4D מיקרוסקופ של שמרים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את כיצד תאים ממברנות טופס ולשנות בתאים חיים של שמרים לגבש. תאים תאיים רבים שמרים הם דינמיים, והבנה מלאה של המאפיינים שלהם דורש הדמיה בזמן. Multi-צבעים 4D מיקרוסקופ מיקרוסקופית פלואורסצנטית היא שיטה רבת עוצמה למעקב אחר ההתנהגות והרכב של תא תאיים על סולם זמן של 5-15 דקות. ניתוח קפדני של דינמיקה תא דורש לכידת אלפי אופטי סעיפים. כדי להשיג מטרה זו, photobleaching לבנת ו פוטורעילות הם ממוזער על ידי סריקת במהירות בכוח לייזר נמוך מאוד, ואת מידות פיקסל ומרווחי Z-step מוגדרים לערכים הגדולים ביותר התואמים לדגימת התמונה ברזולוציה מלאה. ערכות הנתונים המתקבלות מוסדרות, רועשות, אך ניתן לחלק אותן על-ידי פירוק. גם עם נתונים באיכות גבוהה, שלב הניתוח הוא מאתגר כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות רבים, הטרוגנית, וניידים. כדי לענות על צורך זה, התוספים ImageJ מותאם אישית נכתבו לתוך מערך 4D נתונים על מסך המחשב, לזהות מבנים של עניין, לערוך את הנתונים כדי לבודד מבנים בודדים, לכמת את קורסי הזמן הזריחה, ולעשות סרטים של ה-Z מוקרן הערימות. 4D סרטים שימושיים במיוחד כדי להבחין תאים יציבים מתאים ארעי כי להפוך על ידי התבגרות. סרטים כאלה יכולים לשמש גם כדי לאפיין אירועים כגון היתוך תא, כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות ספציפיות או רטבאליות אחרים.

Introduction

התאים של המערכת הendomembrane הם בשטף קבוע, ואת האפיון המלא שלהם דורש הדמיה תא חי. מתוארים כאן הוא פרוטוקול המעסיק 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופיה כדי להמחיש באופן מתויג בתאי בתים של הניצנים. השיטה פותחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של מתאי הפרשה בפיצ'יה פסטורלה וסכומיסס סרביסיאה^1,2,3. פרוטוקול זה מתמקד ב -S. cerevisiae, אשר יש golgi שאינו מוערם שבו cisternae הפרט הם לפתירה⁴. הארגון החריג Golgi ב -S. cerevisiae ס איפשר את ההפגנה על ידי מיקרוסקופ 4d כי golgi cisterna בתחילה תוויות עם תושב מוקדם בשנת golgi, ולאחר מכן מאבד את החלבונים האלה תוך רכישת תושב מאוחר golgi חלבונים^{3 ,5}. מעבר זה יכול להיות דמיינו על ידי יצירת זן שבו חלבון Golgi מוקדם Vrg4 מתויג עם GFP בעוד חלבון Golgi מאוחר Sec7 מתויג עם חלבון פלורסנט monomeric אדום. כאשר cisternae בודדים מסומנים, התבגרות נצפתה כהמרה ירוק-אדום³. סוג זה של ניתוח יכול לספק מידע חשוב אודות לוקליזציה של חלבון וזהות תא. לדוגמה, שני חלבונים עם זמני הגעה ויציאה מעט נגדיים עשויים לעתים להיראות כתוויות לתאים שונים בתמונות סטטיות, אך ניתן לראות בסרטים 4d כדי לתייג את אותו תא בנקודות זמן שונות^6,7 . לפיכך, מיקרוסקופ 4D חושף תופעות שלא היו נראות באופן אחר.

מיקרוסקופ 4D אינפורמטיבי של תאי שמרים ניתן להשיג עם הליכים המתאימים וציוד². במידת האפשר, התיוג חלבון פלורסנט מבוצע על ידי החלפת גנים⁸ כדי למנוע חפצים ביטוי יתר. כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות דינמי מאוד, 4D הדמיה נדרשת כדי להבטיח כי מבנה מסומנים מהימן לאורך זמן. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לייזר המצויד בגלאי רגישות גבוהה. עם התקן זה, את כל הנפח של התא של S. cerevisiae ס יכול להיות בתמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית בערך כל 1-3 s, עם 2 מרווחי s להיות אופייני. נתונים ניתן לאסוף עד 5-15 דקות בהתאם לצפיפות התיוג של fluorophores ואת המאפיינים שלהם פוטופיסיים. המשוכה העיקרית היא למזער את הלבנת התמונות. למטרה זו, עוצמות הלייזר נשמרות נמוכות ככל האפשר, מהירות הסריקה הקונפוקלית מוגדלת, והפרמטרים האופטיים מוגדרים לתמונה במגבלת נייקוויסט כדי ללכוד את המידע הרלוונטי תוך הימנעות מחשיפה מוגזמת באור. הגדרות אלה צפויים גם להקל על הרעילות, גורם התעלמו לעתים קרובות במהלך הדמיה תא חי^9,10,11. הנתונים הרועשים הנובעים מכך מעובדים עם תיקון אקונומיקה והאלגוריתמים לפירוק כדי להקל על הכמת של עוצמות הזריחה.

גם עם איכות גבוהה בסרטים 4D, הניתוח הוא מסובך כי בתאי שמרים נוטים להיות רבים, הטרוגנית, וניידים. בשל המגבלות הפנימיות של המיקרוסקופיה וההגדרות הלא-אופטימליות הנדרשות עבור הדמיה ממושכת של 4D, מבני פלורסנט הסמוכים זה לזה קשה לפתרון. בעיה זו ניתן להקיף על-ידי התמקדות במספר קטן של מבני פלורסנט כי נשארים מחדש באופן מבחינה אופטית למשך תקופת תיוג, עם ההנחה כי מבנים אלה מייצגים את האוכלוסיה כולה של התווית תאים. תאים פלורסנט שיכולים להיות מסומנים באופן מהימן מזוהים על ידי צפייה בסרטים של ה-Z-ערימות מוקרן ועל ידי יצירת סדרה של ונטאז שבו הסעיפים האופטיים עבור כל נקודת זמן מסודר על מסך המחשב. ניתוח זה משתמש בתוספים מותאמים אישית של ImageJ¹² , המאפשרים מבנה פרטני להיות מאותר בבידוד.

ניירות השיטות האחרונות כיסו את השימוש של חלבונים פלורסנט ב^-13 שמרים, כמו גם את התיאוריה והתרגול של הדמיה מיקוד 4d של תאים שמרים². פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים המרכזיים של ניסוי הדמיה 4-d. הוא כולל כמה שיפורים להליכים שתוארו בעבר, כמו גם גירסאות מעודכנות של הקוד והתיעוד של התוסף ImageJ. הדוגמה המוצגת מתמקדת בדינמיקה של Golgi, אך פרוטוקול זה מתאים באותה מידה ליצירת הדמיה של תאי שמרים אחרים.

Protocol

1. הכנה

1. הפוך מינימלי לא פלורסנט NSD בינונית². היעדר הריבופלאווין צפוי להפחית את הרקע הירוק מתאים לקרינה פלואורסצנטית ירוקה ו-phototoxicity משויכת.
2. לגדל את מאמץ שמרים לילה ב ~ 23 ° צ' לשלב לוגריתמי ב 5 mL NSD ב 50 mL מבולבל בקבוקון עם האנטנה טוב. כ 3-4 h לפני הניתוח, לדלל את התרבות שמרים ב NSD טריים כך הסופי OD₆₀₀ יהיה 0.5-0.8 בזמן הדמיה.
3. להכין פתרון 2 מ"ג/mL של concanavalin A (קונה). אם תרצה, הקפא את התמיסה הזאת בחנקן נוזלי ובחנות ב-80 ° c.
4. לסובב את הפתרון הקונה עבור 5 דקות במהירות מלאה במיקרוצנטריפוגה כדי להסיר חומר חלקיקי שעלול להפריע הדמיה. לאחר מכן להוסיף 250 μL של supernatant כדי נקי 35 מ"מ שמיכות התחתון צלחת המיקרוסקופיה. לאחר 15 דקות, לשטוף 2-3 פעמים עם 2 מ ל של dH₂O ולתת יבש.
5. הוסף 250 μL של התרבות שמרים לצלחת מצופה קונה, לחכות 10 דקות כדי לאפשר את התאים לדבוק, ולשטוף בעדינות 2-3 פעמים עם 2 mL NSD. כסה את התאים עם 2 מ"ל NSD טרי.

2. הדמיה

1. השתמש עדשה 63 x או 100x טבילה שמן. פתח מספרי (NA) של 1.40 הוא מספיק, אבל עדשת NA גבוהה יכול לשמש גם.
2. עצב את גודל המסגרת ל-256 x 128 (רוחב x גובה). אם יש צורך בגודל מסגרת גדול יותר, הגדלת הרוחב לא תפחית את מהירות הסריקה כל עוד המיקרוסקופ הקונקטיבי מצויד בסורק תהודה.
3. כוונן את מקדם הזום כדי להפוך את גודל הפיקסל ~ 80 ננומטר.
4. השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר של 8 kHz. הפעל סריקת X דו-כיוונית אם הוא זמין, ואם בקרת ניסויים לוודא כי סריקות משני הכיוונים הם בהרשמה.
5. הגדר את הצטברות הקו ל-4 או 6. הקפד להשתמש בהצטברות (סיכום) במקום בממוצע.
6. הגדר את החור מנקב 1.2 יחידות אווריריים. אמפירי, כאשר הדמיה לחיות תאים שמרים, הגדרה זו לוכדת פוטונים יותר מאשר הבחירה הסטנדרטית של 1.0 יחידת אוורירי תוך גרימת אובדן ניכר של רזולוציה.
7. עבור כל ערוץ זריחה, להגדיר את אורך הגל, להקצות גלאי רגישות גבוהה, להגדיר את טווח אורך הגל הפליטה, ולהפעיל מצב ספירת פוטון אם זמין. בחירות אורך הגל יהיה תלוי fluorophores. כדוגמה, לרגש את הזריחה GFP ב 485 nm ולאסוף מ 495-550 nm, ולהלהיב mScarlet פלואורסצנטית ב 555 nm ולאסוף מ-562-625 nm.
8. הגדר את עוצמת כל לייזר כדי להיות נמוך ככל האפשר. הגדרה זו חייבת להיקבע בהתאם. האינטנסיביות המתאימה תגרום ללכידת רצף התמונה רועש אך מתרגם, עם האות הפלואורסצנטית הלבנת לא יותר מ 50% עד סוף הסרט 5 דקות. במיקרוסקופ הקונמוקד המשמש כאן (ראה טבלת חומרים), עוצמה זו מקבילה להגדרת כוח לייזר על סדר של 5%.
9. השתמש במסננים מדרגה או בזמן המשך כדי להימנע מלכידת האור המשתקף מהכיסויים. אם המשך הזמן זמין, להגדיר את החלון החוצה כדי 0.6-10.0 ns.
10. הפעל דימות ברייטפילד והשתמש בגלאי רגישות נמוך לאיסוף נתונים. הגדר את הרווח לרמה שהופכת את התאים לגלויים בבהירות. אל תשתמש בניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) מכיוון שהפריזמה תפריע ללכידת נתוני הזריחה האמינים.
11. הגדר את מרווח ה-Z ל-0.25-0.35 μm. תמונה של כל הנפח של התאים שמרים על ידי איסוף על 20-25 מקטעים אופטיים לכל Z-מחסנית. ציין את הכיווניות של הדמיה כגון "למטה" נע לעבר הכיסויים.
12. עבור סרט אופייני, הגדר את מרווח הזמן בין Z-ערימות ל-2 s והגדר את משך הסרט ל-5 עד 10 דקות. בהתאם לתא שמתחת למחקר, הפחת את מרווח החיים כדי לבצע סרטים קצרים יותר של דינמיקה מהירה יחסית, או הגדל את המרווח כדי להפוך סרטים ארוכים יותר של דינמיקה איטית יחסית.
13. שמור את הסרט כקובץ, עם תמונות השדה הברייטמיות בערוץ האחרון. במעמקי הסיביות הגבוהה יותר אינם נחוצים בשלב זה, והצינור העיבוד מוגדר לקבל נתוני TIFF של 8 סיביות.

3. פירוק המבנים

1. הפעל את תוכנת הפירוק (ראה טבלת חומרים), באמצעות האלגוריתם ' שערוך סבירות מקסימלית קלאסי '.
2. פתח את ערכת הנתונים שנוצרה בשלב 2.13. בחר באפשרות "אשף פירוק הטור". בדוק את הערכים המוצגים באשף הפרמטרים. יש לזהות את פרמטרי ההדמיה ולהציגם כראוי. תחת "מדדי השבירה", לשנות את הערך "הטבעה רפואית." כדי 1.40 לקירוב הציטופלסמה שמרים. תחת "coverslip", בחר "הפעל עורך" ו "מיקום הערכה" ו "אישור" כדי להגדיר את מיקום coverslip. בחר "קבע את כל האימות" ו-"קבל".
3. המשך באמצעות "אשף פירוק" עבור כל ערוץ זריחה. בחר "ידני" כמצב עבור שערוך רקע. בדוק את פרופיל עוצמת הקרינה הגולמית של הנתונים כדי לקבוע ערך רקע מוערך, שהוא בדרך כלל כ-0.1.
4. בתפריט ההגדרה של פירוק, הזן ערך ' מספר איטראציות מרבי ' של 40 וכבה את תיקון האקונומיקה. הזן ערך SNR מוערך, שהוא בדרך כלל כ-5.0. לחץ על "דבולבה".
5. במקרה הצורך, חיזרו לקובץ הנתונים המקורי, התאימו את ערכי הרקע והSNR, וחזרו על הפרק, עד שהרעש יוסר במידה מספקת מבלי לסלק קרינה מקורית ממבנים עמומים.
6. למזג את השדה ברייטזה ולפרק ערוצי זריחה. עבור שלבי עריכת הסרטים הבאים ב-ImageJ, סדר את הערוצים כך שאדום הוא הראשון, ירוק (אם קיים) הוא הבא בתור, כחול (אם קיים) הוא הבא בתור, וברייטפילד הוא האחרון. שמור את רצף התמונות כקובץ TIFF של 8 סיביות.

4. תיקון אקונומיקה ודור הסרט

1. יבא את רצף התמונות החוצה לתוך ImageJ והמירו אותה להיפר-מחסנית על-ידי בחירה באפשרות תמונה > היפרערימות > מחסנית ל-Hyperstack. בחר באפשרות "xyzct" מהתפריט הנפתח ומלא את מספר הערוצים, פרוסות מחסנית Z ומסגרות הזמן (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
2. בחרו ' תמונה > צבע ' > ערוצים מפוצלים.
3. תקן את ערוצי הזריחה עבור הלבנה באמצעות התוסף ImageJ הזמין מ http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. לאחר התוסף הזה הורד והתקין, בחר תוספים > EMBLtools > תיקון אקונומיקה. בחר באפשרות "התאמה מעריכית".
4. כדי למזג את ערוצי הקרינה הפלואורסצנטית ותיקון האקונומיקה לתוך hyperstack, בחרו ' תמונה > צבע ' > מיזוג ערוצים. שמור את ההיפר-מחסנית המתקבלת כקובץ TIFF של 8 סיביות.
5. התקן את התוספים המותאמים אישית של ImageJ המסופקים עם פרוטוקול זה. בצע את ההוראות המופיעות במסמך הנלווה כדי להציג, לערוך ולכמת את רצף התמונות, ולהפיק את הסרט הסופי של ה-Z-ערימות המוקרנת.

תוצאות

הדוגמה שניתנה כאן מסמכים וככמת את ההבשלה של שתי Golgi cisternae שמרים כפי שדמיינו על ידי המיקרוסקופיה 4D מיקרוסקופית הצבע הכפולה³. תא שמרים מכיל על הסדר של 10-15 Golgi cisternae, שכל אחד מהם מתבגר במשך זמן של כ 2-4 דקות. התבגרות יכול להיות מדמיין על ידי תיוג מוקדם מסמן Golgi Vrg4 עם GFP ...

Discussion

4d הדמיה קונפוקלית וקד של אורגלים שמרים דורש כוונון זהיר של פרמטרים מרובים. הדאגה העיקרית היא פוטוהלהלבנת ו פוטורעילות. סרט 4D אופייני כרוך באיסוף אלפי מקטעים אופטיים, כך שתאורת הלייזר חייבת להישמר כנמוכה ככל האפשר. התגים של חלבון פלואורסצנטי טנדם ניתן להשתמש כדי להגביר את האות מבלי להגדיל ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software