Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Riepilogo

Misurazioni di aggancio di obiettivo di droga sono centrale per lo sviluppo di farmaci efficaci e convalida di sonda chimica. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione l'impegno di droga-destinazione usando la formazione immagine contenuta elevata in micropiastra compatibile con l'adattamento del dosaggio cellulare spostamento termico (CETSA).

Abstract

Quantificazione dell'interazione di piccole molecole con loro previsto proteina bersaglio è fondamentale per lo sviluppo di farmaci, destinazione convalida e convalida di sonda chimica. Metodi che misurano questo fenomeno senza modifiche della proteina bersaglio o piccola molecola sono particolarmente preziose, anche se tecnicamente impegnativi. L'analisi di spostamento termico cellulare (CETSA) è una tecnica per monitorare l'impegno di destinazione in cellule viventi. Qui, descriviamo un adattamento del protocollo originale CETSA, che assicura per misurazioni di throughput elevato pur mantenendo la localizzazione subcellulare a livello di singola cellula. Crediamo che questo protocollo offre importanti progressi per l'applicazione di CETSA per approfondita caratterizzazione dell'interazione di composto-destinazione, particolarmente in popolazioni eterogenee delle cellule.

Introduzione

Durante lo sviluppo di nuovi farmaci o sonde chimiche è essenziale per accoppiare l'effetto farmacologico osservato o lettura funzionale ad misure di capienza di destinazione o di fidanzamento in cellule vive^1,2,3. Tali dati sono necessari per assicurare che la piccola molecola infatti raggiunge la sua destinazione desiderata sia per convalidare l'ipotesi biologica dietro proteine bersaglio selezione^4,5. Inoltre, durante lo sviluppo di farmaci, sistemi di modello di complessità crescente vengono utilizzati per selezionare e confermare un piombo composto prima del test clinici. Per confermare la traduzione di biologia attraverso questi sistemi preclinici, metodi per tracciare l'impegno di droga-destinazione e biologia in tutto questo processo di sviluppo di accompagnamento sono critici.

L'impegno di droga-destinazione è tradizionalmente difficile da monitorare in cellule vive con Gegbenenfalls piccole molecole e proteine, soprattutto a livello di singola cellula con risoluzione spaziale^6,7. Unmodified risale un metodo per osservare l'interazione tra farmaci e proteine in cellule vive è il test di spostamento termico cellulare (CETSA) in cui stabilizzazione indotta da legante di una proteina nativa in risposta ad una sfida di calore è quantificata^{8, 9,10}. Ciò avviene mediante la quantificazione della proteina solubile rimanente dopo l'esposizione a una sfida di calore. La divulgazione iniziale di CETSA, western blot è stato usato per il rilevamento. Per attivare campagne di screening e colpire triaging delle più grandi collezioni di composti, gli sforzi per aumentare il throughput di CETSA esperimenti hanno portato allo sviluppo di parecchi saggi omogenei, basati su micropiastra^10,11. Tuttavia, una limitazione con questi metodi è che attualmente meglio sono adatti al trattamento composto in sospensioni delle cellule e la rilevazione richiede la lisi cellulare, portando alla perdita di informazioni spaziali. CETSA può essere applicato sperimentalmente sia come uno spostamento indotta da legante in temperatura di aggregazione termica (T_agg) ad un'unica concentrazione della molecola piccola o alla concentrazione di ligando necessaria per stabilizzare la proteina ad una singola temperatura. Quest'ultimo è definito le impronte digitali di isotermici dose risposta (ITDRF) per indicare la dipendenza di queste misurazioni specifiche condizioni sperimentali.

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'impegno di destinazione utilizzando CETSA in cellule aderenti di rilevazione dell'anticorpo di immunofluorescenza (IF) con microscopia ad alto contenuto¹². Questa procedura si estende la piattaforma CETSA originale per consentire per cella singola quantificazione di aggancio di obiettivo con conservazione della localizzazione subcellulare. In particolare, a differenza di molti rapporti precedenti, in questa procedura composto trattamento viene effettuato in cellule vive aderente senza distacco di superficie o lavaggio prima della sfida di calore, preservando così l'equilibrio stabilito associazione che intendiamo misurare¹³. Attualmente, il metodo viene convalidato per una destinazione della proteina p38α (MAPK14) in diverse linee cellulari, e ci auguriamo che attraverso la condivisione di questa procedura la tecnica può essere applicata ampiamente attraverso il proteoma di fusione. Prevediamo che questo protocollo può essere adattato in tutta la pipeline di sviluppo di droga dallo screening, ha colpito triaging attraverso al monitoraggio dell'obiettivo fidanzamento in vivo.

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Protocollo

1. semina delle cellule

Nota: Per una panoramica generale del flusso di lavoro vedere la Figura 1. Un elenco dettagliato dei materiali e i reagenti sono disponibili nella Tabella materiali.

1. Prima della semina delle cellule, forare con una punta standard nella cornice di nero piastre dosaggio imaging da 384 pozzetti per evitare bolle d'aria intrappolata sotto la piastra più tardi durante la fase di riscaldamento. Per evitare di entrare i pozzetti durante questo passaggio di particelle di plastica e per mantenere condizioni di sterilità, sigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo o coprire la piastra prima della foratura in una cappa di coltura del tessuto. In genere, sono sufficienti 3 fori con un diametro di 3,5 mm su ogni lato della piastra (lato corto).
2. Preparare una flusso laminare panchina pulendo con etanolo al 70%. A seguito di tecniche di coltura tissutale asettica standard, rimuovere supporti dalla cella boccetta o il piatto. Lavare le cellule con 5-10 mL di tampone fosfato salino (PBS) e quindi aggiungere tripsina 2ml al pallone. Incubare la beuta a 37 ° C fino a staccano le cellule di A-431. Contare le celle utilizzando un contatore emocitometro o cella. Preparare una sospensione di cellule di 50.000 cellule/mL nel terreno di coltura.
3. Dispensare 40 µ l di sospensione cellulare (pari ad una densità di cella finale di 2.000 cellule per pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra di analisi utilizzando un dispenser di reagente di massa o di una pipetta multicanale, a seconda dell'entità dell'esperimento. Brevemente, spostare la piastra da lato a lato per disperdere le cellule in modo uniforme sul fondo della piastra.
4. Per ridurre al minimo gli effetti di bordo piastra, permettono alle cellule di stabilirsi nella parte inferiore della piastra dosaggio per 20 minuti a temperatura ambiente nella parte posteriore della cappa a flusso laminare. Quindi, posizionare la piastra in un contenitore di plastica con tovaglioli di carta umidi per garantire un'atmosfera umida. Prima dell'uso, pulire il contenitore di plastica con etanolo al 70%.
5. Incubare la casella con la piastra di dosaggio per 2-3 giorni a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore convenzionale. Monitorare la confluenza delle cellule fino al 50-75%, come valutata mediante ispezione visiva con un microscopio ottico.

2. trattamento di compound

1. Il giorno dell'esperimento, aspirare il mezzo da ogni pozzetto usando una rondella di piatto. Posizionare la piastra sulla rondella piastra e selezionare il programma di aspirazione. Se non è disponibile una rondella di piatto, il liquido può essere rimosso invertendo la piastra con un tocco di mano rapida sopra un vassoio dei rifiuti o un lavandino. Rimozione completa del liquido è essenziale per la buona prestazione. Liquido in eccesso viene quindi rimosso tamponando con carta assorbente.
2. Aggiungere 30 µ l di composti diluito alla concentrazione appropriato nel mezzo di coltura cellulare mediante erogazione automatizzato o una pipetta multicanale a seconda dell'entità dell'esperimento. Assicurarsi di aggiungere un negativo (DMSO) e il controllo positivo (noto ligando) a diversi pozzi su ogni piatto di dosaggio. Poiché si tratta di un'analisi termica dello spostamento, è necessario che la concentrazione di composta supera la costante di dissociazione per osservare la stabilizzazione proteica. Così, una guida di riferimento per la concentrazione di composti è 50 - 100 volte la IC₅₀, ma più descrizioni di dettaglio per le concentrazioni di composte si trovano nella sezione discussione.
   Nota: Tollerabilità di DMSO delle varietà di cellula dovrebbe essere testato prima dell'esperimento.
3. Tenuta la piastra di dosaggio composto-trattati con una piastra traspirante sigillare e incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore per 30 minuti.

3. calore sfida

1. In primo luogo, è possibile impostare il bagno di acqua alla temperatura desiderata. Si noti che la temperatura finale che viene raggiunta all'interno i pozzetti della piastra, l'analisi può essere diversa dalla temperatura finale nel bagno d'acqua. Indagare l'offset in anticipo con un termometro a termocoppia e piastra fittizio. In genere si impiegano 30 minuti per il bagno stabilizzare la temperatura desiderata.
2. Per verificare che è raggiunta la temperatura desiderata nei pozzetti della piastra dosaggio durante la fase di riscaldamento, preparare una piastra fittizia non sigillata contenenti lo stesso volume del mezzo come la piastra di dosaggio.
3. Rimuovere le piastre di dosaggio dall'incubatrice. Togliere il sigillo traspirante e richiudere e sigillare la piastra di test che contiene le cellule composto-trattate con un foglio di alluminio adesivo stretto per garantire che l'acqua non colerà nei pozzetti durante il riscaldamento successivo nel bagno d'acqua. Assicurarsi che i fori praticati nella piastra del telaio siano accessibili.
4. Posizionare la piastra di dosaggio e il manichino nel bagno d'acqua con il fondo del piatto inclinato verso la superficie dell'acqua per forzare qualsiasi aria restante fuori da sotto le piastre.
5. Monitorare la temperatura all'interno dei pozzetti di una nuova piastra manichino con un termometro a termocoppia.
6. Scaldare la piastra di dosaggio nel bagno d'acqua per 3 minuti. Trasferire immediatamente il dosaggio e la piastra fittizio per un altro bagno di acqua con acqua sala-temperato per raffreddare per 5 minuti. La piastra di dosaggio è ora pronta per l'ulteriore elaborazione.

4. fissazione

1. Pipettare 10 µ l 16% (p/v) di paraformaldeide (PFA) direttamente alla piastra dosaggio usando un erogatore di reagente di massa o di una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
   Nota: Alcuni fissativi sono classificati come cancerogeni e norme di sicurezza istituzionale dovrebbero essere seguite.
2. Aspirare la soluzione PFA e lavare le cellule con 300 µ l PBS utilizzando una rondella di piatto. Posizionare la piastra sulla rondella piastra e selezionare il programma di aspirazione.
   Nota: Questa procedura è stata ottimizzata utilizzando un protocollo di overflow sulla rondella piastra in cui liquido è contemporaneamente dispensato e rimosso. Se non è disponibile una piastra rondella o procedura analoga, la fase di lavaggio in alternativa può essere fatto manualmente.
3. Procedura di lavaggio manuale: Rimuovere il liquido dai pozzetti invertendo la piastra con un tocco di mano rapida sopra un vassoio dei rifiuti o un lavandino. Rimozione completa del liquido è essenziale per la buona prestazione. Aggiungere 80 µ l di PBS con una pipetta multicanale e capovolgere la piastra come descritto sopra, ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, tamponare la piastra contro gli asciugamani di carta pulita per rimuovere il liquido in eccesso.

5. permeabilizzazione

1. Aggiungere 20 µ l di 0.1% (v/v) NP-40 per i pozzetti con una pipetta multicanale e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare le cellule con la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
2. In alternativa, se del caso, applicare un protocollo di recupero dell'antigene, per esempio:
   1. Aggiungere 20 µ l di 1% SDS per i pozzetti con una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e lavare secondo la stessa procedura descritta sopra (punto 4.2).
   2. Aggiungere 80 µ l di glicina 10 mM a pH 7,2 e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di glicina utilizzando una rondella piastra spostando sulla rondella piastra e selezionando il protocollo di aspirazione. Se una rondella di piatto non è disponibile, vedere note in 2.1 e 4.2.

6. blocco

1. Aggiungere 15 µ l di 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in PBS pozzetti utilizzando un dispenser di reagente di massa o di una pipetta multicanale. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte a 4 ° C con un sigillo di piastra in alluminio estruso.

7. primaria dell'anticorpo

1. Aspirare la soluzione di blocco utilizzando una rondella piastra spostando sulla rondella piastra e selezionando il protocollo di aspirazione. Se una rondella di piatto non è disponibile, vedere note in 2.1 e 4.2.
2. Aggiungere 10 µ l di anticorpo primario diluito in conseguenza a 1% (p/v) BSA in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte a 4 ° C con un sigillo di piastra in alluminio estruso.

8. secondaria dell'anticorpo

1. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare i pozzetti secondo la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
2. Aggiungere 10 µ l di anticorpo secondario Alexa 488 conseguenza diluito in 1% (p/v) BSA in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Sigillare la piastra con un foglio di alluminio adesivo sigillo al riparo dalla luce.
   Nota: Proteggere la piastra dalla luce durante questo e i passaggi successivi.

9. nucleare macchiatura e maschera di cella

1. Aggiungere 10 µ l di colorante nucleare diluito a 0,05 mg/mL in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 10 minuti.
2. Aspirare la soluzione di Hoechst e un anticorpo secondario e lavare i pozzetti utilizzando la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
3. Aggiungere 10 µ l di cella maschera diluito a 200 ng/mL in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Aspirare la soluzione di maschera di cella e lavare i pozzetti utilizzando la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
5. Versare 60 µ l di PBS in tutti i pozzetti usando una pipetta multicanale, un dispenser di reagente di massa o la rondella piastra e sigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo.

10. acquisizione e analisi delle immagini

1. Catturare le immagini su un alto contenuto imager utilizzando 3 canali fluorescente: DAPI (387/447), GFP (472/520) e TexasRed (562/624). Acquisire 4 immagini per pozzetto utilizzando obiettivo 10x. Utilizzare l'autofocus automatico laser e applicare binning 2 durante l'acquisizione. Memorizzare le immagini come file di tiff a 16 bit, grigio scala insieme ai metadati.
2. Analizzare le immagini utilizzando il software disponibile. Identificare i bordi della cella utilizzando un algoritmo di cella segnando con DAPI (nucleo) e TexasRed (citoplasma).
3. Estratto di intensità media per tutte le lunghezze d'onda acquisita per ulteriore analisi di dati.
4. Calcolare il fattore di Z per assicurare la robustezza del dosaggio.
5. Calcolare la stabilizzazione % utilizzando la seguente formula: 100 * (1-(ben intensità – media intensità ben controllo negativo) / (media controllo negativo positivo controllo-media intensità di intensità)). Qui il controllo negativo è DMSO e controllo positivo è la sostanza di riferimento. Poiché la massima stabilizzazione tra composti possa variare e in realtà essere maggiore il controllo positivo per le curve ITDRF, le intensità di stabilizzazione di massima e minima per ogni composto sono a volte utilizzate al posto dei valori di intensità di pozzetti di controllo del .

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Risultati

Il protocollo descritto nella Figura 1 descrive il flusso di lavoro di base per l'esecuzione di saggi CETSA su cellule aderenti con rilevazione della proteina solubile rimanente da alto contenuto imaging. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato a tutte le fasi di sviluppo di analisi modificando il layout della piastra dei composti o reagenti¹⁴. Dettagliamo i risultati attesi per più atteso seguito di casi di utilizzo.<...

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Discussione

Come discusso nella sezione risultati, ci sono diversi passaggi chiave per la procedura. In primo luogo, è importante identificare un reagente di affinità di alta qualità. Si consiglia una piccola biblioteca di anticorpi per ogni destinazione desiderata di screening. Dopo aver selezionato un anticorpo primario, è anche importante convalidare il sistema per un certo numero di siti leganti differenti della proteina bersaglio, se del caso. Counter-screening per composti che interferiscono con il segnale di test, come mo...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System