JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنقية microRNAs خارج الخلية من خلية ثقافة وسائل الإعلام لبناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل الجيل القادم. مختلف نقاط التفتيش لمراقبة الجودة ويرد وصف للسماح للقراء لفهم ما يمكن توقعه عند العمل مع نماذج الإدخال المنخفضة مثل اكسرناس.

Abstract

الكشف خارج الخلية وتعميم (اكسرنا) يتم إنتاجها بواسطة العديد من أنواع الخلايا في الجسم وتوجد في العديد من سوائل الجسم مثل اللعاب والبلازما والمصل، والحليب والبول. هي واحدة من مجموعة فرعية من هذه الكشف المنظمين بوسترانسكريبشونال – ميكرورناس (ميرناس). لتحديد ميرناس تنتجها أنواع محددة من الخلايا، يمكن استخدام نظم الاستزراع في المختبر للحصاد، واكسرناس الشخصية المستمدة من مجموعة فرعية واحدة من الخلايا. العوامل يفرز من الخلايا الجذعية الوسيطة متورطون في التخفيف من العديد من الأمراض، ويستخدم كالنظام النموذجي في المختبر هنا. وتصف هذه الورقة عملية جمع، وتنقية من الحمض النووي الريبي الصغيرة وتوليد المكتبة إلى تسلسل ميرناس خارج الخلية. اكسرناس من وسائط الثقافة تختلف عن الحمض النووي الريبي الخلوية كونها منخفضة عينات من الحمض النووي الريبي الإدخال، الذي يدعو إلى إجراءات محسنة. يوفر هذا البروتوكول دليل شامل للتسلسل اكسرنا صغيرة من وسائط الثقافة، تظهر نقاط التفتيش لمراقبة الجودة في كل خطوة أثناء تنقية اكسرنا وتسلسلها.

Introduction

خارج الخلية وتعميم الكشف (اكسرناس) موجودة في سوائل الجسم المختلفة وهي مقاومة نحو رنسيس1،2. وفرة عالية، واستقرارها وسهولة الوصول بشكل جذاب للتقييم السريري كعلامات التشخيص وتنبؤاتها3. واسطة النقل اكسرناس وتشمل حويصلات خارج الخلية (EVs)، رابطة مع البروتينات الدهنية (مثل البروتين الدهني الكثافة؛ الحميد) ومجمعات ريبونوكليوبروتين (مثل مع مجمعات Argonaute2)4.

هي مجموعة فرعية اكسرناس ميكرورناس (ميرناس)، وصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 22 nt التي تنظم التعبير الجيني بوسترانسكريبشونال. ميرناس السابقين قد تورطت في خلية خلية الاتصال وتنظيم التوازن الخلية5. على سبيل المثال، يسلم الحميد السابقين-مير-223 إلى خلايا بطانية لقمع جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) والتهاب6. من المثير للاهتمام، كما يعتبر المنقولة من حويصلات خارج الخلية من الكريات البيضاء إلى خلايا سرطان الرئة، برمجة إليها اتخاذ على النمط الظاهري أكثر الغازية7مير-223. وهكذا، الترنسكربيتوم ميرناس السابقين من مختلف سوائل الجسم وخلية الثقافة المتوسطة سوف تحسن كثيرا من فهمنا لإشارات السابقين-ميرنا.

الجيش الملكي النيبالي الصغيرة تسلسل (seq رنا الصغيرة) هو أداة قوية يمكن استخدامها لفهم ترانسكريبتوميكس الكشف الصغيرة. ويمكن مقارنة عينات مختلفة بين الكشف عن خلطات المعروفة، بل يمكن أيضا الكشف عن رواية الكشف الصغيرة وتتميز. ونتيجة لذلك، كما أنها وسيلة قوية لتحديد ميرناس أعرب عن خلطات تحت ظروف مختلفة. واحدة من عقبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير أن الصعوبة في توليد مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة من السوائل اكسرنا منخفضة المدخلات مثل السوائل المخية، اللعاب، البول، والحليب، والمصل ووسائل الإعلام الثقافة. يتطلب البروتوكول "تراسك الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية" من إيلومينا تقريبا 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي جودة عالية ويتطلب البروتوكول "نيبنيكست الصغيرة رنا المكتبة الإعدادية مجموعة" من نيو إنجلاند Biolabs 100 ميكروغرام 1 نانوغرام من الجيش النيبالي الملكي8،9. وفي أحيان كثيرة، مجموع الجيش الملكي النيبالي من هذه العينات الكشف عن الحد الأدنى للتقليدية تجاه الأشعة فوق البنفسجية الطيفية.

السابقين-ميرناس المستمدة من سوائل الجسم علامات تشخيصية والتشخيص يحتمل أن تكون جيدة. بيد من أجل دراسة الآثار الفنية أو لتحديد منشأ محددة السابقين-ميرناس، خلية ثقافة النظم غالباً ما تستخدم بدلاً من ذلك. وقد درست الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع لأن تلك المركبات قد تورطت في التخفيف من كثير من الأمراض بما في ذلك احتشاء عضلة القلب ومرض الزهايمر والابتزاز مقابل المرض المضيف10. هنا، نحن إظهار تنقية ميرناس السابقين من MSCs المشتقة من نخاع العظام (بمسكس) والخطوات المحددة المستخدمة لتحسين البناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل وتحليل البيانات (الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (ماجستير وسائل الإعلام) أعد مسبقاً كما هو مبين في الجدول للمواد.

1-خلية ثقافة

ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة من نخاع العظام، والأنسجة الدهنية أو مصادر أخرى11. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء همسكس من خلال مورد. بمسكس المستخدمة في هذا البروتوكول كانت مستمدة من نخاع العظام من المرضى واشترى من شركة.

  1. ذوبان الجليد 1 × 106 بمسكس في قارورة T175 التي تحتوي على 20 مل وسائط MSC. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 واستبدال وسائط الإعلام كل 2-3 أيام حتى 80% كونفلوينسي.
  2. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS وتجاهل برنامج تلفزيوني.
  3. فصل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من 0.05% يدتا التربسين وتفرخ الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط على جانبي قارورة تيسيرا لمفرزة.
  4. إضافة 15 مل وسائط MSC لإلغاء تنشيط التربسين، وفصل الخلايا من السطح، وماصة صعودا وهبوطاً للحصول على تعليق خلية مفردة.
  5. جمع الخلايا في أنبوب 50 مل وتدور إلى أسفل لمدة 5 دقائق في 300 x ز بيليه الخلايا.
  6. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل وسائط MSC وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    ملاحظة: نخاع العظام الأولية البشرية MSCs في كونفلوينسي 80% في قارورة T175 حوالي 2 × 106 خلايا.
  7. لوحة همسكس في 2,000 الخلايا/سم2 في وسائل الإعلام لجنة السلامة البحرية الطازجة في قوارير T175 5. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 واستبدال وسائط الإعلام كل 2-3 أيام حتى يتم الحصول على 5 قوارير من قوارير T175 المتلاقية 90%.

2-المركبات الكهربائية وجمع الجزيئات الحيوية المرتبطة بالجيش الملكي النيبالي

ملاحظة: EV مجموعة وسائل الإعلام مستعدة مسبقاً (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو [دميم] مع 10% مصل بقرى الجنين [FBS] و 1% البنسلين/ستربتوميسين [P/S]). EV مجموعة وسائل الإعلام العادي ماجستير الإعلام، ولكن أعد مع FBS المستنفد EV التجارية (جدول المواد). هذا هو لتجنب تلوث اكسرنا البقري من FBS، التي عادة ما تحتوي على اكسرناس المرتبطة بالمركبات الكهربائية، ريبونوكليوبروتينس، والبروتينات الدهنية. لإعداد مكتبة رنا الصغيرة، اكسرناس المستمدة من قوارير المتلاقية 5 من MSCs مطلوبة لتمكين بناء المكتبة.

  1. تغسل الخلايا 3 x مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في قارورة T175. إضافة 20 مل من EV مجموعة وسائل الإعلام كل قارورة T175 متكدسة من MSCs واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 48.
  2. جمع وسائل الإعلام والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 10 دقيقة في 300 x ز و 4 درجة مئوية.
  3. جمع المادة طافية والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 20 دقيقة في 2,000 س ز و 4 درجة مئوية.
  4. جمع المادة طافية والطرد المركزي وسائط الإعلام عن 30 دقيقة في 15,500 س ز و 4 درجة مئوية. ثم جمع المادة طافية.
  5. نقل الوسائط إلى أنابيب ultracentrifuge وبيليه اكسرناس لمدة 90 دقيقة في 100000 x ز و 4 درجات مئوية. دوار زاوية ثابتة تستخدم هنا وبيليه يرتكز إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على الجانب من الغطاء ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه.
  6. إزالة المادة طافية والجاف داخل الأنبوب بعكس الأنبوبة على ورقة ماصة واستخدم قطعة صغيرة من ورقة ماصة لإزالة السائل داخل الأنبوب دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني من فورتيكسينج لمدة 30 ثانية وبيبيتينج صعودا وهبوطاً 20 x.
  7. تقييم المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية مع نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA) (الشكل 2).
    ملاحظة: المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية يمكن أن تقيم مع نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA)، وتشتت الضوء الحيوي (DLS) أو انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)12.
  8. تخزين المركبات والجزيئات الحيوية في-80 درجة مئوية حتى المزيد من تجارب المتلقين للمعلومات.
    ملاحظة: إذا تسير المركبات الكهربائية التي ستستخدم للدراسات الفنية، يجب إضافة الجلسرين 20% لحمايتهم من يمزق. ويمكن جمع الخلايا باستخدام إجراءات معيارية إذا لزم الأمر.

3-المركبات والجزيئات الحيوية المرتبطة بالجيش النيبالي الملكي مجموعة من الخلايا المتمايزة

ملاحظة: المركبات الكهربائية، والجيش الملكي النيبالي ترتبط الجزيئات الحيوية كما يمكن جمعها من وسائط الثقافة الخلية بينما الخلايا الخضوع للتمايز. مثال يصور في البروتوكول وصف التمايز أوستيوبلاستيك وجمع اكسرنا في اليوم 0 و 7 من التفريق. إذا كان مطلوباً أي تمييز، ثم تخطي 3 القسم وانتقل إلى القسم 4.

  1. تحضير الوسائط التمايز أوستيوبلاستيك (دميم مع 10% FBS، 1% P/S، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 الديكساميتازون شمال البحر الأبيض المتوسط، 50 ميكرومتر اسكوربات-2-الفوسفات، و 10 ملم 1.25-فيتامين-D3) جديدة كل مرة.
  2. مرة MSCs روافد 80%، تغيير الوسائط MSC للتمايز أوستيوبلاستيك وسائل الإعلام.
  3. تجديد وسائط الإعلام التمايز أوستيوبلاستيك بعد 2-3 أيام.
  4. في يوم 5 من التمايز، قم بإزالة الوسائط وتغسل الخلايا 3 x مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في قارورة T175.
  5. إضافة 20 مل وسائط جمع EV التي تحتوي على 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 الديكساميتازون شمال البحر الأبيض المتوسط و 50 ميكرومتر اسكوربات-2-الفوسفات و 10 ملم 1.25-فيتامين-د3 كل قارورة T175 متكدسة من MSCs. إينكوباتي الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 48 ساعة لضمان استمرار التفريق بين حين جمع المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية.
  6. جمع وسائل الإعلام في يوم 7 والمضي قدما لعزل المركبات الكهربائية والجزيئات الحيوية كما هو موضح في الخطوات من 2، 2، 2-6.
  7. لمراقبة الجودة، والبذور الخلايا في 96-الآبار أو 6-آبار لتقييم التمايز باستخدام مقايسة نشاط الفوسفاتيز قلوية (حزب العمال الأسترالي) أو مع الكمية البلمرة المتسلسل (qPCR)، على التوالي.
    ملاحظة: الرقم 3 مثال على إظهار التمايز أوستيوجينيك الخلايا.

4-رنا الاستخراج ومراقبة الجودة

  1. ذوبان الجليد عينات من الخطوة 2.8 على الجليد. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد).
  2. الوت الجيش الملكي النيبالي من العمود المنصوص عليها في مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (جدول المواد) في 100 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي.
  3. يركز الجيش الملكي النيبالي خلال هطول الأمطار الإيثانول بإضافة 1 ميكروليتر الجليكوجين و 10 ميكروليتر من خلات الصوديوم 5.5 درجة الحموضة 2 م 250 ميكروليتر برود قبل 99 ٪ الإيثانول إلى 100 ميكروليتر من الجيش النيبالي الملكي المنقي.
  4. احتضانها العينات من-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعجل بالجيش الملكي النيبالي. بيليه الجيش الملكي النيبالي سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بيليه أبيض بسبب هطول الأمطار المشارك مع الجليكوجين.
  5. إزالة المادة طافية وتغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 1 مل إيثانول 75%. بيليه الجيش الملكي النيبالي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية.
  6. إزالة الإيثانول وترك غطاء أنبوب الحمض النووي الريبي مفتوحة لمدة 5-10 دقيقة للهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي. ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 7 من المياه خالية من رناسي.
  7. التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي وتركيز باستخدام جهاز التفريد شعرية القائم على رقاقة للكشف عن الجيش الملكي النيبالي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة قبل بناء المكتبة.
    ملاحظة: يرد توزيع حجم ممثل الجيش الملكي النيبالي في الشكل 4.
  8. استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية باستخدام مجموعة أدوات تنقية تجارية (جدول المواد) إذا لزم الأمر.

5-مكتبة البناء ومراقبة الجودة

ملاحظة: المكتبات الصغيرة الحمض النووي الريبي هي التي شيدت باستخدام مجموعات تجارية (جدول المواد) مع إجراء تعديلات بسبب الجيش الملكي النيبالي منخفضة المدخلات. يتم بناء مكتبة على كتلة مبردة.

  1. البرد في كتلة التدفئة لأنابيب PCR 0.2 مل على الجليد و "الماصة؛" 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 4.6 في أنابيب PCR 0.2 مل رناسي خالية في كتلة مبردة.
  2. تمييع 3 ' محولات (01:10) في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 من محول المخفف ويخلط مع 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز لجمع جميع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. احتضان هذا المزيج محول الحمض النووي الريبي و 3 ' على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler حرارية مسخن ومن ثم ضع العينة مرة أخرى على كتلة مبردة.
  4. إضافة 1 ميكروليتر من ربط المخزن المؤقت وميكروليتر 0.5 من مثبط رناسي ميكروليتر 0.5 من الحمض النووي الريبي T4 ليجاسى (حذف المسخ) إلى الخليط محول الحمض النووي الريبي و 3 '. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز.
  5. احتضان الأنبوب عند 28 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن.
  6. إضافة 0.5 ميكروليتر من حل توقف في أنبوب عينة مع أنبوب البقاء في cycler الحرارية، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x والاستمرار في احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. تمييع 5 ' محولات (01:10) في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 5 'محول في منفصلة خالية رناسي 0.2 مل PCR أنبوب، الحرارة محول 5' على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler الحرارية مسخن، ثم قم بوضع العينة على كتلة مبردة.
  8. إضافة 0.5 ميكروليتر من 10 نانومتر ATP، ميكروليتر 0.5 من ليجاسى الجيش الملكي النيبالي T4 إلى أنبوب محول 5 '، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز في تجميع جميع السوائل إلى الأسفل.
    ملاحظة: الاحتفاظ في محول 5 ' في كتلة مبردة بقدر الإمكان.
  9. إضافة 1.5 ميكروليتر من خليط محول 5 ' إلى العينة من الخطوة 5، 6، وتخلط بلطف جداً من بيبيتينج 8 س ببطء. احتضان العينة عند 28 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن.
  10. تمييع RT التمهيدي 01:10 في المياه خالية من رناسي في أنبوب بكر 0.2 مل رناسي مجاناً. إضافة ميكروليتر 0.5 من المخفف RT التمهيدي في العينة من الخطوة 5-9، المزيج بلطف جداً من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x ببطء والطرد المركزي بإيجاز.
  11. احتضان العينة على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في cycler الحرارية مسخن ثم قم بوضع العينة على كتلة مبردة.
  12. أضف 1 ميكروليتر من 5 × أول حبلا العازلة، ميكروليتر 0.5 من مزيج دنتب 12.5 ملم، ميكروليتر 0.5 من 100 مم ديثيوثريتول (DTT)، ميكروليتر 0.5 من مثبط رناسي، و 0.5 ميكروليتر من المنتسخة العكسية. المزيج بلطف جداً من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 x ببطء والطرد المركزي بإيجاز.
  13. احتضان العينة عند 50 درجة مئوية ح 1 في cycler الحرارية مسخن للحصول على كدنا.
  14. إضافة ميكروليتر 4.25 من الماء عالي النقاوة ميكروليتر 12.5 من مزيج PCR، 1 ميكروليتر من الفهرس التمهيدي و 1 ميكروليتر من التمهيدي العالمي إلى كدنا. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 8 س والطرد المركزي بإيجاز.
  15. ضع العينة في cycler حرارية وإعداد cycler النحو التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 15 98 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ وفي نهاية الدورة مع 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن تخزين مكتبة معدّة في-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
  16. تنقية المكتبة الجيش الملكي النيبالي بفصل المكتبة على جل الحمض النووي وخفض الهلام (جل الاستخراج) بين 140 bp و 160 شركة بريتيش بتروليوم والتينج المكتبة من الجل بعد البروتوكول قدمته مجموعة البناء مكتبة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، المكتبة معدّة من الخطوة 5.15 يتم تحميلها على جل تجارية (جدول المواد) والمكتبة بين 140 bp و 160 bp هو تنقية خارجاً من الآلي الحمض النووي حجم فراكتيوناتور (جدول المواد) ووفقا البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  17. التركيز وتغسل المكتبة من الخطوة 5.16 استخدام عدة تنقية PCR المستندة إلى عمود (جدول المواد) والوت المكتبة في المياه خالية من رناسي 10 ميكروليتر أخيرا.
  18. تحميل ميكروليتر 1 مكتبة المنقي على رقاقة الحمض النووي (جدول المواد) التحقق من حجم المكتبة بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  19. تمييع ميكروليتر 1 مكتبة المنقي (1: 1000) في الأس الهيدروجيني 10 ملم 8.0 تريس-HCl مع 0.05% بوليسوربيت 20 والتحديد الكمي للمكتبة التي قبكر باستخدام مجموعة أدوات القياس الكمي مكتبة تجارية لقياس تركيز المكتبة باستخدام معايير الحمض النووي في عدة.
  20. تجمع كميات متساوية من المكتبات وفقا لمتطلبات جهاز التسلسل، والتسلسل في نظام تسلسل الفائق.
    ملاحظة: يمكن أن يتم بناء مكتبة من الحمض النووي الريبي الخلوية باستخدام مجموعات نفسه باتباع بروتوكول قياسي للمجموعات.

6-المعلوماتية الحيوية خط أنابيب

ملاحظة: هذا أنبوب داخل المنظمة، ويتم سرد البرامج المستخدمة هنا في "الجدول للمواد"-

  1. تقليم بعيداً منخفضة الجودة ما يلي: وإزالة تسلسل محول من يقرأ الخام.
  2. خريطة يقرأ نظيفة لأنواع مختلفة من الكشف.
    1. إضافة تعليق توضيحي ترنس بالسماح لاثنين من عدم التطابق لأنه يتسبب تسلسل الحمض الريبي النووي النقال معدلة بشكل كبير ميسينكوربوريشن قاعدة متكررة بعكس المنتسخة.
    2. إضافة تعليق ميرناس برسم خرائط للبشرية ميرناس من v21 ميرباسي السماح بالصفر عدم التطابق. حيث تخضع ميرناس أ وهي يو nontemplated 3 'نهاية الإضافات، متواليات التي لا تقم بتعيين 3' قلص من nts يصل إلى ثلاثة ألف و/أو تي بعدها يتم تعيين ما يلي ميرناس البشرية وأخرى ميرناس من v21 ميرباسي السماح بالصفر عدم التطابق.
    3. إضافة تعليق توضيحي إلى أخرى الكشف صغيرة ذات الصلة (سنرنا، سنورنا و piRNA والكشف Y) بالسماح لعدم تطابق واحد.
    4. خريطة القراءات غير المعينة المتبقية إلى طويلة من مجموعات بيانات الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي، الجيش الملكي النيبالي غيرها من رفام، ومرناً) لتقييم التدهور.
    5. إضافة تعليق توضيحي في تسلسل الجينوم البشري.
    6. إضافة تعليق توضيحي تسلسلات الجينوم البكتيري.
    7. تطبيع ميرنا التعبير باستخدام الصيغة التالية: حساب ميرنا/المجموع التهم من جميع ميرناس المعينة) x 106.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول هو الأمثل لجمع اكسرنا من الثقافة لجنة السلامة البحرية لتسلسل الجيل القادم. الخطة الشاملة لسير العمل في الشكل رقم 1 على اليسار ونقاط التفتيش كل منها مراقبة الجودة على الحق.

مورفولوجيا ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتسلسل الجيل القادم من اكسرناس التي تمكن من تحليل التعبير التفاضلية من العينات المدخلات المنخفضة. الانضمام إلى بروتوكول معين لعزل EV واكسرنا مهم لأن التعديلات حتى الصغيرة (أي خطوة تنبيذ فائق أو تغيير نوع الدوار) يمكن أن تؤثر الترنسكربيتوم وميرنا المستويات

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نحن ممتنون للسيد كلاوس الحافلة والسيدة ريتا Rosendahl في إينانو الخاصة بالمساعدة التقنية. شكر خاص إلى الدكتور دانييل أوتزين للسماح لنا الاستخدام المتكرر لبلده أولتراسينتريفوجي. وأيد هذه الدراسة أن الدانمرك "صندوق الابتكار" (حشد المشروع).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem CellsATCCPCS-500-012Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBSGibcoA2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTAGibco25200056
T175 FlaskSarstedt833,912
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffered SalineSigma806552
UltracentrifugeBeckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor used here
NucleoCounterChemometecNC-3000Cell Counter
β-glycerophosphateCalbiochem35675Components of the osteogenic differentiation media
DexamethasoneSigmaD4902-25MGComponents of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10GComponents of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3SigmaD1530-1MGComponents of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAChip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification KitsRocheKK4824Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin PrepSage ScienceAutomated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR purification in step 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabTrimming low-quality reads in step 6
cutadaptAdaptor removal in step 6
BowtieMapping of clean reads in step 6
SamtoolsTo make the expression profile in step 6
BedtoolsTo make the expression profile in step 6

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184(2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292(2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498(2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved