" من القائمة المنسدلة، وقم بتعبئة عدد القنوات وشرائح مكدس Z والأطر الزمنية (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. اختر صورة > اللون > تقسيم القنوات.
  3. تصحيح قنوات الفلورة لتبييض الصور باستخدام البرنامج المساعد ImageJ المتاحة من http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. مرة واحدة وقد تم تحميل البرنامج المساعد وتثبيته، واختيار الإضافات > EMBLtools > تصحيح التبييض. حدد "الاحتواء الأسي".
  4. لدمج قنوات الفلورة المصححة بـ brightfield والتبييض في كومة فرط، اختر Image > اللون > دمج القنوات. حفظ hyperstack الناتجة كملف TIFF 8 بت.
  5. تثبيت الإضافات ImageJ المخصصة المتوفرة مع هذا البروتوكول. اتبع الإرشادات الموجودة في المستند المرفق لعرض تسلسل الصورة وتحريره وتحديده كمياً، ولإنتاج فيلم نهائي لمكدسات Z المتوقعة.

النتائج

المثال الوارد هنا وثائق وكميا نضج اثنين من الخميرة غولجي cisternae كما تصورها مزدوج ة اللون 4D مجهري ة البؤرة3. خلية الخميرة يحتوي على ترتيب 10-15 غولجي cisternae، كل منها ينضج على مدى فترة زمنية من حوالي 2-4 دقيقة. البروتين مثل mCherry أو mScarlet. تسميات الصهريج الفردية في البداي...

Discussion

4D التصوير البؤري من العضيات الخميرة يتطلب ضبط دقيق من المعلمات متعددة. والشاغل الرئيسي هو ابيضاض الصور والسمية الضوئية. فيلم 4D نموذجي ينطوي على جمع الآلاف من المقاطع البصرية، لذلك يجب أن تبقى الإضاءة الليزر منخفضة قدر الإمكان. جنبا إلى جنب يمكن استخدام علامات البروتين الفلورسنت لتعزيز ال...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 GM104010. شكرا للمساعدة في التنظير المجهري الفلوري لفيتاس بيندوكاس وكريستين لابنو في المرفق الأساسي للميكروسكوب المتكامل، الذي تدعمه منحة دعم مركز السرطان التي تمولها المعاهد القومية للصحة P30 CA014599.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5MatTekP35G-0.170-14-CImaging dishes
Concanavalin A powderSigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Leica SP8 confocal microscopeLeica Microsystems
Leica Application Suite X Leica MicrosystemsMicroscope software
Huygens Essential software, version 17.04Scientific Volume ImagingDeconvolution software
ImageJNIHImage processing and analysis software

References

  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1464DdeconvolutionImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved