استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Summary

قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).

Abstract

كوانتيتاتينج تفاعل الجزيئات الصغيرة مع الهدف المقصود من البروتين أمر بالغ الأهمية لتطوير العقاقير والتحقق من صحة الهدف والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. أساليب قياس هذه الظاهرة دون تعديل الهدف بروتين أو جزيء صغير قيمة خاصة ولو من الناحية التقنية الصعبة. المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) أسلوب واحد لرصد المشاركة المستهدفة في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا تعديلاً للبروتوكول سيتسا الأصلي، والذي يسمح لقياسات عالية الإنتاجية مع احتفاظها بالتعريب سوبسيلولار على مستوى الخلية الواحدة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر تقدما هاما لتطبيق سيتسا لتوصيف متعمقة للتفاعل المجمع المستهدف، لا سيما في السكان غير متجانسة من الخلايا.

Introduction

عند تطوير عقاقير جديدة أو المجسات الكيميائية من الضروري للزوجين التأثير الدوائي الملاحظ أو قراءات وظيفية للقياسات لشغل المستهدفة أو المشاركة في الخلايا الحية^1،،من²³. هذه البيانات ضرورية للتأكد من أن الجزيئات الصغيرة في الواقع تصل إلى هدفها المنشود، وكذلك للتحقق من صحة الفرضية البيولوجية وراء البروتين المستهدف التحديد^4،5. وعلاوة على ذلك، وأثناء تطوير الأدوية، تستخدم نظم نموذجية للتعقيد المتزايد تحديد وتأكيد رائد مركبة قبل التجارب السريرية. لتأكيد الترجمة البيولوجيا عبر هذه النظم الإكلينيكية، أساليب لاقتفاء أثر المخدرات-هدف المشاركة والمصاحبة لعلم الأحياء في جميع مراحل عملية التنمية هذه الحاسمة.

مشاركة المخدرات المستهدفة تقليديا تحديا لرصد في الخلايا الحية مع جزيئات صغيرة أونفونكتيوناليزيد والبروتينات، وبخاصة على مستوى خلية واحدة مع القرار المكانية^6،7. أسلوب واحد مؤخرا لمراقبة التفاعل بين معدلة العقاقير والبروتينات في الخلايا الحية هي المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) الذي هو استقرار البروتين الأصلي في الاستجابة لتحدي حرارة المستحثة يجند كمياً^{8، 9،10}. يتم ذلك عن طريق تحديد كمية البروتين للذوبان المتبقية بعد التعرض لحرارة تحد. في الكشف عن أولى سيتسا، استخدمت لطخة غربية للكشف. لتمكين حملات الفحص وضرب فرز مجموعات أكبر مجمع، الجهود المبذولة لزيادة إنتاجية تجارب سيتسا قد تؤدي إلى تطوير عدة فحوصات متجانسة، وعلى أساس ميكروسكوبية^10،11. ومع ذلك، هو القيد واحد مع هذه الأساليب حاليا أفضل فإنها تكون مناسبة للعلاج المركب في تعليق خلية ويتطلب الكشف عن تحلل الخلية، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات المكانية. سيتسا يمكن تطبيقها تجريبيا أما إلى تحول المستحثة يجند في التجميع الحراري درجة الحرارة (T_agg) في تركيز واحد من جزيء صغير أو تركيز يجند اللازمة لتحقيق الاستقرار في البروتين عند درجة حرارة واحدة. هذا الأخير هو ما يسمى الجرعة متحاور استجابة بصمات الأصابع (إيتدرف) للدلالة على الاعتماد على هذه القياسات في ظروف تجريبية محددة.

والهدف من هذا البروتوكول قياس الاشتباك المستهدفة باستخدام سيتسا في الخلايا ملتصقة بكشف الأجسام المضادة (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت مع ارتفاع محتوى الفحص المجهري¹². ويمتد هذا الإجراء منصة سيتسا الأصلي للسماح لخلية واحدة القياس الكمي لمشاركة الهدف مع الحفاظ على الترجمة سوبسيلولار. جدير بالذكر أن خلافا للعديد من التقارير السابقة، في هذا الإجراء العلاج المركب يتم في الخلايا ملتصقة العيش دون مفرزة السطحية أو الغسيل قبل التحدي الحرارة، وبالتالي الحفاظ على توازن المنشأة ملزمة ونحن نهدف إلى قياس¹³. حاليا، يتم التحقق من الأسلوب لهدف واحد بروتين p38α (MAPK14) في الخلية عدة خطوط، ويحدونا الأمل في أن تقاسم هذا الإجراء هذه التقنية يمكن تطبيقها على نطاق واسع عبر البروتين ذوبان. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها في جميع أنحاء خط الأنابيب التنمية المخدرات من الفحص، وضرب التعقب عن طريق رصد الهدف المشاركة في فيفو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-زرع الخلايا

ملاحظة: للحصول على لمحة عامة عن سير العمل راجع الشكل 1. وتتوفر قائمة مفصلة بالمواد والمواد الكاشفة في الجدول للمواد.

1. قبل البذر للخلايا، حفر ثقوب مع حفر قياسية في إطار أسود 384-جيدا التصوير لوحات الفحص لتجنب الوقوع تحت صفيحة لاحقاً أثناء الخطوة تدفئة فقاعات الهواء. لتجنب جزيئات البلاستيك تدخل الآبار خلال هذه الخطوة والحفاظ على ظروف معقمة، ختم اللوحات مع رقائق ألومنيوم لاصقة أو تغطية اللوحة قبل الحفر في غطاء زراعة الأنسجة. عادة، يكفي 3 ثقوب بقطر 3.5 ملم على كل جانب من اللوحة (الحافة القصيرة).
2. إعداد مقعد الاندفاق الصفحي بالتنظيف باستخدام الإيثانول 70%. بعد تقنيات زراعة الأنسجة العقيم القياسية، وإزالة الوسائط من قارورة الخلية أو الطبق. تغسل الخلايا التي تحتوي على 5-10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) ثم قم بإضافة 2 مل التربسين لقارورة. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا A-431. عد الخلايا أما باستخدام عداد haemocytometer أو الخلية. إعداد تعليق خلية من خلايا/مل 50,000 في المتوسط الثقافة.
3. الاستغناء عن 40 ميليلتر من تعليق خلية (إعطاء كثافة خلية الأخيرة من الخلايا 2,000 كل بئر) في كل من صفيحة الفحص باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية، تبعاً لحجم التجربة جيدا. باختصار نقل اللوحة من جنبا إلى جنب لتفريق الخلايا بالتساوي على الجزء السفلي من اللوحة.
4. للتقليل من آثار حافة اللوحة، تسمح للخلايا لتسوية في الجزء السفلي من لوحة الفحص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجزء الخلفي من غطاء الاندفاق الصفحي. ثم، ضع اللوحة في وعاء من بلاستيك مع مناشف ورقية رطبة لضمان مناخ رطب. قبل الشروع في الاستخدام، مسح الحاويات البلاستيكية مع الإيثانول 70%.
5. احتضان المربع مع لوحة الفحص عن 2-3 أيام في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في حاضنة هوميديفيد تقليدية. رصد كونفلوينسي للخلايا حتى 50-75 ٪، حسب تقييم التفتيش البصري مع مجهر ضوء.

2-مجمع العلاج

1. في يوم التجربة، نضح المتوسطة من كل كذلك استخدام غسالة لوحة. ضع اللوحة في لوحة الغسالة وحدد البرنامج الطموح. في حالة عدم توفر غسالة لوحة، ثم يمكن إزالة السائل بعكس اللوحة مع تطور يد سريع عبر علبة النفايات أو بالوعة. إزالة كاملة من السائل ضروري للأداء الجيد. ثم يتم إزالة أي سائل الزائدة التي دابينج مع مناشف ورقية.
2. إضافة 30 ميليلتر من مركبات مخففة لتركيز المعتمد في مستنبت الخلية استخدام الاستغناء عن الآلي أو ماصة الأقنية تبعاً لمقياس التجربة. ضمان لإضافة سلبية ([دمس]) ومراقبة إيجابية (يجند معروفة) إلى عدة آبار في كل لوحة المقايسة. أن هذا مقايسة تحول حراري، فمن الضروري أن يتجاوز تركيز مركب ثابت التفكك لمراقبة الاستقرار البروتين. وهكذا، توجيهي الخام لتركيز مركب مرات 50-100 IC₅₀، ولكن تم العثور على المزيد من التفاصيل أوصاف لتركيزات المركب في جزء المناقشة.
   ملاحظة: ينبغي اختبار قابلية التحمل [دمس] خطوط الخلية قبل التجربة.
3. ختم ختم لوحة المقايسة المعالجة بالمجمع مع لوحة تنفس واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ في حاضنة هوميديفيد لمدة 30 دقيقة.

3-الحرارة التحدي

1. أولاً، تعيين حمام المياه إلى درجة الحرارة المطلوبة. علما بأن درجة الحرارة النهائي هو التوصل إلى داخل الآبار التي بليت بالانزيم يمكن أن تكون مختلفة عن درجة الحرارة النهائية في حوض ماء. التحقيق الإزاحة مسبقاً مع مقياس حرارة الحرارية ولوحة الطباعة. عادة ما يستغرق 30 دقيقة للحمام يستقر عند درجة الحرارة المطلوبة.
2. للتحقق من أن يتم التوصل إلى درجة الحرارة المطلوبة في آبار لوحة الفحص أثناء الخطوة تدفئة، إعداد صفيحة دمية الغلق التي تحتوي على نفس الحجم من المتوسطة كلوحة المقايسة.
3. إزالة لوحات الفحص من الحاضنة. خلع خاتم تنفس وإعادة ختم لوحة الفحص التي تحتوي على الخلايا المعالجة بالمجمع مع إحباط ألومنيوم لاصقة ضيقة لضمان أنه لا توجد مياه سوف تسرب إلى الآبار أثناء التسخين اللاحق في حوض ماء. التأكد من وجود حفر ثقوب في إطار لوحة موجوداً.
4. ضع لوحة المقايسة ولوحة الطباعة في حمام المياه في الجزء السفلي من لوحة الزاوية نحو سطح الماء لإجبار أي الهواء المتبقية خارج من تحت اللوحات.
5. رصد درجة الحرارة داخل الآبار من لوحة الطباعة الجديدة باستخدام مقياس حرارة الحرارية.
6. الحرارة لوحة الفحص في حمام الماء لمدة 3 دقائق. نقل فورا إلى المقايسة ولوحة الطباعة إلى آخر حمام المياه مع المياه خفف من الغرفة ليبرد لمدة 5 دقائق. لوحة المقايسة جاهز الآن لمزيد من المعالجة.

4-التثبيت

1. الاستغناء عن 10 ميليلتر 16% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) مباشرة إلى لوحة الفحص باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: بعض المصفف تصنف على أنها مسببة للسرطان، وينبغي أن يتبع قواعد السلامة المؤسسية.
2. نضح الحل منهاج عمل بيجين وغسل الخلايا مع 300 ميليلتر PBS باستخدام غسالة لوحة. ضع اللوحة في لوحة الغسالة وحدد البرنامج الطموح.
   ملاحظة: هذا الإجراء قد تم تحسين استخدام بروتوكول منطقة تجاوز سعة في لوحة الغسالة الذي هو السائل في الوقت ذاته الاستغناء عن وإزالة. إذا لم يتوفر لوحة الغسالة أو إجراء مشابه، يمكن بدلاً من ذلك أن يتم خطوة الغسيل يدوياً.
3. اليدوية الغسيل الداخلي: إزالة السائل من الآبار بعكس اللوحة مع تطور يد سريع عبر علبة النفايات أو بالوعة. إزالة كاملة من السائل ضروري للأداء الجيد. إضافة ميليلتر 80 من برنامج تلفزيوني مع ماصة متعددة القنوات وعكس اللوحة مرة أخرى كما هو موضح أعلاه، كرر الإجراء الغسيل مرتين. بعد الغسيل الأخير، لطخة اللوحة ضد مناشف ورقية نظيفة لإزالة أي سوائل زائدة.

5-بيرميبيليزيشن

1. إضافة 20 ميليلتر من 0.1% (v/v) NP-40 إلى الآبار مع بيبيت الأقنية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. غسل الخلايا باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
2. وبدلاً من ذلك، عند الاقتضاء، تطبيق مستضد استرجاع بروتوكولا، مثلاً:
   1. إضافة 20 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 1% إلى الآبار مع بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتغسل وفقا لنفس الإجراءات المذكورة أعلاه (الخطوة 4، 2).
   2. إضافة 80 ميكروليتر من 10 مم جليكاين في الرقم الهيدروجيني 7.2 واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح جليكاين الحل باستخدام غسالة لوحة بوضع على لوحة الغسالة وتحديد البروتوكول الطموح. انظر الملاحظات في 2.1 و 4.2 إذا لم يتوفر غسالة لوحة.

6-حظر

1. إضافة 15 ميليلتر من 1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ختم لوحة رقائق ألومنيوم.

7-الابتدائي جسم

1. نضح الحل حظر استخدام غسالة لوحة بوضع على لوحة الغسالة وتحديد البروتوكول الطموح. انظر الملاحظات في 2.1 و 4.2 إذا لم يتوفر غسالة لوحة.
2. إضافة 10 ميليلتر من جسم الابتدائي تضعف تبعاً لذلك في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ختم لوحة رقائق ألومنيوم.

8-ثانوية جسم

1. نضح الحل جسم الأولية وغسل الآبار وفقا لنفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
2. إضافة 10 ميليلتر من جسم الثانوي 488 أليكسا تضعف تبعاً لذلك في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ختم اللوحة مع ختم إحباط ألومنيوم لاصقة لحماية من الضوء.
   ملاحظة: حماية لوحة من الضوء خلال هذا والخطوات اللاحقة.

9-النووية تلطيخ وقناع الخلية

1. إضافة 10 ميليلتر من الصبغة النووية المخفف إلى 0.05 مغ/مل في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية.
2. نضح بجسم الثانوي وحل هويشت وغسل الآبار باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
3. إضافة 10 ميليلتر من قناع خلية مخفف إلى 200 نانوغرام/مل في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. نضح الحل قناع الخلية وغسل الآبار باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
5. الاستغناء عن 60 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لجميع الآبار باستخدام لوحة الغسالة أو موزع كاشف الأكبر بيبيت الأقنية، وختم اللوحات مع رقائق ألومنيوم لاصقة.

10-صورة اقتناء وتحليل

1. التقاط الصور في تصوير محتوى عالية استخدام قنوات فلورسنت 3: DAPI (387/447)، والتجارة والنقل (472/520)، وتيكساسريد (562/624). الحصول على صور 4 الواحدة وكذلك استخدام 10 X الهدف. استخدام الليزر الآلي ضبط تلقائي للصورة، وتطبيق binning 2 خلال اقتناء. تخزين الصور كملفات tiff بمقياس 16 بت، الرمادي جنبا إلى جنب مع بيانات التعريف.
2. تحليل الصور باستخدام البرمجيات المتاحة. تحديد حدود الخلية باستخدام خوارزمية "خلية التهديف" مع DAPI (نواة) وتيكساسريد (السيتوبلازم).
3. استخراج متوسط كثافة لجميع الأطوال الموجية المكتسبة للمزيد من تحليل البيانات.
4. حساب Z-عامل لضمان متانة المقايسة.
5. حساب الاستقرار % باستخدام الصيغة التالية: 100 * (1-(كثافة جيدا – مراقبة سلبية متوسط كثافة جيدا)/(متوسط كثافة إيجابية تحكم-متوسط كثافة المراقبة السلبية)). هنا هو مراقبة سلبية [دمس] والتحكم الإيجابي هو مادة مرجعية. نظراً لتثبيت الحد الأقصى بين المركبات يمكن أن تختلف وفي الواقع أن تكون أكبر من عنصر التحكم الإيجابي للمنحنيات إيتدرف، كثافات تثبيت الحد الأقصى والحد الأدنى لكل مجمع تستخدم أحياناً بدلاً من قيم الكثافة لمراقبة الآبار .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويصف البروتوكول المبينة في الشكل 1 سير العمل الأساسي لتشغيل سيتسا فحوصات على خلايا ملتصقة بالكشف عن البروتين للذوبان المتبقية بتصوير المحتوى عالية. سير العمل هذا يمكن تكييفها بسهولة لجميع مراحل التطور الإنزيم عن طريق تعديل تخطيط لوحة من المركبات أو المو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

كما تمت مناقشته في المقطع النتائج، هناك العديد من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. أولاً، من المهم التعرف كاشف تقارب عالية الجودة. نوصي بفحص مكتبة صغيرة من الأجسام المضادة لكل من الهدف المنشود. بعد أن تم تحديد جسم الأولية، من المهم أيضا التحقق من صحة النظام لعدد من المواقع المختلفة ملزمة ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System