격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

요약

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

초록

세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.

서문

세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases^1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커³임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)⁴.

ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성⁵의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을⁶. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형⁷에 그들을 프로그래밍 하는 폐 암 세포를 백혈구에서 extracellular 소포에 의해 수송 여겨진다. 따라서, 다양 한 체액 및 세포 배양 매체에서 전 miRNAs의 transcriptome 크게 전 미르 신호에 대 한 우리의 이해를 향상 됩니다.

작은 RNA 시퀀싱 (작은 RNA seq) 작은 RNAs의 transcriptomics를 이해 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 뿐만 아니라 다른 샘플 차동 표현된 알려진된 RNAs 사이 비교 될 수 있다 하지만 소설 작은 RNAs 수 또한 감지 하 고 특징. 따라서, 그것은 또한 다른 조건 하에서 차동 표현된 miRNAs 식별 하는 강력한 방법입니다. 그러나, 작은 RNA seq의 장애물 중 하나는 뇌 척수의 체액, 타 액, 소변, 우유, 혈 청 및 문화 미디어 같은 낮은 exRNA 입력된 액체에서 작은 RNA seq 라이브러리 생성 어려움입니다. TruSeq 작은 RNA 라이브러리 준비 프로토콜 Illumina에서 고품질 총 RNA의 약 1 µ g 필요 하며 뉴 잉글랜드 Biolabs에서 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 설정 프로토콜 100 ng-1 µ g의 RNA^8,9. 때때로, 이러한 샘플에서 총 RNA 기존의 대 한 UV 광에 대 한 검출 한계 같습니다.

체액에서 파생 된 전 miRNAs는 잠재적으로 좋은 전조와 진단 마커. 그러나, 기능 효과 연구 하거나 특정 전 miRNAs의 원산지 결정, 세포 배양 시스템 자주 대신 사용 됩니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 그들의 EVs 심근 경색, Alzheimer의 질병과 접 붙이다 비교 호스트 질병¹⁰를 포함 하 여 많은 질병을 경감에 연루 되어 있기 때문에 광범위 하 게 연구 되었습니다 있다. 여기, 우리 골 수 파생 된 MSCs (BMSCs)와 작은 RNA 도서관 건설, 시퀀싱 및 데이터 분석 (그림 1)을 최적화 하는 데 사용 하는 특정 단계에서 전 miRNAs의 정화를 보여 줍니다.

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프로토콜

참고: 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSC 미디어)은 재료의 테이블에에서 표시 된 대로 미리 준비가 되어 있습니다.

1. 세포 배양

참고: 인간 중간 엽 줄기 세포는 골 수, 지방 조직 또는 다른 소스¹¹에서 얻어질 수 있다. 양자 택일로, hMSCs는 공급 업체를 통해 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 BMSCs는 환자의 골 수에서 파생 되었고 회사에서 구입.

1. 1 x 10⁶ BMSCs MSC 미디어의 20 mL를 포함 하는 T175 플라스 크에 녹여 5% CO₂ 와 37 ° C에서 세포를 품 어 고 대체 미디어 80 %confluency 매 2-3 일.
2. 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척 하 고 PBS를 삭제.
3. 0.05%의 5 mL을 추가 하 여 셀을 분리 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 5 분에 대 한 세포 배양 분리를 촉진 하기 위하여 플라스 크의 측면을 누릅니다.
4. MSC 미디어 비활성화는 트립 신, 표면, 그리고 단일 셀 정지를 아래로 피 펫에서 셀 분리의 15 mL를 추가 합니다.
5. 50 mL 튜브에 스핀 아래로 작은 셀을 300 x g 에 5 분에 대 한 셀을 수집 합니다.
6. MSC 미디어의 1 mL에 셀 resuspend과 hemocytometer를를 사용 하 여 셀.
   참고: 기본 인간의 골 MSCs에서 80% confluency T175 플라스 크에 약 2 × 10⁶ 세포입니다.
7. 2, 000 셀/cm² 5 T175 플라스 크에 신선한 MSC 미디어 판 hMSCs. 5% CO₂ 와 37 ° C에서 세포를 성장 하 고 미디어 90% confluent T175 플라스 크 5 flasks 얻을 때까지 2-3 일 마다 교체.

2. EVs와 RNA 관련 된 생체 컬렉션

참고: EV 컬렉션 미디어는 사전 준비 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]와 1% 페니실린/스 [P/S]). EV 컬렉션 미디어 정상적인 MSC 미디어, 하지만 상업 EV 고갈 FBS (자료 테이블)와 함께. 이 FBS, 일반적으로 exRNAs 관련 된 EVs, ribonucleoproteins, 및 단백질을 포함에서 소 exRNA 오염 방지 하는. 작은 RNA 라이브러리 준비에 대 한 MSCs의 5 confluent 플라스 크에서 파생 하는 exRNAs 도서관 건축을 활성화 해야 합니다.

1. 3 세포를 씻어 플라스 크 T175 당 20 mL PBS의 x. MSCs의 confluent T175 플라스 크 당 EV 컬렉션 미디어의 20 mL를 추가 하 고 5% CO₂ 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
2. 미디어를 수집 하 고 원심 300 x g 에서 10 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어
3. 상쾌한을 수집 하 고 원심 2000 x g 에서 20 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어
4. 수집 하는 상쾌한 고 원심 15500 x g 30 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어 다음에 상쾌한을 수집 합니다.
5. Ultracentrifuge 관에 미디어를 전송 하 고 작은 공의 100000 x g 와 4 ° C에서 90 분 exRNAs 펠 릿은 튜브의 측면에 고정 되 고 고정된 각도 터 여기 사용 됩니다. 뚜껑의 측면을 표시 하 고 펠 릿으로 예상 튜브 측에 원을 그립니다.
6. 상쾌한 제거, 흡수 성 종이에 튜브를 거꾸로 하 여 튜브의 내부를 건조 하 고 흡수 성 종이의 작은 조각을 사용 하 여 튜브의 바닥을 건드리지 않고 튜브 내부 액체를 제거. 30에 대 한 vortexing에 의해 PBS의 200 μ에 펠 릿을 resuspend s 및 20 x 위아래로 pipetting.
7. EVs와 생체 나노 추적 분석 (NTA) (그림 2)와 함께 평가 합니다.
   참고: EVs와 생체 나노 분석 (NTA), 동적 산란 (DL) 또는 전송 전자 현미경 (TEM)¹²추적으로 평가 될 수 있다.
8. 추가 다운스트림 실험까지 EVs와 생체-80 ° C에 저장 합니다.
   참고: EVs 기능 연구에 사용 될 경우, 20% 글리세롤 파열에서 그들을 보호 하기 위해 추가 해야 합니다. 필요한 경우에 표준 절차를 사용 하 여 셀을 수집할 수 있습니다.

3. EVs와 차별화 된 세포의 RNA 관련 된 생체 컬렉션

참고: EVs와 RNA 관련 된 생체 세포 분화를 받아야 하는 동안 세포 배양에서 수도 있습니다. 프로토콜에 표시 된 예제에서는 osteoblastic 감 별 법 및 하루 0와 차별화의 7에서 exRNA 컬렉션에 설명 합니다. 없는 차별화가 필요한 경우 제 3 항을 생략 하 고 섹션 4로가 서.

1. Osteoblastic 감 별 법 미디어 준비 (DMEM 10 %FBS, 1 %P / S, 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 염, 및 10 mM 1.25 비타민 D3) 신선한 모든 시간.
2. MSCs는 80% 합칠, MSC 미디어 osteoblastic 감 별 법 미디어 변경.
3. 2-3 일 후 osteoblastic 감 별 법 미디어를 보충.
4. 차별화의 날 5, 미디어를 제거 하 고 씻어 3 셀 T175 플라스 크 당 20 mL PBS의 x.
5. EV 컬렉션 포함 된 미디어 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 및 MSCs. 품 5% CO₂ 되도록 48 h에 대 한 37 ° C에서 셀 계속의 confluent T175 플라스 크 당 10 mM 1.25 비타민 D₃ 의 20 mL를 추가 EVs 및 생체 수집 하면서 차별화입니다.
6. 7 일 미디어를 수집 하 고 분리 EVs와 생체 단계 2.2-2.6에에서 설명 된 대로 진행.
7. 품질 관리에 대 한 씨 셀 96-웰 스 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 활동 분석 결과 사용 하 여 차별화를 평가 하기 위해 6-우물 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 각각.
   참고: 그림 3 셀의 osteogenic 차별화를 보여 주는 예제입니다.

4. RNA 추출 및 품질 관리

1. 샘플 단계 얼음에 2.8에서 녹여 RNA는 RNA 격리 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 압축을 풉니다.
2. RNase 무료 물 100 μ에 RNA 격리 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 열 로부터 RNA을 elute.
3. 순화 된 RNA의 100 μ로 글 리 코겐, 2 M pH 5.5 나트륨 아세테이트의 10 μ와 미리 냉장된 99% 에탄올의 250 μ 1 μ를 추가 하 여 에탄올 강 수를 통해 RNA를 집중.
4. -20 ° C 하룻밤 RNA 침전에서 샘플을 품 어. 16000 x g 와 4 ° C에서 20 분 동안 centrifuging으로 RNA를 펠 렛
   참고: 펠 릿 glycogen으로 공동 강수량 때문에 흰색입니다.
5. 상쾌한을 제거 하 고 75% 에탄올의 1 mL와 RNA 펠 릿을 세척. 16000 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 다시 RNA를 펠 렛
6. 에탄올을 열어두고 RNA 튜브의 뚜껑 공기를 5 ~ 10 분 건조 RNA 펠 릿. RNase 무료 물 7 μ에 RNA 펠 릿을 resuspend.
7. RNA 품질 및 제조 업체의 프로토콜 도서관 건축 이전에 따라 RNA를 검출 하 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 기계를 사용 하 여 농도 확인 하십시오.
   참고: RNA의 대표적인 크기 분포는 그림 4에 표시 됩니다.
8. 필요한 경우에 상업적인 정화 키트 (자료 테이블)를 사용 하 여 세포질 RNA를 추출 합니다.

5. 도서관 건설 및 품질 관리

참고: 작은 RNA 라이브러리 입력 낮은 RNA 인해 조정 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 구성 됩니다. 라이브러리 건설 냉장된 블록에서 수행 됩니다.

1. 얼음에 0.2 mL PCR 튜브에 대 한가 열 블록을 진정 하 고 플라스틱 단계 4.6 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 냉장된 블록에서에서 RNA의 5 μ.
2. 3' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 희석된 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 및 원심 분리기 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하는 짧게 위아래로 pipetting으로 RNA의 5 μ와 혼합.
3. 품 어 데워 열 cycler에 2 분 동안 70 ° C에서 RNA와 3' 어댑터 믹스 하 고 냉장된 블록에 다시 샘플을 놓습니다.
4. RNA와 3' 어댑터 혼합물으로의 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 및 T4 RNA 리가 (삭제 돌연변이)의 0.5 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.
5. 데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 튜브를 품 어.
6. 열 cycler에서 튜브 샘플 튜브에 정지 솔루션의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 계속 15 분 동안 28 ° C에 품 어.
7. 5' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 별도 RNase 무료 0.2 mL PCR 튜브, 열 데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 5' 어댑터에 5' 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.
8. 10 nM ATP, 5' 어댑터 튜브에 T4 RNA 리가의 0.5 μ의 0.5 μ 추가, 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 하단에 모든 액체를 수집을 간단히 원심.
   참고: 가능한 냉장된 블록에 5' 어댑터를 유지.
9. 5.6 단계에서 샘플을 5' 어댑터 혼합물의 1.5 μ를 추가 하 고 천천히 pipetting 8 x 매우 부드럽게 혼합. 데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 샘플을 품 어.
10. RNase 무료 물 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에서에 RT 뇌관 1시 10분 희석. 단계의 5.9, 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 샘플에 희석된 RT 뇌관의 0.5 μ를 추가 하 고 간단히 원심.
11. 데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 샘플을 품 어 그리고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.
12. 첫 번째 가닥 버퍼, 12.5 m m dNTP 믹스의 0.5 μ, 100 m m dithiothreitol (DTT), RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 역전사의 0.5 μ의 0.5 μ x 5의 1 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 하 고 짧게 원심.
13. CDNA를 데워 열 cycler에서 1 h 50 ° C에서 샘플을 품 어.
14. 초순의 4.25 μ, PCR 혼합의 12.5 μ, 인덱스 뇌관의 1 μ 그리고 보편적인 뇌관의 1 μ는 cDNA에 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.
15. 열 cycler에서 샘플을 놓고는 자전거 타는 사람을 다음과 같이 설정: 98 ° C 30에 대 한 s; 10에 대 한 98 ° C의 15 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 15 72 ° C s; 그리고 마지막 10 분 동안 72 ° C를 가진 주기.
    참고: 준비 라이브러리 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 1 주일 동안.
16. 140 사이 젤 (젤 추출) DNA 젤에 라이브러리를 분리 하 여 RNA 라이브러리를 정화 혈압과 160 혈압과 젤 라이브러리 건설 키트에 의해 주어진 프로토콜을 다음에서 라이브러리를 방출.
    참고:이 연구 단계 5.15에서에서 준비 된 라이브러리에 로드 됩니다 상업 젤 (자료 테이블)와 140 사이 도서관 혈압과 160 bp를 밖으로 정화 하는 자동화 된 DNA 크기 fractionator (자료 테이블)에 따라 여는 제조 업체의 프로토콜입니다.
17. 집중 및 단계의 5.16 열 기반 PCR 정화 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 라이브러리를 세척 하 고 마침내 10 μ RNase 무료 물에 도서관을 elute.
18. 제조 업체의 프로토콜에 따라 라이브러리의 크기를 확인 하려면 DNA 칩 (자료 테이블)에 순화 된 라이브러리의 1 μ를 로드 합니다.
19. 10 m m pH 8.0에서에서 순화 된 라이브러리 (1:1000)의 1 μ 희석 Tris HCl 0.05% 폴 20와 정량 키트에 DNA 표준을 사용 하 여 라이브러리 농도 계량 하는 상용 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 여 라이브러리를 계량 하 고.
20. 수영장 높은 처리량 시퀀싱 시스템에 시퀀싱 컴퓨터와 시퀀스의 요구에 따라 라이브러리의 동일 금액
    참고: 세포질 RNA의 도서관 건축을 할 수 있습니다 키트의 표준 프로토콜에 따라 같은 키트를 사용 하 여.

6. 생물 정보학 파이프라인

참고: 이것은 내부 파이프라인 및 여기에 사용 되는 프로그램에 나와 있는 테이블의 자료.

1. 멀리 낮은 품질 읽기를 트림 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 합니다.
2. 깨끗 한 읽기 RNAs의 다른 종류에 매핑됩니다.
   1. 무 겁 게 수정된 tRNA 시퀀스 자주 기본 misincorporation 역전사에 의해 때문에 두 개의 불일치를 함으로써 tRNAs 주석을.
   2. 매핑 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 인간의 miRNAs에 의해 miRNAs 주석을. 이후 A는 miRNAs와 U nontemplated 3' 끝 추가, 매핑되지 않는 시퀀스는 3' 최대 3 A / T 국세청 후 읽기 매핑됩니다 인간의 miRNAs와 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 다른 miRNAs의 손질.
   3. 한 불일치를 함으로써 (snRNA, snoRNA, 피 르 나, 그리고 Y RNAs) 다른 관련 작은 RNAs를 주석을.
   4. 나머지 매핑되지 않은 읽기를 저하를 평가 하 긴 RNA 데이터 집합 (rRNA, Rfam, 및 mRNA에서 다른 RNA)에 매핑됩니다.
   5. 인간 게놈 시퀀스를 주석을.
   6. 주석을 세균성 게놈을 시퀀스.
   7. MiRNA 식 다음 수식을 사용 하 여 정규화: 미르 계산 / 모든 매핑된 miRNAs의 총 계산) x 10⁶.

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결과

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 다음 세대 시퀀싱 MSC 문화에서 exRNA 수집 최적화 됩니다. 워크플로의 전체 체계는 그림 1 에 왼쪽에 있으며 각각 품질 관리 검사점 오른쪽에.

컬렉션에 대 한의 날에 세포의 형태학 undifferentiated (그림 3A)와 (그림 3B) 분화 세포 ...

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토론

여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨^13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells	ATCC	PCS-500-012	Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS	Gibco	A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 Flask	Sarstedt	833,912
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline	Sigma	806552
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor used here
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma	D1530-1MG	Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits	Roche	KK4824	Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012	Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep	Sage Science		Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit	Cold Spring Harbor Lab		Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt			Adaptor removal in step 6
Bowtie			Mapping of clean reads in step 6
Samtools			To make the expression profile in step 6
Bedtools			To make the expression profile in step 6