Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Резюме

Измерения поражения цели наркотиков являются центральным элементом разработки эффективных лекарств и химических зонд проверки. Здесь мы подробно протокол для измерения наркотиков целевых участия, используя высокое содержание изображений в Гонав совместимых адаптация сотовых тепловой сдвиг анализа (CETSA).

Аннотация

Quantitating взаимодействие малых молекул с их предполагаемой белка цели имеет решающее значение для разработки лекарств, целевые проверки и проверки химических зонд. Методы, позволяющие оценить это явление без изменения целевого белка или малые молекулы особенно ценный, хотя технически сложным. Assay сотовой тепловой сдвига (CETSA) является одним из способов для отслеживания целевых участия в живых клетках. Здесь мы описываем адаптация оригинальной CETSA протокол, который позволяет для высокой пропускной способностью измерений при сохранении субцеллюлярные локализации на уровне отдельной ячейки. Мы считаем, что этот протокол предлагает важные успехи в приложение CETSA для углубленного характеристику соединения целевого взаимодействия, особенно в гетерогенной популяции клеток.

Введение

При разработке новых лекарств или химические датчики, важно пару наблюдаемых Фармакологический эффект или функциональной индикации измерений целевой размещение или участия в живых клеток в^1,2,3. Эти данные необходимы для обеспечения что малые молекулы фактически достигает желаемой цели и проверки биологических гипотеза позади белка целевого отбора^4,5. Кроме того во время разработки лекарств, модель системы возрастающей сложности используются для выбора и подтвердить свинца соединения до клинических испытаний. Чтобы подтвердить перевод биологии через эти доклинические систем, методы для отслеживания наркотиков целевых участия и сопровождающие биологии на протяжении всего этого процесса развития являются критическими.

Наркотики целевых участия традиционно сложной для мониторинга в живых клеток с unfunctionalized малых молекул и белков, особенно на уровне одной ячейки с пространственным разрешением^6,7. Один из последних методов наблюдать взаимодействие между неизмененной наркотиков и белков в живых клеток является пробирного сотовой тепловой сдвиг (CETSA), в котором лиганд индуцированной стабилизации родной белка в ответ на вызов тепла является количественных^{8, 9,10}. Это достигается путем количественной оценки оставшихся растворимого белка после воздействия тепла вызов. В первоначальное раскрытие CETSA Западная помарка была использована для обнаружения. Чтобы включить скрининг кампаний и ударил сортировка больших составных коллекций, усилия увеличить пропускную способность CETSA экспериментов привели к разработке нескольких однородных, основанный на Гонав анализов^10,11. Однако одно ограничение с помощью этих методов является, что они в настоящее время лучше всего подходят для соединения лечения в клеточных суспензий и обнаружения требует лизис клеток, приводя к потере пространственной информации. CETSA может быть применена экспериментально, либо как лиганд индуцированного сдвига в тепловой агрегат температуры (_общT) на одну концентрацию малые молекулы или лигандом концентрации, необходимой для стабилизации белка в одной температуры. Последняя называется изотермический дозы ответ отпечатки пальцев (ITDRF) для обозначения зависимость этих измерений на конкретных экспериментальных условиях.

Цель настоящего Протокола заключается в измерения поражения цели с помощью CETSA в адэрентных клеток immunofluorescent обнаружения антител (если) с высоким содержанием микроскопии¹². Эта процедура расширяет оригинальный CETSA платформа для одноклеточных количественного определения целевых участия с сохранением субцеллюлярные локализации. В частности в отличие от многих предыдущих докладах, в этой процедуре составные лечение проводится в живых адэрентных клеток без поверхности отряд или стирки перед проблемой тепла, таким образом, сохраняя равновесие созданной привязки, мы стремимся, чтобы измерить¹³. В настоящее время метод проверяется на один целевой белок p38α (MAPK14) в несколько ячеек, строк, и мы надеемся, что путем обмена этой процедуры метод может быть применен широко по всей плавильной протеома. Мы ожидаем, что этот протокол может быть адаптирована в конвейере развития наркотиков от скрининга, хит классифицирование посредством мониторинга целевых участия в естественных условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Заполнение ячеек

Примечание: Общий обзор рабочего процесса см. Подробный перечень материалов и реагентов доступны в Таблице материалов.

1. До заполнения ячеек, сверлить отверстия сверлом стандартной в рамках черного 384-ну изображений пробирного плит чтобы избежать воздушных пузырей, защемления под пластину позже во время шага Отопление. Чтобы избежать пластиковые частицы, попадающие скважин во время этого шага и поддерживать стерильные условия, печать пластины с клей фольги или крышка до бурения в культуре ткани капюшоном. Как правило достаточно 3 отверстия с диаметром 3,5 мм на каждой стороне пластины (короткая сторона).
2. Подготовьте скамейке ламинарного потока очистки с 70% этиловом спирте. Следующие методы стандартных асептических культуры ткани извлеките из клеток колбу или блюдо. Вымыть клетки с 5-10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS), а затем добавить трипсина 2 мл флакон. Инкубируйте настой при 37 ° C, пока клетки A-431. Подсчет ячеек, либо с помощью haemocytometer или мобильный счетчика. Готовят суспензию клеток 50 000 клеток/мл в культурной среде.
3. Лунки 40 мкл суспензии клеток (давая окончательный клеток плотность 2000 ячеек на хорошо) в каждой скважине пробирного пластины с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки, в зависимости от масштаба эксперимента. Кратко двигаться пластину из стороны в сторону, чтобы разогнать ячейки равномерно в нижней части пластины.
4. Чтобы свести к минимуму эффекты краев плиты, позволяют клеткам поселиться в нижней части пластины пробирного 20 минут при комнатной температуре в задней части Ламинарный шкаф. Затем место пластину в пластиковый контейнер с влажной салфетки для обеспечения влажной атмосфере. Перед использованием протрите пластмассовый контейнер с 70% этиловом спирте.
5. Инкубируйте поле с Пробирной плита на 2-3 дней при 37 ° C и 5% CO₂ в обычных увлажненные инкубатора. Монитор confluency клеток до 50-75%, по оценке визуального осмотра с световой микроскоп.

2. составные лечение

1. В день эксперимента аспирационная среднего от каждой хорошо с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации. Если плита шайбу не доступен, затем жидкость можно удалить, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. Затем любой избыток жидкости удаляется путем тыча с бумажными полотенцами.
2. 30 мкл соединений, разбавленный присвоил концентрации в ячейку культуры среднего с использованием автоматизированного дозирования или многоканальные пипетки в зависимости от масштаба эксперимента. Обеспечить добавление нескольких скважин на каждой табличке пробирного отрицательной (ДМСО) и положительный (известный лигандом) элемента управления. Поскольку это термальный переход пробирного, это необходимо, что составные концентрация превышает Константа диссоциации соблюдать белка стабилизации. Таким образом грубый ориентир для составных концентрации 50 - 100 раз IC₅₀, но более подробно описания составных концентрации находятся в разделе обсуждения.
   Примечание: Переносимость ДМСО клеточных линий должны быть проверены до эксперимента.
3. Уплотнение соединения лечение пробирного пластины с дышащей пластины уплотнения и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и 5% CO₂ в увлажненные инкубатора.

3. тепло вызов

1. Во-первых Установите ванну водой до нужной температуры. Обратите внимание, что конечная температура, которая достигается внутри скважины пробирного пластины может отличаться от окончательной температуры в водяной бане. Исследовать смещение заранее с Макетные пластины и термопары термометр. Это обычно занимает 30 минут для ванн для стабилизации на требуемую температуру.
2. Чтобы убедиться, что на этапе Отопление в скважинах пробирного пластины будет достигнута желаемая температура, подготовьте незапечатанных Макетные пластины, содержащие такой же объем среднего как пробирного пластины.
3. Удаление пробирного пластины из инкубатора. Возьмите дышащей печать и вновь запечатать пробирного пластины, содержащий соединение лечение клетки с жесткой клей фольги обеспечить, что вода не будет течь в скважины во время последующего нагрева в водяной бане. Убедитесь, что отверстия в раме пластины доступны.
4. Место пробирного и Макетные крышку на водяной бане с нижней части плиты, под углом к поверхности воды, чтобы заставить оставшийся воздух из-под плиты.
5. Контролировать температуру внутри скважины новой Макетные пластины с помощью термопары термометра.
6. Тепла пробирного пластины в водяной бане в течение 3 минут. Сразу передача пробирного и Макетные пластины другой водой ванну с водой, комната закаленное, чтобы остыть в течение 5 минут. Пластину пробирного теперь готова для дальнейшей обработки.

4. Фиксация

1. Отказаться от 16% (w/v) параформальдегида 10 мкл (PFA) непосредственно на пластину пробирного с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте 20 минут при комнатной температуре.
   Примечание: Некоторые фиксативов классифицируются как канцерогенные и институциональной безопасности правила должны соблюдаться.
2. Аспирационная PFA решения и вымыть клетки с 300 мкл PBS с помощью пластины шайбу. Поместите пластины на пластину шайбу и выберите программу, аспирации.
   Примечание: Эта процедура была оптимизирована с помощью протокола переполнения на пластине шайбу в котором жидкость одновременно обойтись и удалены. Если плита шайбу или аналогичная процедура недоступна, Стиральная шаг альтернативно может быть сделано вручную.
3. Ручной стирки процедуры: Удалите жидкость из скважин, инвертирование пластину с закруткой быстрого руку над лотка для отработанных чернил или раковину. Полное удаление жидкости имеет важное значение для хорошей производительности. 80 мкл PBS с многоканальные пипетки и инвертировать пластину снова, как описано выше, повторите процедуру Стиральная два раза. После последнего мыть пятно пластину против чистого бумажные полотенца для удаления любой избыток жидкости.

5. permeabilization

1. 20 мкл 0,1% (v/v) NP-40 скважин с многоканальные пипетки и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Вымойте клетки, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
2. Кроме того когда это уместно, примените протокол извлечения антигена, например:
   1. 20 мкл 1% SDS, для скважин с многоканальные пипетки. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут и промыть в том же порядке, описанные выше (шаг 4.2).
   2. Добавьте 80 мкл 10 мм глицин при рН 7,2 и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирационная глицин решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.

6. Блокирование

1. Мкл 15 1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для скважин с помощью реагента Дозатор сыпучих или многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

7. первичные антитела

1. Аспирационная блокирования решения с помощью пластины шайбу, поместив на пластине шайбу и выбор протокола аспирации. Примечания в 2.1 и 4.2 Если плита шайбу не доступен.
2. 10 мкл основное антитело, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте пластины при комнатной температуре в течение 1 часа, или на ночь при 4 ° C с алюминиевой фольги пластина печатью.

8. вторичные антитела

1. Аспирационная основное антитело раствора и промыть скважин в том же порядке, как описано выше (шаг 4.2).
2. 10 мкл Alexa 488 вторичные антитела, разбавленный соответственно в 1% (w/v) BSA в PBS. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре. Уплотнение пластину с клей Алюминий фольга уплотнением для защиты от света.
   Примечание: Защите плиты от света в течение этого и последующих шагов.

9. Ядерная окрашивание и клеток маска

1. 10 мкл ядерных краску разбавляют до 0,05 мг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте дополнительные 10 минут при комнатной температуре.
2. Аспирационная вторичные антитела и Hoechst решения и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
3. 10 мкл клеток маски, разбавляют до 200 нг/мл в PBS для скважин с помощью многоканальные пипетки. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре.
4. Аспирационная решение маска клеток и промыть скважин, используя ту же процедуру, как описано выше (шаг 4.2).
5. Лунки 60 мкл PBS для всех скважин с помощью пластины шайбу, Дозатор сыпучих реагента или многоканальные пипетки и печать пластины с клей фольги.

10. приобретение и анализа изображений

1. Захват изображения на высокой контента Тепловизор с использованием 3 Флюоресцентная каналов: DAPI (387/447), GFP (472/520) и TexasRed (562/624). Приобрести 4 изображений в колодец, используя 10 X цель. Использование автоматизированных лазерной автофокусом и применять биннинга 2 во время приобретения. Хранить изображения как файлы tiff 16 бит, серая шкала вместе с метаданными.
2. Анализ изображений с помощью программного обеспечения. Определение границ ячейки с помощью алгоритма, забив ячейки с DAPI (ядра) и TexasRed (цитоплазма).
3. Экстракт средней интенсивности для всех приобретенных длин волн для дальнейшего анализа данных.
4. Вычислить коэффициент Z для обеспечения надежности assay.
5. Рассчитать % стабилизации, с помощью следующей формулы: 100 * (1-(хорошо интенсивности – средняя интенсивность хорошо отрицательный контроль) / (средняя интенсивность позитивного управления средняя интенсивность отрицательный контроль)). Здесь отрицательный контроль ДМСО и положительный контроль является веществом, ссылки. Так как максимальная стабилизации между соединениями может варьироваться и фактически быть больше, чем положительный контроль для ITDRF кривых, максимальной и минимальной стабилизации интенсивности для каждого соединения иногда используются вместо значений интенсивности управления скважин .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Протокол, изложенные на рисунке 1 описывает основной рабочий процесс для запуска CETSA анализов на адэрентных клеток с выявления оставшихся растворимого белка с высоким содержание изображений. Этот рабочий процесс может быть легко адаптирована для всех...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Как обсуждалось в разделе результаты, существует несколько ключевых шагов к процедуре. Во-первых важно определить реагент сродство высокого качества. Мы рекомендуем, скрининг небольшую библиотеку антител для каждой требуемой цели. После того, как был выбран основное антитело, также ва...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System