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요약

이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.

초록

이 프로토콜의 목표는 막 구획이 신진 효모의 살아있는 세포에서 어떻게 형성되고 변형되는지 특성화하는 것입니다. 효모에 있는 많은 세포내 구획은 역동적이고, 그들의 속성의 완전한 이해는 시간 경과 화상 진찰을 요구합니다. 다색 4D 공초점 형광 현미경 검사법은 5-15 분의 시간 척도로 세포 내 구획의 동작과 구성을 추적하는 강력한 방법입니다. 섹션. 이를 위해 매우 낮은 레이저 전력으로 빠르게 스캔하여 광표백 및 광독성을 최소화하고 픽셀 크기와 Z-스텝 간격을 최대 해상도로 이미지 샘플링과 호환되는 가장 큰 값으로 설정합니다. 결과 4D 데이터 세트는 시끄러우지만 데컨볼루션으로 평활할 수 있습니다. 높은 품질의 데이터를 가지고 있더라도 세포내 구조는 종종 수,이질성 및 이동이 기때문에 분석 단계는 도전적입니다. 이러한 요구를 충족하기 위해 사용자 지정 ImageJ 플러그인은 컴퓨터 화면의 4D 데이터를 배열하고, 관심 있는 구조를 식별하고, 개별 구조를 격리하기 위해 데이터를 편집하고, 형광 시간 과정을 정량화하고, 투영된 Z 스택의 동영상을 만들기 위해 작성되었습니다. 4D 동영상은 안정적인 구획과 성숙에 의해 뒤집어발생하는 일시적인 구획을 구별하는 데 특히 유용합니다. 이러한 영화는 또한 구획 융합과 같은 이벤트를 특성화하고 특정 돌연변이 또는 다른 섭동의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

endomembrane 시스템의 구획은 일정한 유속에 있고, 그들의 전체 특성은 살아있는 세포 화상 진찰을 요구합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 4D(time-lapse 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광으로 표지된 구획을 시각화하는 프로토콜입니다. 이 방법은 피키아 목회와 사카로마이세스 세레비시아1,2,3의분비구의 역학을 추적하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜은 개별 시스터네이가 광학적으로 해결할 수있는 비 스택 골지가있는 S. cerevisiae에 초점을 맞춥니다4. S. cerevisiae에 있는 특이한 Golgi 조직은 4D 현미경 검사법에 의하여 Golgi cisterna가 처음에 상주 초기 골지 단백질로 레이블을 붙였다는 것을 가능하게 하고, 그 때 상주 늦은 Golgi 단백질을 취득하는 동안 그 단백질을 분실합니다3 ,5. 이러한 전이가 초기 골지 단백질 Vrg4가 GFP로 표지되는 균주를 생성하고 후기 골지 단백질 Sec7은 단모료 적색 형광 단백질로 표지되는 균주를 생성함으로써 시각화될 수 있다. 개별 시스테르네이가 추적되면 성숙도가 녹색에서 빨간색으로 변환3으로 관찰됩니다. 이러한 유형의 분석은 단백질 국소화 및 구획 정체성에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 도착 및 출발 시간을 약간 상쇄하는 두 개의 단백질이 정적 이미지의 다른 구획에 레이블을 지정하는것처럼 보일 수 있지만 4D 영화에서 동일한 구획에 동일한 구획에 레이블을 지정하는 것을 볼 수 있습니다 6,7 . 따라서, 4D 현미경 검사법은 그렇지 않으면 분명하지 않을 현상을 제시합니다.

효모 구획의 유익한 4D 현미경 검사법은 적절한 절차와장비 2로 달성 될 수 있습니다. 가능하면 형광 단백질 태깅은 과발현 아티팩트를 피하기 위해 유전자 교체 8에 의해 수행됩니다. 세포 내 구조는 종종 매우 동적이기 때문에 시간이 지남에 따라 구조를 안정적으로 추적하기 위해 4D 이미징이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 고감도 검출기가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용합니다. 이 장치를 사용하면 S. cerevisiae의 전체 세포 부피는 거의 1-3 초마다 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지화 될 수 있으며 2 s 간격이 일반적입니다. 형광단의 라벨링 밀도와 광물리성질에 따라 최대 5-15분 동안 데이터를 수집할 수 있습니다. 주요 장애물은 사진 표백을 최소화하는 것입니다. 이를 위해, 레이저 강도는 가능한 한 낮게 유지되고, 공초점 스캔 속도가 최대화되고, 광학 파라미터는 과도한 광 노출을 피하면서 관련 정보를 캡처하기 위해 나이퀴스트 한계에서 이미지화하도록 구성된다. 이러한 설정은 또한 광독성을 완화시킬 것으로 예상되며, 이는라이브 셀 이미징 9,10,11동안 종종 간과되는 요인이다. 그 결과 시끄러운 데이터는 표백제 보정 및 데콘볼루션 알고리즘으로 처리되어 형광 강도의 정량화를 용이하게 합니다.

고품질 4D 영화를 사용할 때도 효모 구획이 많고 이기종적이며 이동이 많기 때문에 분석이 까다롭습니다. 공초점 현미경 검사법의 본질적인 한계와 장기간 4D 이미징에 필요한 비최적의 설정으로 인해 서로 가까이 있는 형광 구조는 해결하기 가 어렵습니다. 이 문제는 라벨링 기간 동안 광학적으로 해결할 수 있는 소수의 형광 구조물에 초점을 맞추어 이러한 구조가 표지된 전체 집단을 대표한다는 가정하에 우회할 수 있습니다. 구획. 안정적으로 추적할 수 있는 형광구는 투영된 Z 스택의 동영상을 보고 각 시점의 광학 섹션이 컴퓨터 화면에 배열되는 일련의 몽타주를 생성하여 식별됩니다. 이 분석은 개별 구조를 격리하여 추적 할 수 있도록 사용자 정의 ImageJ12 플러그인을 사용합니다.

최근 방법 논문은 효모 세포의 4D 공초점 화상 진찰의 이론 그리고 사례 뿐만 아니라 효모13에 있는 형광성 단백질의 사용을 다루었습니다2. 이 프로토콜은 4D 이미징 실험의 주요 실용적인 측면에 중점을 둡니다. 여기에는 앞에서 설명한 절차에 대한 몇 가지 향상된 기능과 ImageJ 플러그인 코드 및 설명서의 업데이트된 버전이 포함되어 있습니다. 표시된 예는 Golgi 역학에 초점을 맞추고 있지만이 프로토콜은 다른 효모 구획을 이미징하는 데 똑같이 적합합니다.

프로토콜

1. 준비

  1. 비형광 최소한의 NSD 매체2를 확인합니다. 리보플라빈의 부재는 배경 세포 내 녹색 형광 및 관련 광 독성을 감소시킬 것으로 예상된다.
  2. 효모 균주를 ~23°C에서 하룻밤 동안 성장시키고 5 0mL NSD에서 로그내믹 상으로 50 mL의 배플플라스크에서 좋은 폭기를 갖는다. 분석 하기 전에 약 3-4 시간, 최종 OD600 이미징 시에 0.5-0.8 될 것 이다 있도록 신선한 NSD에서 효 모 배양 희석.
  3. concanavalin A (ConA)의 2 mg / mL 용액을 준비하십시오. 원하는 경우, 액체 질소에이 용액의 aliquots를 동결 하 고 -80 °C에서 저장 합니다.
  4. 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 5분 동안 ConA 용액을 회전하여 이미징을 방해할 수 있는 미립자 물질을 제거합니다. 그런 다음 깨끗한 35mm 커버 글래스 바닥 현미경 접시에 상급제 250 μL을 추가하십시오. 15 분 후, dH2O의 2 mL로 2-3 회 씻고 건조시키십시오.
  5. ConA 코팅 접시에 효모 배양 250 μL을 추가하고 세포가 부착 될 때까지 10 분 간 기다린 다음 2 mL NSD로 2-3 회 부드럽게 씻으십시오. 2 mL 신선한 NSD로 세포를 덮습니다.

2. 이미징

  1. 63x 또는 100x 오일 침지 렌즈를 사용하십시오. 1.40의 숫자 조리개(NA)로충분하지만 더 높은 NA 렌즈도 사용할 수 있습니다.
  2. 프레임 크기를 256 x 128(너비 x 높이)으로 지정합니다. 더 큰 프레임 크기가 필요한 경우 공초점 현미경에 공진 스캐너가 장착되어 있는 한 폭을 늘리면 스캔 속도가 줄어들지 않습니다.
  3. 줌 계수를 조정하여 픽셀 크기를 ~80nm로 만듭니다.
  4. 일반적으로 8kHz의 순서에 있는 최대 스캔 속도를 사용합니다. 사용 가능한 경우 양방향 X 스캐닝을 켜고 제어 실험을 통해 두 방향의 스캔이 레지스터에 있는지 확인합니다.
  5. 선 누적을 4 또는 6으로 설정합니다. 평균 대신 누적(합산)을 사용해야 합니다.
  6. 핀홀을 1.2 Airy 단위로 설정합니다. 경험적으로, 살아있는 효모 세포를 이미징할 때, 이 설정은 1.0 Airy 단위의 표준 선택보다 더 많은 광자를 포착하는 동시에 해상도의 상당한 손실을 일으키지 않습니다.
  7. 각 형광 채널에 대해 여기 파장을 설정하고, 고감도 검출기를 할당하고, 방출 파장 범위를 설정하고, 가능한 경우 광자 계수 모드를 켭니다. 파장 선택은 형광단에 따라 달라집니다. 일례로, 485 nm에서 GFP 형광을 자극하고 495-550 nm에서 수집하고, 555 nm에서 mScarlet 형광을 자극하고 562-625 nm에서 수집한다.
  8. 각 레이저의 강도를 가능한 한 낮게 설정합니다. 이 설정은 경험적으로 결정해야 합니다. 적절한 강도는 5분 동영상이 끝날 때까지 형광 신호 표백으로 시잡하지만 해석 가능한 이미지 시퀀스를 캡처합니다. 여기에 사용된 공초점 현미경(재료 표참조)에서 이 강도는 5%의 순서로 레이저 전력 설정에 해당합니다.
  9. 커버슬립에서 반사된 빛을 포착하지 않으려면 노치 필터 나 시간 게이팅을 사용합니다. 시간 게이팅을 사용할 수 있는 경우 게이팅 창을 0.6-10.0ns로 설정합니다.
  10. 브라이트필드 이미징을 켜고 데이터 수집을 위해 저감도 검출기를 사용합니다. 게인을 셀을 명확하게 볼 수 있는 수준으로 설정합니다. 프리즘이 신뢰할 수 있는 형광 데이터의 캡처를 방해하기 때문에 차동 간섭 대비(DIC)를 사용하지 마십시오.
  11. Z-스텝 간격을 0.25-0.35 μm로 설정합니다. Z 스택당 약 20-25개의 광학 섹션을 수집하여 효모 세포의 전체 부피를 이미지화합니다. "아래로" 커버슬립쪽으로 이동되도록 이미징의 방향성을 지정합니다.
  12. 일반적인 영화의 경우 Z-스택 사이의 시간 간격을 2초로 설정하고 동영상 지속 시간을 5~10분으로 설정합니다. 상대적으로 느린 역학.
  13. 마지막 채널의 밝은 필드 이미지가 있는 LIF 파일로 동영상 저장합니다. 이 단계에서는 비트 깊이가 높을수록 필요하지 않으며 처리 파이프라인은 8비트 TIFF 데이터를 허용하도록 구성됩니다.

3. 데폰볼루션

  1. 클래식 최대 우도 추정 알고리즘을 사용하여 데톤볼루션 소프트웨어(재료 표참조)를 시작합니다.
  2. 2.13단계에서 생성된 데이터 집합을 엽니다. "데폰볼루션 마법사"를 선택합니다. "매개 변수 마법사"에 표시되는 값을 검사합니다. 이미징 매개 변수를 감지하고 올바르게 표시해야 합니다. "굴절률"에서 "포함 메드." 값을 1.40으로 변경하여 효모 세포질에 근사화합니다. "커버슬립"에서 "시작 편집기" 및 "예상 위치" 및 "OK"를 선택하여 커버슬립 위치를 설정합니다. "모두 확인됨 설정"과 "수락"을 선택합니다.
  3. 각 형광 채널에 대한 "Deconvolution 마법사"를 진행합니다. 배경 추정을 위한 모드로 "수동"을 선택합니다. 원시 데이터 형광 강도 프로파일을 검사하여 일반적으로 약 0.1인 예상 배경 값을 결정합니다.
  4. 데톤볼루션 설정 메뉴에서 "최대 반복" 값을 40으로 입력하고 표백제 보정을 끕니다. 일반적으로 약 5.0인 예상 SNR 값을 입력합니다. "데콘볼브"를 클릭합니다.
  5. 필요한 경우 원본 데이터 파일로 돌아가 배경 및 SNR 값을 조정하고 어두운 구조에서 진정한 형광을 제거하지 않고 노이즈가 충분히 제거될 때까지 디콘볼루션을 반복합니다.
  6. 브라이트필드와 다각형 형광 채널을 병합합니다. ImageJ의 후속 동영상 편집 단계의 경우 빨간색이 먼저, 녹색(있는 경우)이 다음이고 파란색(있는 경우)이 다음이고 밝은 필드가 마지막이되도록 채널을 정렬합니다. 이미지 시퀀스를 8비트 TIFF 파일로 저장합니다.

4. 표백제 보정 및 영화 생성

  1. 데시온v조 이미지 시퀀스를 ImageJ로 가져오고 이미지 > 하이퍼스택 > 스택을 하이퍼스택으로 선택하여 하이퍼스택으로 변환합니다. 드롭다운 메뉴에서 "xyzct"를 선택하고 채널 수, Z 스택 조각 및 시간 프레임(http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector)을 입력합니다.
  2. 이미지 > 색상 > 분할 채널을 선택합니다.
  3. http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector 사용할 수 있는 ImageJ 플러그인을 사용하여 광표백을 위해 형광 채널을 수정합니다. 해당 플러그인이 다운로드되고 설치되면 플러그인 > EMBLtools > 표백 보정을 선택합니다. "지수 맞춤"을 선택합니다.
  4. 밝은 필드와 표백보정형광 채널을 하이퍼스택에 병합하려면 이미지 > 컬러 > 채널 병합을 선택합니다. 결과 하이퍼스택을 8비트 TIFF 파일로 저장합니다.
  5. 이 프로토콜과 함께 제공되는 사용자 지정 ImageJ 플러그인을 설치합니다. 함께 제공되는 문서의 지침에 따라 이미지 시퀀스를 보고 편집하고 정량화하고 투영된 Z 스택의 최종 영상을 생성합니다.

결과

여기서 제시된 예는 이중 색상 4D 공초점 현미경 3에 의해 가시화된 바와 같이 두 효모골지 시스터네이의 성숙도를 정량화한다. 효모 세포는 10-15 골지 시스터네의 순서에 포함, 각각의 약의 시간 과정을 통해 성숙 2-4 분. 성숙은 GFP와 초기 골지 마커 Vrg4를 태그하고 빨간색 형광으로 후반 골지 마커 Sec7을 태그하여 시각화 할 수 있습니다 mCherry 또는 mScarlet?...

토론

효모 세포기관의 4D 공초점 이미징은 여러 매개 변수를 주의 깊게 조정해야 합니다. 주요 관심사는 광표백 및 광독성입니다. 일반적인 4D 영화는 수천 개의 광학 섹션을 수집하는 것을 포함하므로 레이저 조명을 가능한 한 낮게 유지해야 합니다. 탠덤 형광 단백질 태그는 태그된단백질(16,17)의발현을 증가시키지 않고 신호를 증진하는데 사용될 수 있다. ?...

공개

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 NIH 교부금 R01 GM104010에 의해 지원되었다. NIH 가 지원하는 암 센터 지원 교부금 P30 CA014599에 의해 지원되는 통합 현미경 코어 시설에서 비타스 빈도카스와 크리스틴 Labno에 형광 현미경 검사법에 대한 지원을 주셔서 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5MatTekP35G-0.170-14-CImaging dishes
Concanavalin A powderSigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Leica SP8 confocal microscopeLeica Microsystems
Leica Application Suite X Leica MicrosystemsMicroscope software
Huygens Essential software, version 17.04Scientific Volume ImagingDeconvolution software
ImageJNIHImage processing and analysis software

참고문헌

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