Microscopía 4D de levadura

Resumen

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Resumen

El objetivo de este protocolo es caracterizar cómo se forman y transforman los compartimentos de membrana en células vivas de levadura en ciernes. Muchos compartimentos intracelulares en la levadura son dinámicos, y una comprensión completa de sus propiedades requiere imágenes de lapso de tiempo. La microscopía de fluorescencia confocal 4D multicolor es un método potente para rastrear el comportamiento y la composición de un compartimiento intracelular en una escala de tiempo de 5-15 min. El análisis riguroso de la dinámica del compartimiento requiere la captura de miles de Secciones. Para lograr este objetivo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se minimizan escaneando rápidamente a muy baja potencia láser, y las dimensiones en píxeles y los intervalos de paso en Z se establecen en los valores más grandes que son compatibles con el muestreo de la imagen a resolución completa. Los conjuntos de datos 4D resultantes son ruidosos, pero se pueden suavizar mediante la desconvolución. Incluso con datos de alta calidad, la fase de análisis es difícil porque las estructuras intracelulares son a menudo numerosas, heterogéneas y móviles. Para satisfacer esta necesidad, los plugins personalizados de ImageJ se escribieron en datos 4D de matriz en una pantalla de computadora, identificar estructuras de interés, editar los datos para aislar estructuras individuales, cuantificar los cursos de tiempo de fluorescencia y hacer películas de las pilas Z proyectadas. Las películas 4D son particularmente útiles para distinguir compartimentos estables de compartimentos transitorios que se vuelcan por maduración. Estas películas también se pueden utilizar para caracterizar eventos como la fusión de compartimentos, y para probar los efectos de mutaciones específicas u otras perturbaciones.

Introducción

Los compartimentos del sistema de endomembrana están en flujo constante, y su caracterización completa requiere imágenes celulares vivas. Aquí se describe un protocolo que emplea la microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) para visualizar compartimentos etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes. El método fue desarrollado para rastrear la dinámica de los compartimentos secretores en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Este protocolo se centra en S. cerevisiae, que tiene un Golgi no apilado en el que las cisternae individuales son ópticamente resolubles⁴. La inusual organización Golgi en S. cerevisiae permitió la demostración por microscopía 4D que una Golgi cisterna etiqueta inicialmente con proteínas Golgi tempranas residentes, y luego pierde esas proteínas mientras adquiere proteínas Golgi tardías residentes^{3 ,5}. Esta transición se puede visualizar mediante la creación de una cepa en la que la proteína Golgi vrg4 temprano está etiquetada con GFP, mientras que la proteína Golgi tardía Sec7 está etiquetada con una proteína fluorescente roja monomérica. Cuando se realiza un seguimiento de cisternae individuales, se observa la maduración como una conversión de verde a rojo³. Este tipo de análisis puede proporcionar información valiosa sobre la localización de proteínas y la identidad del compartimiento. Por ejemplo, dos proteínas con tiempos de llegada y salida ligeramente compensados a veces pueden parecer etiquetar diferentes compartimentos en imágenes estáticas, pero se pueden ver en películas 4D para etiquetar el mismo compartimento en diferentes puntos de tiempo^6,7 . Por lo tanto, la microscopía 4D revela fenómenos que de otra manera no serían evidentes.

La microscopía 4D informativa de los compartimentos delevadura se puede lograr con los procedimientos y equipos adecuados 2. Siempre que sea posible, el etiquetado de proteínas fluorescentes se realiza mediante reemplazo genético⁸ para evitar artefactos de sobreexpresión. Debido a que las estructuras intracelulares son a menudo muy dinámicas, se necesitan imágenes 4D para garantizar que una estructura se rastree de forma fiable a lo largo del tiempo. El protocolo descrito aquí emplea un microscopio confocal de escaneo láser equipado con detectores de alta sensibilidad. Con este dispositivo, todo el volumen celular de S. cerevisiae se puede escanear mediante microscopía confocal aproximadamente cada 1-3 s, con intervalos de 2 s siendo típicos. Los datos se pueden recopilar durante un máximo de 5-15 minutos dependiendo de las densidades de etiquetado de los fluoróforos y sus propiedades fotofísicas. El principal obstáculo es minimizar el fotoblanqueo. Para ello, las intensidades láser se mantienen lo más bajas posible, se maximiza la velocidad de escaneo confocal y los parámetros ópticos se configuran para crear imágenes en el límite de Nyquist con el fin de capturar la información relevante evitando una exposición excesiva a la luz. Estos ajustes también se espera que alivien la fototoxicidad,un factor que a menudo se pasa por alto durante las imágenes de células vivas 9,^10,11. Los datos de ruidoso resultantes se procesan con algoritmos de corrección de lejía y desconvolución para facilitar la cuantificación de las intensidades de fluorescencia.

Incluso con películas 4D de alta calidad, el análisis es complicado porque los compartimentos de levadura tienden a ser numerosos, heterogéneos y móviles. Debido a las limitaciones intrínsecas de la microscopía confocal y los ajustes no óptimos necesarios para la toma de imágenes 4D prolongada, las estructuras fluorescentes que están cerca unas de otras son difíciles de resolver. Este problema puede eludirse centrándose en el pequeño número de estructuras fluorescentes que permanecen fijamente resueltas ópticamente durante el período de etiquetado, suponiendo que esas estructuras son representativas de toda la población de Compartimientos. Los compartimentos fluorescentes que se pueden rastrear de forma fiable se identifican mediante la visualización de películas de pilas Z proyectadas y mediante la creación de una serie de montajes en los que las secciones ópticas para cada punto de tiempo se agrupan en una pantalla de ordenador. Este análisis emplea plugins personalizados de ImageJ^12, que permiten realizar un seguimiento de una estructura individual de forma aislada.

Los documentos de métodos recientes cubrieron el uso de proteínas fluorescentes en la levadura^13, así como la teoría y práctica de la imagen confocal 4D de células de levadura². Este protocolo se centra en los aspectos prácticos clave de un experimento de imágenes 4D. Incluye algunas mejoras a los procedimientos descritos anteriormente, así como versiones actualizadas del código y documentación del plugin ImageJ. El ejemplo mostrado se centra en la dinámica de Golgi, pero este protocolo es igualmente adecuado para la toma de imágenes de otros compartimentos de levadura.

Protocolo

1. Preparación

1. Hacer no fluorescentes mínimos NSD medio². Se espera que la ausencia de riboflavina reduzca la fluorescencia verde intracelular de fondo y la fototoxicidad asociada.
2. Cultivar la cepa de levadura durante la noche a 23 oC en fase logarítmica en 5 ml de NSD en un matraz desfofado de 50 ml con buena aireación. Aproximadamente 3-4 h antes del análisis, diluir el cultivo de levadura en NSD fresco para que la OD final₆₀₀ será 0.5-0.8 en el momento de la toma de imágenes.
3. Preparar una solución de 2 mg/ml de concanavalina A (ConA). Si lo desea, congele las alícuotas de esta solución en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 oC.
4. Gire la solución de ConA durante 5 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden interferir con las imágenes. A continuación, agregue 250 s de la supernatonción a un plato limpio de microscopía inferior de vidrio de 35 mm. Después de 15 min, lavar 2-3 veces con 2 mL de dH₂O y dejar secar.
5. Agregue 250 s de la levadura al plato recubierto con ConA, espere 10 minutos para permitir que las células se adhieran y lave suavemente 2-3 veces con 2 ml de NSD. Cubra las células con 2 ml de NSD fresco.

2. Imágenes

1. Utilice una lente de inmersión en aceite de 63x o 100x. Una apertura numérica (NA) de 1.40 es suficiente, pero también se puede utilizar una lente NA más alta.
2. Formatee el tamaño del fotograma a 256 x 128 (ancho x alto). Si se necesita un tamaño de bastidor más grande, aumentar la anchura no reducirá la velocidad de escaneo siempre y cuando el microscopio confocal esté equipado con un escáner resonante.
3. Ajuste el factor de zoom para que el tamaño de píxel sea de 80 nm.
4. Utilice la velocidad máxima de escaneo, que normalmente está en el orden de 8 kHz. Active el escaneo X bidireccional si está disponible y, si los experimentos de control confirman que los análisis de las dos direcciones están registrados.
5. Establezca la acumulación de línea en 4 o 6. Asegúrese de usar la acumulación (sumando) en lugar de promediar.
6. Establezca el agujero en 1,2 unidades ventiladas. Empíricamente, cuando se toma imágenes de células de levadura vivas, este ajuste captura más fotones que la opción estándar de 1.0 Unidad airy mientras no causa ninguna pérdida apreciable de resolución.
7. Para cada canal de fluorescencia, establezca la longitud de onda de excitación, asigne un detector de alta sensibilidad, establezca el rango de longitud de onda de emisión y active el modo de recuento de fotones si está disponible. Las opciones de longitud de onda dependerán de los fluoróforos. Por ejemplo, excitar la fluorescencia GFP a 485 nm y recoger de 495-550 nm, y excitar la fluorescencia mScarlet a 555 nm y recoger de 562-625 nm.
8. Ajuste la intensidad de cada láser para que sea lo más baja posible. Esta configuración debe determinarse empíricamente. Una intensidad adecuada dará lugar a la captura de una secuencia de imagen ruidoso pero interpretable, con la señal de fluorescencia blanqueando no más del 50% al final de una película de 5 minutos. En el microscopio confocal utilizado aquí (ver Tabla de Materiales), esta intensidad corresponde a un ajuste de potencia láser en el orden del 5%.
9. Utilice filtros de muesca o tiempo para evitar capturar la luz reflejada del cubreobjetos. Si el tiempo está disponible, establezca la ventana de gating en 0.6-10.0 ns.
10. Active las imágenes de campo brillante y utilice un detector de baja sensibilidad para la recopilación de datos. Establezca la ganancia en un nivel que haga que las celdas sean claramente visibles. No utilice contraste de interferencia diferencial (DIC) porque el prisma interferirá con la captura de datos de fluorescencia fiables.
11. Establezca el intervalo del paso Z en 0,25-0,35 m. Imagen de todo el volumen de las células de levadura mediante la recopilación de unas 20-25 secciones ópticas por pila Z. Especifique la direccionalidad de las imágenes de forma que "abajo" se mueva hacia la cubierta.
12. Para una película típica, establezca el intervalo de tiempo entre las pilas Z en 2 s y establezca la duración de la película en 5 a 10 min. Dependiendo del compartimiento en estudio, reduzca el intervalo para hacer películas más cortas de dinámica relativamente rápida, o aumente el intervalo para hacer películas más largas de dinámica relativamente lenta.
13. Guarde la película como un archivo LIF con las imágenes de campo brillante en el último canal. Las profundidades de bits más altas son innecesarias en esta etapa y la canalización de procesamiento está configurada para aceptar datos TIFF de 8 bits.

3. Desconvolución

1. Inicie el software de desconvolución (consulte Tabla de materiales), utilizando el algoritmo de estimación de máxima probabilidad clásica.
2. Abra el conjunto de datos generado en el paso 2.13. Seleccione "Asistente de desconvolución". Inspeccione los valores mostrados en el "Asistente de parámetros". Los parámetros de imagen deben detectarse y mostrarse correctamente. En "Índices de refracción", cambie el valor "Embedding med." a 1.40 para aproximar el citoplasma de levadura. En "coverslip", seleccione "Launch editor" y "Estimate position" y "OK" para establecer la posición de coverslip. Seleccione "Establecer todo verificado" y "Aceptar".
3. Proceda a través del "Asistente de desconvolución" para cada canal de fluorescencia. Seleccione "Manual" como el modo para la estimación de fondo. Inspeccione el perfil de intensidad de fluorescencia de datos sin procesar para determinar un valor de fondo estimado, que suele ser de aproximadamente 0,1.
4. En el menú de configuración de desconvolución, introduzca un valor "Iteraciones máximas" de 40 y desactive la corrección de lejía. Ingrese un valor estimado Del SNR, que es típicamente alrededor de 5.0. Haga clic en "Deconvolve".
5. Si es necesario, vuelva al archivo de datos original, ajuste los valores de fondo y SNR y repita la desconvolución, hasta que el ruido se elimine lo suficiente sin eliminar la fluorescencia genuina de las estructuras tenues.
6. Combinar el campo brillante y los canales de fluorescencia desconvolved. Para los siguientes pasos de edición de películas en ImageJ, organice los canales de modo que el rojo sea el primero, el verde (si está presente) es el siguiente, el azul (si está presente) es el siguiente y el campo brillante es el último. Guarde la secuencia de imágenes como un archivo TIFF de 8 bits.

4. Corrección de lejía y generación de películas

1. Importe la secuencia de imágenes desconvolved en ImageJ y conviértala en un hiperstack eligiendo Imagen > Hiperpilas > Apilar en Hyperstack. Seleccione "xyzct" en el menú desplegable y rellene el número de canales, sectores de pila Z y marcos de tiempo (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
2. Elija Imagen > Color > Dividir canales.
3. Corrija los canales de fluorescencia para el fotoblanqueo utilizando el plugin ImageJ disponible en http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Una vez que ese plugin se ha descargado e instalado, elija Plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Seleccione "Ajuste exponencial."
4. Para fusionar los canales de fluorescencia de campo brillante y corregidos por lejía en un hiperstack, elija Imagen > Color > Fusionar canales. Guarde el hiperstack resultante como un archivo TIFF de 8 bits.
5. Instale los plugins Personalizados de ImageJ proporcionados con este protocolo. Siga las instrucciones del documento adjunto para ver, editar y cuantificar la secuencia de imágenes y producir una película final de las pilas Z proyectadas.

Resultados

El ejemplo dado aquí documenta y cuantifica la maduración de dos levaduras Golgi cisternae visualizadas por la microscopía confocal 4D de doble color³. Una célula de levadura contiene en el orden de 10-15 Golgi cisternae, cada uno de los cuales madura en un curso de tiempo de aproximadamente 2-4 min. La maduración se puede visualizar etiquetando el marcador Golgi temprano Vrg4 con GFP y etiquetando el marcador Golgi tardío Sec7 con un fluorescente rojo fluore...

Discusión

La toma de imágenes confocales 4D de los orgánulos de levadura requiere una afinación cuidadosa de múltiples parámetros. La principal preocupación es el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una película 4D típica implica la recopilación de miles de secciones ópticas, por lo que la iluminación láser debe mantenerse lo más baja posible. Las etiquetas de proteínas fluorescentes tándem se pueden utilizar para aumentar la señal sin aumentar la expresión de la proteína etiquetada^16,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software