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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

Abstract

Extracellulare e circolanti RNAs (exRNA) sono prodotti da molti tipi di cellule del corpo ed esiste in numerosi liquidi corporei come saliva, plasma, siero, latte e urine. Un sottoinsieme di questi RNA sono i regolatori di posttranscriptional – i microRNA (Mirna). Per delineare i miRNA provocati da tipi cellulari specifici, sistemi di coltura in vitro possono essere utilizzati per la raccolta e il profilo exRNAs derivato da un sottoinsieme delle cellule. I fattori secreti di cellule staminali mesenchimali sono implicati nell'alleviazione numerose malattie e viene utilizzato come sistema modello in vitro qui. Questo articolo descrive il processo di raccolta, purificazione di piccolo RNA e generazione della libreria di sequenza extracellulare Mirna. ExRNAs da cultura media differiscono da RNA cellulare essendo Bassi campioni di RNA inpui, che chiama per procedure ottimizzate. Questo protocollo fornisce una guida completa al sequenziamento di piccolo exRNA da terreni di coltura, mostrando i punti di controllo di controllo di qualità ad ogni passo durante il sequenziamento e la purificazione di exRNA.

Introduzione

Extracellulari e circolanti RNAs (exRNAs) sono presenti in vari liquidi corporei e sono resistenti verso RNasi1,2. Loro elevata abbondanza, la stabilità e la facilità di accessibilità sono attraenti per la valutazione clinica come marcatori diagnostici e prognostici3. La modalità di trasporto per exRNAs includere vescicole extracellulari (EVs), associazione con le lipoproteine (ad esempio di lipoproteina ad alta densità; HDL) e della ribonucleoproteina complessi (come con i complessi Argonaute2)4.

Un sottoinsieme di exRNAs sono i microRNA (Mirna), che sono piccoli RNA non codificanti di circa 22 nt che regolano l'espressione genica post-trascrizionale. Ex-miRNA sono stati implicati nella comunicazione cellula-cellula e regolazione di cella omeostasi5. Per esempio, HDL spedisce ex-miR-223 alle cellule endoteliali per reprimere la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e infiammazione6. È interessante notare che, miR-223 è visto anche trasportati dalle vescicole extracellulari dai leucociti alle cellule tumorali del polmone, programmazione ad assumere un fenotipo più invasiva7. Così, il trascrittoma di ex-Mirna da vari fluidi corporei e terreno di coltura cellulare migliorerà notevolmente la nostra comprensione della segnalazione ex-miRNA.

Piccolo RNA (piccolo RNA seq) di sequenziamento è un potente strumento che può essere utilizzato per comprendere la trascrittomica di piccoli RNA. Non solo diversi campioni possono essere confrontati tra RNAs conosciuto differenzialmente espressi, ma romanzo piccoli RNA possa anche essere rilevati e caratterizzato. Di conseguenza, è anche un metodo affidabile per identificare Mirna differenzialmente espressi in condizioni diverse. Tuttavia, uno degli ostacoli di piccoli RNA seq è la difficoltà nel generare piccole biblioteche di seq RNA da exRNA basso input fluidi come liquidi cerebrospinali, saliva, urina, latte, siero e terreni di coltura. Il protocollo di TruSeq piccolo RNA biblioteca Prep da Illumina richiede circa 1 µ g di RNA totale di alta qualità e il protocollo di NEBNext piccolo RNA biblioteca Prep Set da New England Biolabs richiede 100 ng-1 µ g di RNA8,9. Spesso, RNA totale da questi campioni sono sotto il limite di rilevamento per spettrofotometri UV-vis convenzionali.

Ex-miRNAs derivati da fluidi corporei sono potenzialmente buoni marcatori diagnostici e prognostici. Tuttavia, al fine di studiare gli effetti funzionali o per determinare l'origine del ex-miRNA specifici, sistemi di coltura cellulare, vengono spesso utilizzati. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono state studiate estesamente perché loro EVs sono stati implicati nell'alleviare molte malattie tra cui l'infarto miocardico, malattia di Alzheimer e dell'innesto contro la malattia ospite10. Qui, dimostriamo la purificazione di ex-Mirna da MSCs derivate da midollo osseo (BMSC) e i passaggi specifici utilizzati per ottimizzare la costruzione della libreria piccola RNA, sequenziamento e analisi dei dati (Figura 1).

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Protocollo

Nota: Terreno di coltura delle cellule staminali mesenchimali (media MSC) è preparato in anticipo, come indicato nella Tabella materiali.

1. coltura cellulare

Nota: Le cellule staminali mesenchimali umane possono essere ottenute da midollo osseo, tessuto adiposo o altre fonti11. In alternativa, hMSCs possono essere acquistati tramite un fornitore. BMSCs utilizzata nel presente protocollo sono state derivate dal midollo osseo dei pazienti e comprato da una società.

  1. Scongelare 1 x 106 BMSCs in un matraccio da T175 contenente 20 mL di media MSC. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e sostituire i media ogni 2-3 giorni fino al confluency di 80%.
  2. Lavare le cellule con 5 mL di 1X PBS e scartare il PBS.
  3. Staccare le cellule aggiungendo 5 mL di 0.05% tripsina-EDTA e incubando le cellule per 5 min a 37 ° C. Toccare i lati del pallone per facilitare il distacco.
  4. Aggiungere 15 mL di media MSC per inattivare la tripsina, staccare le cellule dalla superficie e pipetta su e giù per ottenere sospensioni di cellule singole.
  5. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 mL e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per agglomerare le cellule.
  6. Risospendere le cellule in 1 mL di media MSC e contare le celle utilizzando un emocitometro.
    Nota: Midollo osseo umano primario MSCs al confluency di 80% in un pallone di T175 è circa 2 x 106 cellule.
  7. Piastra hMSCs a 2.000 cellule/cm2 fresco media di MSC in 5 T175 boccette. Crescere le cellule a 37 ° C con 5% CO2 e sostituire i media ogni 2-3 giorni fino a quando si ottengono 5 boccette di 90% confluenti T175 boccette.

2. sve e biomolecole RNA-collegati insieme

Nota: Supporto di raccolta EV è preparato in anticipo (per volta Eagle di Dulbecco esente [DMEM] con 10% siero bovino fetale [FB] e 1% di penicillina/streptomicina [P/S]). EV raccolta media è normale media MSC, ma preparato con commerciale EV-vuotati FBS (Tabella materiali). Questo è per evitare la contaminazione di bovino exRNA da FBS, che normalmente contiene exRNAs associato di EVs, ribonucleoproteine e lipoproteine. Per la preparazione di libreria piccolo RNA, exRNAs derivato da 5 boccette confluenti di cellule staminali mesenchimali sono necessaria per consentire la costruzione della libreria.

  1. Lavare le cellule 3 x con 20 mL di PBS per T175 fiaschetta. Aggiungere 20 mL di media di raccolta di EV per confluenti T175 fiaschetta di MSCs e incubare a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h.
  2. Raccogliere i media e centrifugare i media per 10 minuti a 300 x g e 4 ° C.
  3. Raccogliere il surnatante e centrifugare i media per 20 min a 2.000 x g a 4 ° C.
  4. Raccogliere il surnatante e centrifugare i media per 30 min a 15.500 x g a 4 ° C. Poi raccogliere il surnatante.
  5. Trasferire i media ultracentrifuga provette e pellet exRNAs per 90 min a 100.000 x g e a 4 ° C. È qui utilizzato un rotore ad angolo fisso e il pellet è ancorato al lato del tubo. Contrassegnare il lato del coperchio e disegnare un cerchio sul lato del tubo in cui è previsto il pellet.
  6. Rimuovere il supernatante, asciugare l'interno del tubo capovolgendo la provetta su carta assorbente e usare piccoli pezzi di carta assorbente per togliere il liquido all'interno del tubo senza toccare il fondo del tubo. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS nel Vortex per 30 s e pipettaggio su e giù per 20 volte.
  7. Valutare l'EVs e biomolecole con nanoparticle tracking analysis (NTA) (Figura 2).
    Nota: Il server virtuale di Exchange e biomolecole possono essere valutati con nanoparticle tracking analysis (NTA), dispersione della luce dinamica (DLS) o trasmissione microscopia elettronica (TEM)12.
  8. Memorizzare le EVs e biomolecole a-80 ° C fino a ulteriori esperimenti a valle.
    Nota: Se SVE stanno per essere utilizzati per studi funzionali, glicerolo 20% deve essere aggiunto per proteggerli dalla rottura. Le cellule possono essere raccolti utilizzando le procedure standard, se necessario.

3. sve e collezione di biomolecole RNA-collegato di cellule differenziate

Nota: EVs e RNA associati biomolecole possono anche essere raccolti dai terreni di coltura delle cellule mentre le cellule subiscono differenziazione. Nell'esempio raffigurato nel protocollo descrive differenziazione osteoblastica ed exRNA insieme ai giorni 0 e 7 di differenziazione. Se nessuna differenziazione è necessaria, quindi saltare la sezione 3 e vai alla sezione 4.

  1. Preparare il supporto di differenziamento osteoblastico (DMEM con 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerofosfato, 10 nM desametasone, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10 mM 1,25-vitamina D3) fresco ogni volta.
  2. Una volta che MSCs sono 80% confluenti, cambiare il supporto MSC ai media di differenziamento osteoblastico.
  3. Reintegrare i media di differenziamento osteoblastico dopo 2-3 giorni.
  4. Il giorno 5 di differenziazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con 20 mL di PBS per T175 fiaschetta.
  5. Aggiungere 20 mL di EV media raccolta contenente β-glicerofosfato di 10 mM, 10 nM desametasone, 50 μM ascorbato-2-fosfato e 10 mM 1,25-vitamina D3 per confluenti T175 fiaschetta di MSCs. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2 per 48 h garantire continuate differenziazione, pur raccogliendo le EVs e biomolecole.
  6. Raccogliere i media il giorno 7 e procedere per isolare l'EVs e biomolecole come descritto ai punti 2.2-2.6.
  7. Per il controllo qualità, seme cellule a 96 pozzetti o 6-pozzetti per valutare la differenziazione usando un'analisi di attività della fosfatasi alcalina (ALP), o con reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), rispettivamente.
    Nota: Nella figura 3 è un esempio che mostra la differenziazione osteogenica delle cellule.

4. RNA estrazione e controllo di qualità

  1. Scongelare i campioni dal passaggio 2.8 sul ghiaccio. Estrarre RNA usando un kit di isolamento del RNA (Tabella materiali).
  2. Eluire il RNA dalla colonna fornito nel kit di isolamento di RNA (Tabella materiali) in 100 μL di acqua RNAsi-libera.
  3. Concentrare il RNA attraverso precipitazione dell'etanolo aggiungendo 1 μL di glicogeno, 10 μL 2 M pH 5,5 dell'acetato del sodio e 250 µ l di etanolo al 99% pre-refrigerati in 100 μL di RNA purificato.
  4. Incubare i campioni a-20 ° C durante la notte a precipitare il RNA. Pellet di RNA mediante centrifugazione per 20 min a 16.000 x g e a 4 ° C.
    Nota: Il pellet è bianco dovuto co-precipitazione con glicogeno.
  5. Eliminare il surnatante e lavare la pallina del RNA con 1 mL di etanolo al 75%. Pellet al RNA ancora per 5 min a 16.000 x g e a 4 ° C.
  6. Rimuovere l'etanolo e lasciare il coperchio del tubo RNA aperta per 5-10 minuti all'aria asciutta la pallina del RNA. Risospendere il pellet di RNA in 7 μL di acqua RNAsi-libera.
  7. Controllare la qualità di RNA e la concentrazione utilizzando una macchina basata su chip elettroforesi capillare per rilevare il RNA secondo il protocollo del produttore prima della costruzione della libreria.
    Nota: Una distribuzione delle dimensioni rappresentative del RNA è illustrata nella Figura 4.
  8. Estrarre RNA cellulare utilizzando un kit di purificazione commerciale (Tabella materiali) se necessario.

5. libreria costruzione e controllo qualità

Nota: Le librerie Small RNA vengono costruite utilizzando kit commerciali (Tabella materiali) con regolazioni dovuto il RNA basso ingresso. La costruzione della libreria viene eseguita sul blocco refrigerato.

  1. Chill blocco riscaldante per provette per PCR 0,2 mL sul ghiaccio e aggiungere 5 μL del RNA dal passo 4.6 in provette per PCR 0,2 mL RNAsi-libera su un blocco di refrigerati.
  2. Diluire 3' adattatori (01:10) in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 μL di adattatore diluito e mescolare con 5 μL di RNA pipettando su e giù 8 x e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo.
  3. Incubare il mix di adattatore RNA e 3' a 70 ° C per 2 min in un termociclatore preriscaldato e quindi posizionare il campione indietro sul blocco refrigerato.
  4. Aggiungere 1 μL di tampone di legatura, 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 0,5 μL della ligasi T4 RNA (mutante di delezione) nell'impasto adattatore RNA e 3'. Mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare.
  5. Incubare la provetta a 28 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato.
  6. Aggiungere 0,5 μL di soluzione di arresto nel tubo del campione con il tubo di soggiornare nel termociclatore, Miscelare pipettando su e giù x 8 e continuare a mantenere in incubazione a 28 ° C per 15 min.
  7. Diluire 5' adattatori (01:10) in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 μL di 5' adattatore in una separato RNAsi-libera 0,2 mL provetta PCR, calore l'adattatore 5' a 70 ° C per 2 min in termociclatore preriscaldato e poi posizionare il campione sul blocco refrigerato.
  8. Aggiungere 0,5 μL di 10 nM ATP, 0,5 μL della ligasi T4 RNA al tubo adattatore 5', mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare per raccogliere tutti i liquidi nella parte inferiore.
    Nota: Tenere l'adattatore 5' sul blocco refrigerato per quanto possibile.
  9. Aggiungere 1,5 µ l della miscela adattatore 5' al campione dal punto 5.6 e mescolare molto delicatamente di pipettaggio 8x lentamente. Incubare il campione a 28 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato.
  10. Diluire RT primer 01:10 in acqua RNAsi-libera in un tubo PCR 0,2 mL RNAsi-libera. Aggiungere 0,5 µ l di primer RT diluito nel campione dal passaggio 5.9, mix molto dolcemente pipettando su e giù 8x lentamente e centrifugare.
  11. Incubare il campione a 70 ° C per 2 min in termociclatore preriscaldato e quindi il campione viene posto su un blocco di refrigerati.
  12. Aggiungere 1 μL di 5 x primo strand buffer, 0,5 μL di miscela del dNTP 12,5 mM, 0,5 μL di 100 mM dithiothreitol (DTT), 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 0,5 μL della trascrittasi inversa. Mescolare molto delicatamente pipettando su e giù 8x lentamente e centrifugare.
  13. Incubare il campione a 50 ° C per 1 h in termociclatore preriscaldato per ottenere cDNA.
  14. Aggiungere 4.25 μL di acqua ultrapura, 12,5 μL di miscela di PCR, 1 μL di primer indice e 1 µ l di primer universali nel cDNA. Mescolare pipettando su e giù 8x e centrifugare.
  15. Il campione viene posto in un termociclatore e impostare come segue il ciclatore: 98 ° C per 30 s; 15 cicli di 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 15 s; e alla fine il ciclo con 72 ° C per 10 min.
    Nota: La libreria preparata possa essere memorizzata a-20 ° C per una settimana.
  16. Purificare la libreria di RNA che separa la libreria su un gel di DNA e tagliando il gel (gel di estrazione) tra 140 bp e 160 bp e medicati la libreria dal gel seguendo il protocollo dato da libreria costruzione kit.
    Nota: In questo studio, la libreria preparata dal passaggio 5.15 viene caricata su un gel commerciale (Tabella materiali) e la libreria tra 140 bp e 160 bp è purificata fuori da un frazionatore automatizzato di dimensione del DNA (Tabella materiali) secondo la protocollo del produttore.
  17. Concentrarsi e lavare la libreria dal passaggio 5.16 utilizzando un kit di purificazione di PCR basata su colonne (Tabella materiali) ed eluire la libreria in acqua RNAsi-libera di 10 μL infine.
  18. Caricare 1 μL della biblioteca purificata su un chip di DNA (Tabella materiali) per verificare le dimensioni della libreria seguendo il protocollo del produttore.
  19. Diluire 1 μL della biblioteca purificata (1: 1000) di 10 mM a pH 8.0 Tris-HCl con 0.05% polisorbato 20 e quantificare la libreria di qPCR utilizzando un kit di quantificazione di libreria commerciale per quantificare la concentrazione di libreria utilizzando gli standard di DNA nel kit.
  20. Quantità uguali di piscina delle librerie secondo i requisiti del computer di sequenziazione e sequenza su un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni.
    Nota: La costruzione della libreria del RNA cellulare può essere fatto utilizzando gli stessi Kit seguendo il protocollo standard dei kit.

6. bioinformatica pipeline

Nota: Si tratta di una pipeline in-House e i programmi usati qui sono elencati nella tabella materiali.

  1. Tagliare via bassa qualità letture e rimuovere adattatore sequenze dal crude letture.
  2. Mappa la legge pulita ai generi differenti di RNA.
    1. Annotare i tRNAs consentendo due mancate corrispondenze perché le sequenze di tRNA fortemente modificati causano frequenti misincorporation del base dal transcriptase d'inversione.
    2. Annotare i miRNA mediante il mapping di miRNA umani da miRBase v21 permettendo zero mismatch. Dal momento che i miRNA sono soggetti A divieto e U nontemplated 3' fine aggiunte, sequenze che non eseguono il mapping sono 3' assettato di nts fino a tre A e/o T, dopo di che letture vengono mappate a miRNA umani e altri miRNA da miRBase v21 permettendo zero mismatch.
    3. Annotare per altri pertinenti piccoli RNA (snRNA, snoRNA, piRNA e Y RNAs) consentendo una mancata corrispondenza.
    4. Mappa il restante letture non mappate ai lunghi RNA DataSet (rRNA, altri RNA da Rfam e mRNA) per valutare la degradazione.
    5. Annotare le sequenze di genoma umano.
    6. Annotare le sequenze di genomi batterici.
    7. Normalizzare l'espressione dei miRNA utilizzando la seguente formula: miRNA conta / totale conta di tutti i miRNA mappati) x 106.

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Risultati

Il metodo descritto in questo protocollo è ottimizzato per raccogliere exRNA da cultura MSC per il sequenziamento di nuova generazione. Lo schema generale del flusso di lavoro è nella Figura 1 a sinistra e i checkpoint di rispettivo controllo di qualità sono sulla destra.

La morfologia delle cellule il giorno della raccolta per indifferenziato (Figura 3A) e differenz...

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Discussione

Qui, descriviamo un protocollo per il sequenziamento di nuova generazione di exRNAs che consente l'analisi di espressione differenziale da campioni di ingresso Bassi. Aderendo a un protocollo specifico per l'isolamento di EV ed exRNA è importante perché anche piccole alterazioni (cioè, il passo di ultracentrifugazione o un cambiamento nel tipo di rotore) possono influenzare il trascrittoma e miRNA livelli13,14. Così, indipendentemente da come il exRNA è isol...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Siamo grati al signor Claus Bus e Sig. ra Rita Rosendahl a iNANO per loro assistenza tecnica. Si ringrazia Dr. Daniel Otzen per permettere che il nostro uso frequente della sua ultracentrifuga. Questo studio è stato sostenuto dal fondo per l'innovazione Danimarca (progetto MUSTER).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem CellsATCCPCS-500-012Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBSGibcoA2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTAGibco25200056
T175 FlaskSarstedt833,912
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffered SalineSigma806552
UltracentrifugeBeckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor used here
NucleoCounterChemometecNC-3000Cell Counter
β-glycerophosphateCalbiochem35675Components of the osteogenic differentiation media
DexamethasoneSigmaD4902-25MGComponents of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10GComponents of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3SigmaD1530-1MGComponents of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAChip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification KitsRocheKK4824Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin PrepSage ScienceAutomated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR purification in step 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabTrimming low-quality reads in step 6
cutadaptAdaptor removal in step 6
BowtieMapping of clean reads in step 6
SamtoolsTo make the expression profile in step 6
BedtoolsTo make the expression profile in step 6

Riferimenti

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