Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.

Zusammenfassung

Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNA) werden von vielen Zelltypen des Körpers produziert und gibt es in zahlreichen Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Milch, Plasma und Serum. Eine Teilmenge von diesen RNAs sind die posttranskritionelle Regler – Micro-RNAs (MiRNAs). Um die MiRNAs, die von bestimmten Zelltypen produziert abzugrenzen, in-vitro-Kultur-Systeme können verwendet werden, um zu ernten und Profil ExRNAs aus einer Teilmenge von Zellen. Die sezernierten Faktoren von mesenchymalen Stammzellen sind involviert in zahlreichen Krankheiten zu lindern und dient als die in-vitro-Modell-System hier. Dieser Artikel beschreibt den Prozess der Sammlung, Reinigung von kleinen RNA und Bibliothek-Generation, die Sequenz extrazelluläre MiRNAs. ExRNAs von Nährmedien unterscheiden sich von zellulären RNA durch die niedrigen RNA Eingabesamples, dem optimierten Verfahren gefordert. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Anleitung zum kleinen ExRNA Sequenzierung von Nährmedien, zeigt Qualitätskontrolle Prüfpunkte bei jedem Schritt während ExRNA Reinigung und Sequenzierung.

Einleitung

Extrazelluläre und zirkulierenden RNAs (ExRNAs) sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden und sind resistent gegen RNases^1,2. Ihre hohe Fülle, Stabilität und einfache Zugänglichkeit sind attraktiv für klinische Bewertung als diagnostische und prognostische Marker³. Das Transportmittel für ExRNAs umfassen extrazelluläre Vesikel (EVs), Verband mit Lipoproteine (z. B. High-density-Lipoprotein; HDL) und Ribonucleoprotein komplexe (z. B. mit Argonaute2-komplexe)⁴.

Eine Teilmenge der ExRNAs sind Micro-RNAs (MiRNAs), die kleine nicht-kodierende RNAs von etwa 22 nt, die posttranskritionelle Genexpression regulieren. Ex-MiRNAs haben in Zell-Zell-Kommunikation und Regelung der Zelle Homöostase⁵verwickelt. Zum Beispiel liefert HDL Ex-MiR-223 an Endothelzellen interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) zu unterdrücken und Entzündungen⁶. Interessanterweise wird MiR-223 auch transportiert durch extrazelluläre Vesikel von Leukozyten an Lungenkrebszellen, programmieren sie sich auf eine weitere invasive Phänotyp⁷gesehen. So wird das Transkriptom des Ex-MiRNAs aus verschiedenen Körperflüssigkeiten und Zellkulturmedium stark unser Verständnis von Ex-MiRNA-Signalisierung verbessern.

Kleine RNA Sequenzierung (kleine RNA Seq) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, zu verstehen, das Transkriptom des kleinen RNAs. Nicht nur verschiedene Proben unter differentiell exprimierten bekannten RNAs verglichen werden können, sondern neuartige kleinen RNAs auch erkannt und gekennzeichnet werden können. Infolgedessen ist es auch eine robuste Methode, differentiell exprimierten MiRNAs unter verschiedenen Bedingungen zu identifizieren. Eine der Hürden von kleinen RNA Seq ist jedoch die Schwierigkeiten bei der Erzeugung von kleinen RNA-Seq-Bibliotheken aus niedrigen ExRNA Eingabe Flüssigkeiten wie Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Speichel, Urin, Milch, Serum und Nährmedien. Das TruSeq kleine RNA-Bibliothek-Prep-Protokoll von Illumina erfordert ca. 1 µg hochwertige Gesamt-RNS und das NEBNext kleine RNA Bibliothek Prep Set Protokoll von New England Biolabs 100 ng-1 µg RNA^8,9. Oft sind total RNA aus diesen Proben unter Nachweisgrenze für konventionelle UV-Vis Spektralphotometer.

Ex-MiRNAs abgeleitet von Körperflüssigkeiten sind potenziell gute prognostische und diagnostische Marker. Jedoch sind um die funktionellen Auswirkungen zu studieren oder zur Bestimmung des Ursprungs von bestimmten Ex-MiRNAs Zellkultursysteme oft stattdessen verwendet. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben ausgiebig untersucht, weil ihre EVs bei der Linderung vieler Krankheiten wie Herzinfarkt, Alzheimer-Krankheit und Graft-Versus-Host-Krankheit¹⁰verwickelt waren. Hier zeigen wir die Reinigung des Ex-MiRNAs aus dem Knochenmark stammenden MSCs (BMSCs) und die entsprechenden Schritte zur Optimierung der kleinen RNA Bibliotheksbau, Sequenzierung und Analyse der Daten (Abbildung 1) verwendet.

Protokoll

Hinweis: Wachstumsmedium mesenchymalen Stammzellen (MSC Media) ist im Voraus, wie in der Tabelle von Materialienbereit.

(1) Zellkultur

Hinweis: Humaner mesenchymaler Stammzellen im Knochenmark, Fettgewebe oder anderen Quellen¹¹entnehmen. Alternativ können hMSCs durch einen Lieferanten gekauft werden. Die in diesem Protokoll verwendeten BMSCs wurden abgeleitet aus dem Knochenmark des Patienten und von einer Firma gekauft.

1. Tauen Sie 1 x 10⁶ BMSCs in einer T175-Flasche mit 20 mL MSC Medien auf. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO₂ Zellen und ersetzen Sie die Medien alle 2-3 Tage bis 80 % Konfluenz.
2. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 1 X PBS und entsorgen Sie die PBS.
3. Lösen die Zellen durch Zugabe von 5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und Inkubation der Zellen für 5 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf den Seiten des Kolbens Loslösung zu erleichtern.
4. Hinzugeben Sie 15 mL MSC Medien zu inaktivieren die Trypsin, lösen die Zellen von der Oberfläche und Pipette rauf und runter zu einzelnen Zellsuspensionen.
5. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 mL-Tube und Spin-down für 5 min bei 300 X g zu die Zellen zu Pellets.
6. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der MSC Medien und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
   Hinweis: Primäre menschlichen Knochenmark MSCs auf 80 % Konfluenz in einem T175 Kolben ist ca. 2 x 10⁶ Zellen.
7. Platte hMSCs bei 2.000 Zellen/cm² frische MSC Medien in 5 T175 Fläschchen. Wachsen Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO₂ und ersetzen Sie die Medien alle 2-3 Tage, bis 5 Flaschen von 90 % konfluierende T175 Flaschen gewonnen werden.

(2) EVs und RNA-assoziierten Biomoleküle Sammlung

Hinweis: EV Sammlung Medien vorbereitet wurde (Dulbeccos geändert Eagle Medium [DMEM] mit fötalen Rinderserum [FBS] 10 % und 1 % Penicillin/Streptomycin [P/S]). EV Sammlung Medien ist normal MSC Medien, sondern mit kommerziellen EV-abgereicherte FBS (Table of Materials) vorbereitet. Dies ist zur Vermeidung von Kontaminationen der bovinen ExRNA von FBS, enthält normalerweise ExRNAs EFD, Ribonucleoproteins und Lipoproteine zugeordnet. Für kleine RNA-Bibliothek-Vorbereitung müssen ExRNAs, abgeleitet aus 5 konfluierende Kolben von MSCs Bibliotheksbau ermöglichen.

1. Waschen Sie die Zellen 3 X mit 20 mL PBS pro T175 Kolben. 20 mL EV Sammlung Medien pro konfluierende T175 Flasche mit MSCs und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 48 h.
2. Sammeln Sie die Medien und Zentrifugieren Sie die Medien für 10 min bei 300 X g und 4 ° C.
3. Sammeln Sie den Überstand zu und Zentrifugieren Sie die Medien für 20 min bei 2.000 X g und 4 ° C.
4. Sammeln Sie den Überstand zu und Zentrifugieren Sie die Medien für 30 min bei 15.500 X g und 4 ° C. Dann sammeln Sie die überstand.
5. Übertragen Sie die Medien auf Ultrazentrifugen Röhren und pellet-ExRNAs 90 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° C. Ein festen Winkel Rotor dient hier und das Pellet auf die Seite der Röhre verankert ist. Markieren Sie die Seite des Deckels und zeichnen Sie einen Kreis auf der Seite der Röhre wo das Pellet erwartet wird.
6. Entfernen Sie den Überstand zu, trocknen Sie das Innere des Rohres durch das Rohr auf saugfähigem Papier umdrehen und verwenden Sie kleine Stücke von saugfähigem Papier, um die Flüssigkeit im Inneren des Rohres zu entfernen, ohne Sie zu berühren den Boden des Röhrchens. Aufschwemmen das Pellet in 200 μl PBS durch Vortexen für 30 s und nach oben und unten 20 X pipettieren.
7. Bewertung der EVs und Biomoleküle mit Nanopartikel tracking-Analyse (NTA) (Abbildung 2).
   Hinweis: Die EVs und Biomoleküle kann mit Nanopartikel tracking-Analyse (NTA), dynamische Lichtstreuung (DLS) oder Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM)¹²bewertet werden.
8. Speichern Sie die EVs und Biomoleküle bei-80 ° C bis weiter stromabwärts Experimente.
   Hinweis: Wenn EVs für funktionelle Studien verwendet werden sollen, muss zum Schutz vor bersten 20 % Glycerin hinzugefügt werden. Die Zellen können mit standard-Verfahren bei Bedarf gesammelt werden.

(3) EVs und RNA-assoziierten Biomoleküle Sammlung von differenzierten Zellen

Hinweis: EVs und RNA verbundenen Biomoleküle können auch von den Zellkulturmedien gesammelt werden, während die Zellen Differenzierung durchlaufen. Das Beispiel dargestellt im Protokoll beschreibt osteoblastischen Differenzierung und ExRNA Abholung am Tag 0 und 7 der Differenzierung. Wenn keine Differenzierung erforderlich ist, dann überspringen Sie Abschnitt 3 und fahren Sie mit Abschnitt 4.

1. Bereiten Sie osteoblastischen Differenzierung Medien (DMEM mit 10 % FBS, 1 % P/S, 10 mM β-Glycerophosphat, 10 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-Phosphat und 10 mM 1,25-Vitamin-D3) frisch jedes Mal.
2. Einmal MSCs sind 80 % Zusammenfluss, der MSC-Medien zu osteoblastischen Differenzierung Medien.
3. Ergänzen Sie die osteoblastischen Differenzierung Medien nach 2-3 Tagen.
4. Am 5. Tag der Differenzierung, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 3 X mit 20 mL PBS pro T175 Kolben.
5. Fügen Sie 20 mL EV Kollektion Medium mit 10 mM β-Glycerophosphat, 10 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbat-2-Phosphat und 10 mM 1,25-Vitamin-D-₃ pro konfluierende T175 Flasche mit MSCs. Incubate die Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 48 h zu gewährleisten setzte Differenzierung bei der Erhebung der EVs und Biomoleküle.
6. Sammeln Sie die Medien am 7. Tag und fahren Sie mit der EVs und Biomoleküle wie 2.2-2.6 beschrieben zu isolieren.
7. Samen Sie für die Qualitätskontrolle Zellen in 96-Brunnen oder 6-Brunnen Differenzierung mit einer alkalischen Phosphatase (ALP) Aktivität Assay bewerten oder mit quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), beziehungsweise.
   Hinweis: Abbildung 3 ist ein Beispiel zeigt osteogene Differenzierung der Zellen.

(4) RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle

1. Proben aus Schritt 2,8 auf Eis auftauen. Extrahieren Sie RNA mittels einer RNA Isolierungskit (Table of Materials).
2. Eluieren der RNS aus der Spalte mitgelieferten RNA Isolierung (Table of Materials) in 100 μl RNase-freies Wasser.
3. Die RNA durch Ethanol Niederschlag durch Zugabe von 1 μl von Glykogen, 10 μL der 2 M pH 5,5 Natriumacetat und 250 μL vorgekühlt 99 % Ethanol in 100 μL gereinigtes RNA zu konzentrieren.
4. Inkubieren Sie die Proben bei-20 ° C über Nacht, die RNA auszufällen. Pellet-RNA durch Zentrifugieren für 20 min bei 16.000 x g und 4 ° C.
   Hinweis: Die Kugel ist weiß aufgrund Co Niederschlag mit Glykogen.
5. Den Überstand zu entfernen und Waschen der RNA-Pellet mit 1 mL von 75 % Ethanol. Pellet-RNA wieder für 5 min bei 16.000 x g und 4 ° C.
6. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie den Deckel der RNA-Röhre offen für 5-10 min an der Luft trocken das RNA-Pellet. Die RNA-Pellet in 7 μl RNase-freies Wasser Aufschwemmen.
7. Überprüfen Sie die RNS-Qualität und Konzentration mit einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Maschine, um die RNA laut Protokoll des Herstellers vor Bibliotheksbau zu erkennen.
   Hinweis: Eine repräsentative Größenverteilung der RNA ist in Abbildung 4gezeigt.
8. Zelluläre RNA mit einem kommerziellen Reinigung-Kit (Table of Materials), ggf. zu extrahieren.

5. Bibliotheksbau und Qualitätskontrolle

Hinweis: Kleine RNA-Bibliotheken werden mit kommerziellen Kits (Table of Materials) mit Anpassungen aufgrund der niedrigen RNA Eingang gebaut. Bibliotheksbau erfolgt auf dem gekühlten Block.

1. Chill-Heizblock für 0,2 mL PCR Tubes auf Eis und pipette 5 μL der RNA aus Schritt 4.6 in 0,2 mL RNase-freie PCR Tubes auf einem gekühlten Block.
2. Verdünnen Sie 3' Adapter (01:10) in RNase-freies Wasser in einem 0,2 mL RNase-freie PCR-Röhrchen. 0,5 μL verdünnt Adapter und mischen mit 5 μl RNA durch Pipettieren nach oben und unten 8 X und Zentrifuge kurz, die Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln.
3. Brüten Sie die RNA und 3' Adapter-Mischung bei 70 ° C für 2 min in einem vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe wieder auf den gekühlten Block.
4. 1 μl der Ligatur Puffer, 0,5 μl RNase-Inhibitor und 0,5 μl T4 RNA Ligase (Löschung Mutant) in die RNA-3'-Adapter-Mischung hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
5. Inkubieren Sie das Rohr auf 28 ° C für 1 h in den vorgeheizten Thermocycler.
6. Fügen Sie 0,5 μl Stopplösung in das Probenröhrchen mit dem Rohr der Aufenthalt in den Thermocycler, mischen, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und weiterhin bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
7. Verdünnen Sie 5' Adapter (01:10) in RNase-freies Wasser in einem 0,2 mL RNase-freie PCR-Röhrchen. Fügen Sie 0,5 μL der 5'-Adapter in einem separaten RNase-freie 0,2 mL PCR Rohr, Hitze der 5'-Adapter bei 70 ° C für 2 min in den vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe auf dem gekühlten Block.
8. Fügen Sie 0,5 μL von 10 nM ATP, 0,5 μl T4 RNA Ligase, das 5'-Adapterrohr hinzu, mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz um die Flüssigkeiten in den Boden zu sammeln.
   Notiz: Behalten Sie die 5'-Adapter gekühlte Block so weit wie möglich.
9. Die Probe aus Schritt 5.6 1,5 μL der 5'-Adapter Mischung hinzu, und mischen Sie sehr leicht durch Pipettieren 8 X langsam. Inkubation der Probe bei 28 ° C für 1 Stunde in den vorgeheizten Thermocycler.
10. Verdünnen Sie RT Primer 01:10 in RNase-freies Wasser in eine RNase-freie 0,2 mL PCR-Röhrchen. 0,5 μL verdünnt RT Grundierung in die Probe aus Schritt 5.9, Mischung sehr sanft durch Pipettieren langsam nach oben und unten 8 X hinzufügen und kurz zentrifugieren.
11. Inkubation der Probe bei 70 ° C für 2 min in den vorgeheizten Thermocycler und legen Sie die Probe auf einem gekühlten Block.
12. Hinzufügen von 5 x ersten Strang Puffer, 0,5 μL 12,5 mM dNTP-Mix, 0,5 μL von 100 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 μl RNase-Inhibitor und 0,5 μl Reverse Transkriptase 1 μl. Mischen Sie sehr vorsichtig, indem Sie langsam nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
13. Inkubation der Probe bei 50 ° C für 1 h in den vorgeheizten Thermocycler cDNA zu erhalten.
14. Fügen Sie 4,25 μL von Reinstwasser, 12,5 μl des PCR-Mixes, 1 μL Index Grundierung und 1 μl universelle Grundierung in die cDNA. Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten 8 X pipettieren und Zentrifugieren Sie kurz.
15. Legen Sie die Probe in einem Thermocycler und der Cycler wie folgt einrichten: 98 ° C für 30 s; 15 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 15 s; und am Ende des Zyklus mit 72 ° C für 10 Minuten.
    Hinweis: Die vorbereitete Bibliothek kann bei-20 ° C eine Woche aufbewahrt werden.
16. Reinigen die RNA-Bibliothek durch die Trennung der Bibliothek auf einem DNA-Gel und schneiden das Gel (Gel Extraction) zwischen 140 bp und 160 bp und eluierenden der Bibliothek aus dem Gel nach dem Protokoll von der Bibliothek-Baukasten gegeben.
    Hinweis: In dieser Studie die vorbereitete Schritt 5.15-Bibliothek wird geladen auf einem kommerziellen Gel (Table of Materials) und die Bibliothek zwischen 140 bp und 160 bp wird gereinigt, durch eine automatisierte DNA Größe Plasmafraktionierer (Table of Materials) nach der Protokoll des Herstellers.
17. Konzentrieren und Waschen der Bibliothek aus Schritt 5.16 mit einem spaltenbasierten PCR-Reinigung-Kit (Table of Materials) und die Bibliothek in 10 μl RNase-freies Wasser schließlich eluieren.
18. 1 μl der gereinigten Bibliothek auf einem DNA-Chip (Table of Materials) überprüfen Sie die Größe der Bibliothek nach Protokoll des Herstellers zu laden.
19. Verdünnen Sie 1 μL der gereinigten Bibliothek (1: 1000) in 10 mM pH 8.0 Tris-HCl mit 0,05 % Polysorbat 20 und quantifizieren die Bibliothek von qPCR mit einem kommerziellen Bibliothek Quantifizierung Kit, um die Bibliothek-Konzentration mit Hilfe der DNA-Standards im Kit zu quantifizieren.
20. Pool gleiche Mengen der Bibliotheken entsprechend den Anforderungen der Sequenzierung Maschine und Sequenz auf einem Hochdurchsatz-Sequenzierung System.
    Hinweis: Der Bibliotheksbau zelluläre RNA kann erfolgen unter Verwendung der gleichen Kits durch Anschluss an standard-Protokoll der Kits.

(6) Bioinformatik-pipeline

Hinweis: Dies ist eine interne Pipeline und die hier verwendeten Programme finden Sie in der Tabelle Materialien.

1. Trim entfernt minderwertige liest und Adapter Sequenzen aus dem rohen lautet entfernen.
2. Verschiedene Arten von RNAs sauber liest zuordnen.
   1. Kommentieren Sie tRNAs dadurch, dass zwei Unterschiede, weil die stark modifizierte tRNA-Sequenzen durch Reverse Transkriptase häufigen Basis Misincorporation verursachen.
   2. Kommentieren Sie MiRNAs durch Zuordnung zu menschlichen MiRNAs aus MiRBase v21 erlaubt Null Fehlanpassungen. Da MiRNAs unterliegen A und U Nontemplated 3' Ende Ergänzungen, Sequenzen, die nicht zugeordnet werden sind 3' getrimmt von bis zu drei A und/oder T Nts wonach liest menschlichen MiRNAs und andere MiRNAs aus MiRBase v21 erlaubt Null Fehlanpassungen zugeordnet sind.
   3. Anmerkungen Sie zu anderen relevanten kleinen RNAs (SnRNA, SnoRNA, PiRNA und Y RNAs) dadurch, dass ein Missverhältnis.
   4. Ordnen Sie die verbleibenden nicht zugeordnete liest lange Datasets in RNA (rRNA, andere RNA aus Rfam und mRNA) um Abbau zu beurteilen.
   5. Beschriften Sie die Sequenzen des menschlichen Genoms.
   6. Beschriften Sie die Sequenzen mit bakteriellen Genomen.
   7. MiRNA Ausdruck mithilfe der folgenden Formel zu normalisieren: MiRNA zählt / zählt die Summe von allen zugeordneten MiRNAs) X 10⁶.

Ergebnisse

In diesem Protokoll beschriebene Methode ist optimiert, um ExRNA von MSC-Kultur für die Sequenzierung der nächsten Generation zu sammeln. Die allgemeine Systematik des Workflows ist in Abbildung 1 auf der linken Seite und die jeweiligen Qualitätskontrolle Checkpoints sind auf der rechten Seite.

Die Morphologie der Zellen am Tag der Sammlung für undifferenziert (Abbildung 3A<...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation von ExRNAs, die differentielle Expressionsanalysen aus niedrigen Eingabesamples ermöglicht. Die Einhaltung eines bestimmten Protokolls für EV und ExRNA Isolation ist wichtig, weil auch kleine Änderungen (z.B. der Ultrazentrifugation Schritt oder eine Änderung im Rotor Typ) auf das Transkriptom Einfluss können und MiRNA^{13,14 Ebenen}. Also, unabhängig davon, wie die ExRNA isolie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells	ATCC	PCS-500-012	Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001	Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS	Gibco	A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 Flask	Sarstedt	833,912
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline	Sigma	806552
Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor used here
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma	49752-10G	Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3	Sigma	D1530-1MG	Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits	Roche	KK4824	Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012	Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep	Sage Science		Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit	Cold Spring Harbor Lab		Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt			Adaptor removal in step 6
Bowtie			Mapping of clean reads in step 6
Samtools			To make the expression profile in step 6
Bedtools			To make the expression profile in step 6