分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

要約

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs のような低入力サンプルを操作するときに期待するものを理解する読者を許可するように記述されています。

要約

細胞外と循環の Rna (exRNA) と体の多くの細胞タイプによって生産されて唾、血漿、血清、牛乳、尿など多数の体液に存在します。これらの Rna の 1 つのサブセットは、転写レギュレータ-マイクロ Rna (Mirna) です。特定の細胞のタイプによって生成される miRNAs の線引き、体外培養システムを収穫する使用ことができます、プロファイル exRNAs が 1 つのセルのサブセットから派生しました。間葉系幹細胞の分泌因子は数多くの疾患を軽減することに関与している、ここでの in vitro モデル システムとして使用されます。本稿では、コレクションのプロセスは、小さな RNA の精製とシーケンス細胞外 miRNAs にライブラリを生成をについて説明します。文化メディアから ExRNAs は細胞 RNA から最適化されたプロシージャの呼び出し、RNA の低入力サンプルをされているによって異なります。このプロトコルは、exRNA の精製とシーケンス中に各段階で品質管理のチェックポイントを示す文化メディアから小さな exRNA シーケンスに包括的なガイドを提供します。

概要

細胞外と Rna (exRNAs) を循環、様々 な体液に存在 RNases^1,2の方が抵抗力があります。その高い豊富、安定性とアクセシビリティのやすさ³診断と予後マーカーとしての臨床的評価のために魅力的です。ExRNAs のための輸送のモードには細胞小胞 (Ev)、リポタンパク質 (高密度リポタンパク質; などとの関連付けが含まれますHDL) とリボ核蛋白質複合体 (よう Argonaute2 錯体を)⁴。

ExRNAs のサブセットが小さい非コーディングの Rna 約 22 であるマイクロ Rna (Mirna)、転写後の遺伝子発現を調節する nt。Ex miRNAs は、細胞間コミュニケーションと⁵セルの恒常性の調節に関与しています。たとえば、HDL は内皮細胞接着分子 1 (ICAM-1) を抑制するために ex ミール 223 を提供および炎症⁶。興味深いことに、ミール 223 も肺癌細胞より侵襲性の表現型⁷を取ることをプログラミングする白血球細胞小胞で運ば見られています。したがって、様々 な体液や細胞培養液から ex miRNAs のトランスクリプトーム、ex miRNA がシグナル伝達の私達の理解が向上します。

小さな RNA シーケンス (小さな RNA seq) は、小さな rna トランスクリプトームを理解するための強力なツールです。発現の知られている Rna の中の異なるサンプルを比較できるだけでなく新規低分子 Rna はまた検出し特徴付けられます。その結果、それはまた異なる条件下での発現の Mirna を識別するために堅牢な方法です。しかし、小さな RNA seq のハードルの一つは髄液、唾液、尿、牛乳の血清、培地のような低 exRNA 入力流体から小さな RNA seq ライブラリを生成するの困難です。イルミナから TruSeq 小さな RNA 図書館準備プロトコルは、高品質の総 RNA の約 1 μ g を必要と、ニュー イングランド biolabs 社から NEBNext 小型 RNA ライブラリの準備のセットのプロトコルが RNA^8,9の 100 ng 1 μ g を必要とします。多くの場合、これらのサンプルからの総 RNA は従来の紫外可視分光光度計の検出限界以下です。

Ex miRNAs 由来の体液は、潜在的によい予後および診断マーカーです。ただし、機能への影響を研究するためにまたは特定の ex miRNAs の起源を決定するため、細胞培養システムが代わりに使用よくされます。EVs は、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植片対宿主病の¹⁰を含む多くの疾患を軽減することに関与しているために、間葉系幹細胞 (MSCs) を盛んに研究されています。ここでは、骨髄由来 Msc (BMSCs) と小さな RNA 図書館の建設、シーケンスとデータ解析 (図 1) を最適化するために使用する特定の手順から ex miRNAs の浄化を示します。

プロトコル

注: 間葉系幹細胞用成長培地 (メディア)材料の表に示すように事前に用意しています。

1. 細胞培養

注: ヒト間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織または他のソースの¹¹から入手できます。また、hMSCs はサプライヤーから購入できます。このプロトコルで使われる BMSCs いた患者の骨髄から派生し、会社から買った。

1. 1 x 10⁶ BMSCs MSC メディアの 20 mL を含む T175 フラスコを解凍します。5% CO₂と 37 ° C で細胞をインキュベートし、80% の confluency まで 2-3 日毎メディアを交換します。
2. 5 ml の 1x PBS のセルを洗浄して、PBS を破棄します。
3. 0.05 %5 mL を追加してセルをデタッチ トリプシン-EDTA と 37 ° C で 5 分間細胞の培養剥離を容易にするために、フラスコの側面をタップします。
4. トリプシンを不活化、表面、および単一細胞懸濁液を取得する上下ピペットから細胞をデタッチする MSC メディアの 15 mL を追加します。
5. 50 の mL の管でスピンダウン細胞ペレットに 300 x gで 5 分間細胞を収集します。
6. メディアの 1 mL の細胞を再懸濁し、診断のセルをカウントします。
   注: プライマリひと骨髄 MSCs T175 フラスコで 80% の confluency には約 2 x 10 の⁶セル。
7. プレート hMSCs 2,000 セル/cm²で 5 T175 フラスコで新鮮なメディア。5% CO₂と 37 ° C で細胞を成長し、メディアを 90% コンフルエント T175 フラスコ 5 フラスコが得られるまで 2-3 日毎に交換します。

2. EVs と生体分子の RNA 関連コレクション

注: EV コレクション メディアが事前準備 (ダルベッコ変更イーグルの中 [DMEM] 10% 牛胎児血清 [FB] と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン [P/S])。EV コレクション メディアは、通常の MSC メディアですが、商用 EV 枯渇 FBS (資材表) を使用しました。これは、リポタンパク質、ribonucleoproteins、EVs に関連付けられている exRNAs が含まれている通常の FBS から牛 exRNA の汚染を避けるためです。小さな RNA ライブラリの準備、MSCs の合流 5 個のフラスコから派生した exRNAs は、ライブラリーの構築を有効にする必要があります。

1. 3 セルを洗浄して T175 フラスコあたり 20 mL の PBS と x。MSCs の合流 T175 フラスコあたり EV コレクション メディアの 20 の mL を追加し、, 5% CO₂ 48 h の 37 ° C で。
2. メディアを収集し、遠心分離機の 300 x gで 10 分間、4 ° C のためのメディア
3. 上清を収集し、遠心分離機の 2,000 x gで 20 分、4 ° C のためのメディア
4. 上清を収集し、遠心分離機の 15,500 x gで 30 分と 4 ° C のためのメディアその後、上清を収集します。
5. 超遠心機チューブにメディアを転送し、100,000 × gと 4 ° C で 90 分の exRNAs をペレットここで使用する固定角ロータとペレットが管の側に固定されています。蓋の側面をマークし、ペレットが見込まれるチューブ側に円を描きます。
6. 上澄みを除去、吸水紙の上管を反転によるチューブの内側を乾燥、吸水紙の小片を使用して管の底に触れることがなくチューブ内の液体を削除します。30 のボルテックスで PBS の 200 μ L でペレットを再懸濁します s と 20 x 上下ピペッティングします。
7. 追跡分析 (国税庁) (図 2) ナノ粒子の EVs と生体分子を評価します。
   注: EVs と生体分子ナノ粒子解析 (国税庁)、動的光散乱 (DL) または透過電子顕微鏡 (TEM)¹²の追跡と評価できます。
8. さらに下流実験まで、EVs と-80 ° C で生体分子を格納します。
   注: EVs 機能研究に使用する場合は、20% のグリセロールは破裂からそれらを保護するために追加する必要があります。細胞は、必要に応じて、標準の手順を使用して収集できます。

3. EVs と分化細胞の生体分子の RNA 関連コレクション

注: EVs と RNA 関連する生体分子、細胞分化、細胞培養媒体から収集したにすることができます。プロトコルに示されている例では、骨芽細胞の分化と 0 と分化の 7 日で exRNA コレクションについて説明します。差別化が必要ない場合は、セクション 3 をスキップし、セクション 4 に進みます。

1. 骨芽細胞様分化メディアを準備 (10% DMEM FBS、1 %p/S、10 mM の β-グリセロリン酸、10 nM デキサメタゾン、50 μ M アスコルビン酸-2-リン酸、および 10 mM 1.25 ビタミン D3) 新鮮な毎回。
2. MSCs が 80% の合流と、骨芽細胞分化メディアに MSC のメディアを変更します。
3. 2 〜 3 日後、骨芽細胞分化メディアを補充します。
4. 分化の日 5、メディアを取り出し、洗浄セル 3 T175 フラスコあたり 20 mL の PBS と x。
5. EV コレクション メディア 10 mM の β-グリセロリン酸を含む 10 nM デキサメタゾン、50 μ M アスコルビン酸-2-リン酸および MSCs。 ように 48 時間 5% CO₂と 37 ° C でセルを続けた加温の合流 T175 フラスコあたり 10 mM 1.25 ビタミン D₃の 20 の mL を追加します。EVs 生体分子を収集しながら分化。
6. 7 日メディアを収集し、EVs と手順 2.2 2.6 では生体分子の分離に進みます。
7. 品質管理のため 96 ウェルやアルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性測定法を用いた分化を評価する 6 井戸かの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) をセルをそれぞれシードします。
   注:図 3は、細胞の骨分化を示す例です。

4. RNA の抽出および品質管理

1. 氷の上の 2.8 のステップからのサンプルを解凍します。RNA 分離キット (資材表) を使用して RNA を抽出します。
2. RNase フリー水の 100 μ L の RNA 分離キット (材料表) で提供される列からの RNA を溶出します。
3. 浄化された RNA の 100 μ L にグリコーゲン、2 M pH 5.5 ナトリウムのアセテートの 10 μ L、冷蔵前 99% エタノールの 250 μ L の 1 μ L の追加によってエタノール沈殿法による RNA を集中します。
4. RNA の沈殿物に一晩に-20 ° C でサンプルをインキュベートします。16,000 x gと 4 ° C で 20 分間遠心分離によって RNA をペレットします。
   注: ペレットはグリコーゲンとの共沈により、白です。
5. 上澄みを除去し、75% エタノール 1 mL で RNA の餌を洗います。16,000 x gと 4 ° C で 5 分間のために再度 RNA をペレットします。
6. エタノールを取り外して RNA チューブの蓋を開いたまま空気に 5-10 分の乾燥 RNA ペレット。RNase フリー水の 7 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。
7. RNA の品質と図書館の建設前に、製造元のプロトコルによると RNA を検出するキャピラリー電気泳動のチップを使ったマシンを用いた濃度を確認してください。
   注: RNA の代表的なサイズの分布は、図 4に示すです。
8. 必要に応じて市販の精製キット (材料表) を使用して細胞の RNA を抽出します。

5. 図書館の建設と品質管理

注: 小さな RNA ライブラリは、入力低 RNA による調整で商業キット (資材表) を使用して構築されます。図書館の建設は、チルド ブロックで実行されます。

1. 0.2 mL PCR チューブ氷の上の暖房のブロックを冷やすし、冷えたブロックの RNase フリー 0.2 mL PCR チューブにステップ 4.6 からの RNA の 5 μ L をピペットします。
2. RNase フリー 0.2 mL PCR チューブに RNase 自由水の 3' アダプター (1:10) を希釈します。希釈アダプターの 0.5 μ L を追加し、RNA の 5 μ L 上下 8 x と遠心分離機管の下部にすべての液体を収集するために簡潔にピペッティングで混ぜます。
3. 予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C で RNA と 3' アダプター ミックスをインキュベートし、チルドのブロックに戻ってサンプル。
4. RNA と 3' アダプターの混合物に結紮バッファーの 1 μ L、RNase 阻害剤 0.5 μ L と T4 RNA リガーゼ (削除変異) の 0.5 μ L を追加します。8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。
5. 予熱した熱 cycler で 1 h 28 ° C でチューブを孵化させなさい。
6. 熱 cycler でチューブのサンプル チューブに停止液を 0.5 μ L を追加し、8 x 上下ピペッティングで混ぜる 28 ° C、15 分インキュベート続けます。
7. RNase フリー 0.2 mL PCR チューブ内の水の RNase フリーの 5' アダプター (1:10) を希釈します。独立した RNase フリー 0.2 mL PCR チューブ、熱予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C で 5' アダプターにアダプター 5' の 0.5 μ L を追加し、チルド ブロックのサンプル。
8. 10 nM の ATP、5' アダプター チューブに T4 RNA リガーゼの 0.5 μ L の 0.5 μ L を追加、8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、遠心分離機の底にすべての液体を収集するために簡潔に。
   注: 可能な限りチルド ブロックに 5' アダプターを保ちます。
9. 5.6 のステップからサンプルに 5' アダプター混合物の 1.5 μ L を追加し、ゆっくりとピペッティング 8 x でとてもやさしく混ぜます。予熱した熱 cycler で 1 h 28 ° C でサンプルをインキュベートします。
10. RT プライマー 1:10 を RNase フリーの 0.2 mL PCR チューブに RNase フリーの水で希釈します。ステップ 5.9、非常に穏やかでゆっくり上下に 8 x ピペッティング ミックスからサンプルに希薄化後の RT プライマーの 0.5 μ L を追加し、遠心分離機の簡潔にします。
11. 予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C でサンプルをインキュベートし、チルド ブロックのサンプル。
12. 最初の鎖バッファー、12.5 mM dNTP ミックスの 0.5 μ L、100 mM ジチオトレイトール (DTT)、RNase 阻害剤 0.5 μ L と逆転写酵素の 0.5 μ L が 0.5 μ L x 5 の 1 μ L を追加します。とてもやさしく 8 x 上下ゆっくりとピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。
13. 1 h cDNA を取得する予熱した熱 cycler で 50 ° C でサンプルをインキュベートします。
14. CDNA に純水の 4.25 μ L、12.5 μ L の PCR ミックス、インデックス プライマーの 1 μ L と普遍的なプライマーの 1 μ L を追加します。8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。
15. サーマルサイクラーにサンプルを置き、サーマルサイクラーを次のように設定: 98 ° C、30 秒。15 サイクル 98 ° C の 10 s、60 ° C、30 s および 15 のための 72 ° C s;72 ° C で 10 分間のサイクルを終了します。
    注: 準備されたライブラリは-20 ° C で 1 週間保存できます。
16. DNA ゲルのライブラリを分離し、140 の間ゲル (ゲルの抽出) を切断 RNA ライブラリを浄化する bp と 160 bp とライブラリ構築キットで与えられるプロトコル、次ゲルからライブラリを溶出します。
    注: 本研究でステップ 5.15 から準備されたライブラリが読み込まれる商業ゲル (材料表) と 140 の間図書館に bp と 160 bp 精製を自動化された DNA サイズ分留 (材料表) によると、製造元のプロトコル。
17. 集中ステップ 5.16 列ベースの PCR 精製キット (資材表) を使用してからライブラリを洗いし、最終的に 10 μ L RNase フリー水でライブラリを溶出します。
18. 1 μ l 中、次の製造元のプロトコル ライブラリのサイズをチェックする DNA チップ (材料表) に浄化されたライブラリをロードします。
19. 10 mM の pH 8.0 で精製されたライブラリ (1: 1000) の 1 μ L を希釈トリス-HCl と 0.05% ポリソルベート 20、qPCR キットによる DNA 標準ライブラリの濃度を定量化する商用ライブラリ定量キットを使用して、ライブラリを定量化します。
20. 高スループット シーケンス システムのシーケンス マシンとシーケンスの要件に従ってライブラリのプール等しい量。
    注: 細胞 RNA の図書館の建設を行うことがキットの標準的なプロトコルに従うことによって同じキットを使用しています。

6. バイオインフォマティクス パイプライン

注: これは社内パイプラインとここで使用されるプログラムを示す、テーブルの材料。

1. 離れて低品質の読み取りをトリミングし、raw 読み取りからアダプター シーケンスを削除します。
2. きれいな読み取りを Rna の種類にマップします。
   1. 重く変更された tRNA シーケンス逆転写酵素によって頻繁に基本 misincorporation が発生するため、2 つの不一致を許可する、Trna に注釈を。
   2. ゼロの不一致を許可する miRBase v21 から人間の miRNAs へのマッピングによって miRNAs に注釈を付けます。以来、miRNAs は予告なく A と U 非テンプレート 3' 端追加、マップされていないシーケンスは、3' の人間の miRNAs とゼロの不一致を許可する miRBase v21 から他の miRNAs にマップされる読み取り後最大 3 A および/または T の国税庁のトリミングします。
   3. 1 つの不一致を許可することで他の関連する小さな Rna (snRNA、snoRNA、ピルナ、Y Rna) に注釈を付けます。
   4. 劣化を評価するために、残りのマップされていない読み取りを長い RNA データセット (rRNA、Rfam、および mRNA から他の RNA) にマップします。
   5. 人間のゲノムをシーケンスに注釈を付けます。
   6. 細菌のゲノムをシーケンスに注釈を付けます。
   7. 次の数式を使用して、miRNA 式を正規化: miRNA カウント/すべてのマップされた Mirna のカウント) x 10⁶。

結果

このプロトコルで説明する方法は、次世代シーケンシングの MSC 文化から exRNA を収集するために最適です。左の図 1は、ワークフローの全体的なスキームとそれぞれ品質管理チェックポイントには右側に。

コレクションの日に細胞の形態 (図 3 a) 未分化し、区別される (

ディスカッション

ここでは、低入力サンプルから発現解析を可能にする exRNAs の次世代シーケンシングのためのプロトコルについて述べる。でも小さな変化 (すなわち、遠心ステップまたはローターの種類の変更) はトランスクリプトームに影響を与えるために miRNA レベル^13,14EV と exRNA の分離のための特定のプロトコルに従うことが重要です。したがって、どのよう?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells	ATCC	PCS-500-012	Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS	Gibco	A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 Flask	Sarstedt	833,912
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline	Sigma	806552
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor used here
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma	D1530-1MG	Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits	Roche	KK4824	Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012	Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep	Sage Science		Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit	Cold Spring Harbor Lab		Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt			Adaptor removal in step 6
Bowtie			Mapping of clean reads in step 6
Samtools			To make the expression profile in step 6
Bedtools			To make the expression profile in step 6