4D microscopia de levedura

Resumo

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

Resumo

O objetivo deste protocolo é caracterizar como os compartimentos da membrana se formam e se transformam em células ao vivo de levedura brotamento. Muitos compartimentos intracelular no fermento são dinâmicos, e uma compreensão cheia de suas propriedades exige a imagem latente do tempo-lapso. A microscopia de fluorescência confocal 4D multi-color é um método poderoso para controlar o comportamento e a composição de um compartimento intracelular em uma escala de tempo de 5-15 minutos. a análise rigorosa da dinâmica do compartimento requer a captura de milhares de Seções. Para atingir esse objetivo, o fotobranqueamento e a fototoxicidade são minimizados através da digitalização rápida a uma potência de laser muito baixa, e as dimensões de pixel e os intervalos Z-Step são definidos para os maiores valores que são compatíveis com a amostragem da imagem em resolução total. Os conjuntos de dados 4D resultantes são ruidosos, mas podem ser suavizados pela desvolução. Mesmo com dados de alta qualidade, a fase de análise é desafiadora porque as estruturas intracelulares são muitas vezes numerosas, heterogêneas e móveis. Para atender a essa necessidade, os plugins personalizados do ImageJ foram gravados em dados de matriz 4D em uma tela de computador, identificam estruturas de interesse, editam os dados para isolar estruturas individuais, quantificam os cursos de tempo de fluorescência e fazem filmes das pilhas Z projetadas. os filmes 4D são particularmente úteis para distinguir compartimentos estáveis de compartimentos transitórios que se transformam por maturação. Esses filmes também podem ser usados para caracterizar eventos como a fusão do compartimento, e para testar os efeitos de mutações específicas ou outras perturbações.

Introdução

Os compartimentos do sistema do endomembranas estão no fluxo constante, e sua caracterização cheia exige a imagem latente viva da pilha. É descrito aqui um protocolo que emprega a microscopia confocal de 4D (lapso de tempo 3D) para visualizar compartimentos cDNAs etiquetados em leveduras de brotamento. O método foi desenvolvido para rastrear a dinâmica dos compartimentos secretores em Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Este protocolo centra-se sobre S. Centrume, que tem um Golgi nonempilhados em que os cisternae individuais são opticamente resolvíveis⁴. A organização incomun de Golgi em S. cerevisiae permitiu a demonstração pela microscopia 4D que um cisterna de Golgi etiqueta inicialmente com as proteínas adiantadas do Golgi do residente, e perde então aquelas proteínas ao adquirir proteínas atrasadas residentes do Golgi^{3 ,5}. Esta transição pode ser visualizada através da criação de uma cepa em que o início da proteína Golgi Vrg4 é rotulado com GFP, enquanto o final da proteína Golgi Sec7 é rotulado com uma proteína monomérica vermelha fluorescente. Quando as cisternas individuais são controladas, a maturação é observada como uma conversão verde-a-vermelha³. Este tipo de análise pode fornecer informações valiosas sobre a localização de proteínas e a identidade do compartimento. Por exemplo, duas proteínas com tempos de chegada e partida ligeiramente compensados podem, às vezes, aparecer para rotular diferentes compartimentos em imagens estáticas, mas podem ser vistos em filmes 4D para rotular o mesmo compartimento em diferentes pontos de tempo^6,7 . Assim, a microscopia 4D revela fenômenos que, de outra forma, não seriam evidentes.

A microscopia 4D informativa de compartimentos do fermento pode ser conseguida com procedimentos e equipamento apropriados². Sempre que possível, a marcação de proteínas fluorescentes é realizada pela substituição do gene⁸ para evitar artefatos de superexpressão. Porque as estruturas intracelular são frequentemente muito dinâmicas, a imagem latente 4D é precisada assegurar-se de que uma estrutura esteja controlada confiantemente sobre o tempo. O protocolo descrito aqui emprega um microscópio confocal da exploração do laser equipado com os detectores elevados da sensibilidade. Com este dispositivo, o volume inteiro da pilha de s. cerevisiae pode ser imaged pela microscopia confocal aproximadamente cada 1-3 s, com os intervalos de 2 s que são típicos. Os dados podem ser coletados por até 5-15 min, dependendo das densidades de rotulagem dos fluoróforos e suas propriedades fotofísicas. O obstáculo principal é minimizar o fotobranqueamento. Para esta finalidade, as intensidades do laser são mantidas tão baixas como possível, a velocidade Confocal da varredura são maximizadas, e os parâmetros óticos são configurados à imagem no limite de Nyquist a fim capturar a informação relevante ao evitar a exposição clara excessiva. Essas configurações também são esperadas para aliviar a fototoxicidade, um fator que muitas vezes é negligenciado durante a imagem de célula viva^9,10,11. Os dados ruidosos resultantes são processados com correção de lixívia e algoritmos de desvolução para facilitar a quantificação das intensidades de fluorescência.

Mesmo com filmes 4D de alta qualidade, a análise é complicada porque os compartimentos de levedura tendem a ser numerosos, heterogêneos e móveis. Devido às limitações intrínsecas da microscopia confocal e dos ajustes não-óptimos exigidos para a imagem latente 4D prolongada, as estruturas fluorescentes que são perto de se são duras de resolver. Este problema pode ser contornado centrando-se no pequeno número de estruturas fluorescentes que permanecem opticamente resolvíveis durante o período de rotulagem, com a suposição de que essas estruturas são representativas de toda a população de rotulados Compartimentos. Os compartimentos fluorescentes que podem ser controlados confiantemente são identificados visualizando filmes de pilhas Z projetadas e criando uma série de montagens em que as seções óticas para cada ponto de tempo são vestiu em uma tela de computador. Essa análise emprega plugins personalizados do ImageJ¹² , que permitem que uma estrutura individual seja rastreada isoladamente.

Os trabalhos recentes dos métodos cobriram o uso de proteínas fluorescentes no fermento¹³ assim como a teoria e a prática da imagem latente confocal 4D de pilhas de fermento². Este protocolo centra-se sobre os principais aspectos práticos de um experimento de imagem 4D. Ele inclui alguns aprimoramentos para procedimentos descritos anteriormente, bem como versões atualizadas do código e da documentação do plug-in do ImageJ. O exemplo mostrado centra-se sobre a dinâmica de Golgi, mas este protocolo é ingualmente apropriado para imagens outros compartimentos do fermento.

Protocolo

1. preparação

1. Faça o meio NSD mínimo não fluorescente². Espera-se que a ausência de riboflavina reduza a fluorescência verde intracelular de fundo e a fototoxicidade associada.
2. Cresça a tensão da levedura durante a noite em ~ 23 ° c à fase logarítmica em 5 mL de NSD em um balão perplexo de 50 mL com boa aeração. Aproximadamente 3-4 h antes da análise, diluir a cultura do fermento em NSD fresco de modo que o OD final₆₀₀ seja 0.5-0.8 na altura da imagem latente.
3. Prepare uma solução de 2 mg/mL de Concanavalina A (A). Se desejado, congele alíquotas desta solução em nitrogênio líquido e armazene a-80 ° c.
4. Gire a solução de OCM por 5 min na velocidade máxima em um microcentrifugador para remover a matéria particulada que pode interferir com a imagem latente. Em seguida, adicione 250 μL do sobrenadante a um prato limpo de microscópio de fundo de cobertura de 35 mm. Após 15 min, lave 2-3 vezes com 2 mL de dH₂O e deixe secar.
5. Adicione 250 μL da cultura de levedura ao prato revestido com a mesma, aguarde 10 min para permitir que as células adiram e lave suavemente 2-3 vezes com 2 mL de NSD. Cubra as células com 2 mL de NSD fresco.

2. imagem latente

1. Use uma lente de imersão de óleo de 63x ou 100x. Uma abertura numérica (NA) de 1,40 é suficiente, mas uma lente NA maior também pode ser usada.
2. Formatar o tamanho do quadro para 256 x 128 (largura x altura). Se um tamanho de frame maior é necessário, aumentar a largura não reduzirá a velocidade da varredura contanto que o microscópio confocal for equipado com um varredor ressonante.
3. Ajuste o fator de zoom para fazer o tamanho do pixel ~ 80 nm.
4. Use a velocidade máxima da varredura, que é tipicamente na ordem de 8 quilohertz. Ative a digitalização X bidirecional se estiver disponível e se os experimentos de controle confirmarem que as varreduras das duas direções estão no registro.
5. Defina o acúmulo de linha para 4 ou 6. Certifique-se de usar a acumulação (soma) em vez da média.
6. Ajuste o furo de pino a 1,2 unidades arejados. Empirically, quando a imagem latente vive as pilhas de fermento, este ajuste captura mais fótons do que a escolha padrão de 1,0 unidade pairosa ao não causar nenhuma perda apreciável da definição.
7. Para cada canal de fluorescência, defina o comprimento de onda de excitação, atribua um detector de alta sensibilidade, defina a faixa de comprimento de onda de emissão e ative o modo de contagem de fótons, se disponível. As escolhas do comprimento de onda dependerão dos Fluorophores. Como exemplo, excitar a fluorescência GFP a 485 nm e recolher a partir de 495-550 nm, e excitar a fluorescência mScarlet a 555 nm e recolher a partir de 562-625 nm.
8. Defina a intensidade de cada laser para ser o mais baixo possível. Essa configuração deve ser determinada empiricamente. Uma intensidade apropriada resultará na captura de uma sequência de imagem barulhenta mas interpretável, com o clareamento do sinal de fluorescência não superior a 50% até o final de um filme de 5 min. No microscópio confocal usado aqui (veja a tabela de materiais), esta intensidade corresponde a um ajuste do poder do laser na ordem de 5%.
9. Use filtros de entalhe ou tempo de gating para evitar a captura de luz refletida da lamínula. Se o gating do tempo está disponível, ajuste a janela de gating a 0.6-10.0 NS.
10. Ative a imagem latente do brightfield e use um detector da baixa sensibilidade para a coleta de dados. Defina o ganho para um nível que torna as células claramente visíveis. Não use contraste de interferência diferencial (DIC) porque o prisma interferirá na captura de dados de fluorescência confiáveis.
11. Ajuste o intervalo da Z-etapa a 0.25-0.35 μm. imagem todo o volume das células de levedura coletando cerca de 20-25 seções ópticas por Z-Stack. Especifique a direcionalidade da imagem de tal forma que "para baixo" move-se para a lamínula.
12. Para um filme típico, defina o intervalo de tempo entre as pilhas Z para 2 s e defina a duração do filme para 5 a 10 min. dependendo do compartimento em estudo, reduza o intervalo para fazer filmes mais curtos de dinâmicas relativamente rápidas, ou aumente o intervalo para fazer filmes mais longos de dinâmica relativamente lenta.
13. Salve o filme como um arquivo LIF com as imagens do brightfield no último canal. Profundidades de bits mais elevadas são desnecessárias nesta fase e o pipeline de processamento está configurado para aceitar dados TIFF de 8 bits.

3. desvolução

1. Inicie o software deconvolução (consulte a tabela de materiais), usando o algoritmo de estimativa de máxima verossimilhança clássica.
2. Abra o conjunto de dados gerado na etapa 2,13. Selecione "Assistente de deconvolução". Inspecione os valores exibidos no "Assistente de parâmetro". Os parâmetros de imagem devem ser detectados e exibidos corretamente. Em "índices refrativos", altere o valor "incorporação med." para 1,40 para aproximar o citoplasma de levedura. Em "lamela", selecione "Launch editor" e "posição estimada" e "OK" para definir a posição de lamínula. Selecione "definir todos os verificados" e "aceitar".
3. Prossiga através do "Assistente de deconvolução" para cada canal de fluorescência. Selecione "manual" como o modo de estimativa de fundo. Inspecione o perfil de intensidade de fluorescência de dados brutos para determinar um valor de plano de fundo estimado, que normalmente é cerca de 0,1.
4. No menu de configuração de deconvolução, insira um valor de "iterações máximas" de 40 e desative a correção de lixívia. Insira um valor de SNR estimado, que é tipicamente cerca de 5,0. Clique em "Deconvolve".
5. Se necessário, retorne ao arquivo de dados original, ajuste o fundo e os valores SNR, e repita a deconvolução, até que o ruído seja removido suficientemente sem eliminar a fluorescência genuína das estruturas Dim.
6. Mesclar o brightfield e desvolvido canais de fluorescência. Para as etapas de edição de filme subseqüentes no ImageJ, organize os canais de tal forma que o vermelho é o primeiro, verde (se presente) é o próximo, azul (se presente) é o próximo, e brightfield é o último. Salve a sequência de imagens como um arquivo TIFF de 8 bits.

4. correção de lixívia e geração de filmes

1. Importe a sequência de imagens seções para ImageJ e converta-a em uma hiperpilha escolhendo Image > hyperstacks > Stack para hyperstack. Selecione "xyzct" no menu suspenso e preencha o número de canais, fatias de pilha Z e prazos (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
2. Escolha Imagem > cor > canais divididos.
3. Corrija os canais de fluorescência para fotobranqueamento usando o plugin ImageJ disponível em http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Uma vez que o plugin foi baixado e instalado, escolha plugins > EMBLtools > correção Bleach. Selecione "ajuste exponencial".
4. Para mesclar o brightfield e os canais de fluorescência corrigidos por lixívia em uma hiperpilha, escolha Imagem > cor > Mesclar canais. Salve o hyperstack resultante como um arquivo TIFF de 8 bits.
5. Instale os plugins personalizados do ImageJ fornecidos com este protocolo. Siga as instruções no documento de acompanhamento para visualizar, editar e quantificar a sequência de imagens, e para produzir um filme final das pilhas Z projetadas.

Resultados

O exemplo dado aqui documenta e quantifica a maturação de duas cisternas de Golgi do fermento como visualizadas pela microscopia confocal 4D da duplo-cor³. Uma célula de levedura contém na ordem de 10-15 Golgi cisternae, cada um dos quais amadurece ao longo de um curso de tempo de aproximadamente 2-4 min. a maturação pode ser visualizada através da marcação do marcador Golgi precoce Vrg4 com GFP e marcando o marcador final do Golgi Sec7 com um fluorescente...

Discussão

a imagem latente de 4D confocal de organelas do fermento exige o ajuste cuidadoso de parâmetros múltiplos. A maior preocupação é o fotobranqueamento e a fototoxicidade. Um típico filme 4D envolve a coleta de milhares de seções ópticas, de modo que a iluminação do laser deve ser mantido o mais baixo possível. As etiquetas fluorescentes em tandem da proteína podem ser usadas para impulsionar o sinal sem aumentar a expressão da proteína etiquetada^16,17

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software