付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。

要約

薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ イメージングを用いた創薬ターゲット婚約を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。

要約

目的の蛋白質ターゲットと小分子の相互作用を量的に表わす創、ターゲットの検証および化学プローブ検証にとって重要です。蛋白質ターゲットまたは小さい分子のままこの現象の測定方法は、技術的には難しいと思う特に貴重です。細胞熱シフト試金 (CETSA) は、細胞内のターゲットの関与を監視する技術のひとつです。ここでは、単一細胞レベルでの細胞内局在化を維持しながら高いスループット測定できますオリジナルの CETSA プロトコルの適応について述べる。このプロトコルは CETSA の化合物ターゲット相互作用、特に細胞の異種個体集団の詳細な特性評価申請に重要な進歩を提供するいますと考えています。

概要

開発新薬や化学プローブ ターゲット占有または生きているセル^1,2,3への関与の測定と観察された薬理効果や機能的な読み出しをカップルが不可欠です。これらのデータが小分子実際に目的のターゲットに達することを確認して蛋白質ターゲット選択^4、5の背後にある生物学的仮説を検証するために必要です。さらに、医薬品開発の間には複雑化のモデル システムは選択し、臨床試験の前に化合物鉛を裏付けるにされます。これらの前臨床システムの生物学の翻訳を確認するための創薬ターゲットの関与をトレースと付随するこの開発プロセス全体を通じて生物学の方法が重要です。

創薬ターゲット婚約伝統的 unfunctionalized 小分子や蛋白質、特に空間分解能^6、7の単一細胞レベルで生きた細胞を監視するために挑戦されています。間の相互作用を観察する 1 つの最近の方法は、薬をそのまま、生きた細胞中のタンパク質は熱チャレンジへの応答でネイティブ蛋白質のリガンド誘導性の安定化、定量化された^{8、携帯電話熱シフト試金 (CETSA) 9,10}。これが熱の挑戦への暴露後残りの可溶性タンパク質を定量化することでできます。CETSA の最初の開示、西部のしみの検出のため使用されました。早期発見キャンペーンを有効にし、大きい化合物コレクションのトリアージをヒット、CETSA 実験のスループットを増やすためにいくつか同種のマイクロ プレート ベースのアッセイ^10,11の開発をリードしています。ただし、これらのメソッド 1 つの制限は、細胞懸濁液における化合物の治療に適しています現在最高検出セル換散、空間情報の損失につながるが必要です。CETSA がすることができます小さな分子の単一濃度または単一温度で蛋白質を安定させるために必要なリガンド濃度で実験加熱凝集温度 (T_agg) の配位子誘起シフトのいずれかとして適用します。後者は、等温線量応答指紋これら測定は特定の実験条件に依存性を示すために (ITDRF) と呼ばれます。

このプロトコルの目標は、付着細胞で CETSA を用いた高コンテンツ顕微鏡¹²蛍光 (IF) 抗体の検出のターゲットの関与を測定することです。この手順は、内局の保全とターゲットの関与の単一セルの定量化を可能にするのには、元の CETSA プラットフォームを拡張します。特に、多くの以前のレポートとは異なりこの手順では複合治療で実行されますライブの付着性のセル表面剥離有無により¹³の測定を目指して設立された結合平衡を保持熱挑戦前に洗濯。現在、メソッドは 1 つのターゲット蛋白質 p38α の検証 (MAPK14) のいくつかの細胞株、およびことこの手順を共有することによってテクニック広範に適用できる溶融プロテオームを越えてほしい。我々 は、このプロトコルはスクリーニングから医薬品開発パイプライン全体で合わせることができる、ターゲット婚約生体内での監視を通じてトリアージを見込んでいます。

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プロトコル

1. 細胞の播種

注:ワークフローの一般的な概要については、図 1を参照してください。材料および試薬の詳細なリストはテーブルの材料で利用できます。

1. 細胞の播種前に黒 384-well アッセイ プレート加熱ステップ中に後で皿の下敷きにされている空気の泡を避けるためにフレームに標準的なドリルで穴をあけます。このステップの間に井戸に入るプラスチック粒子を回避し、無菌状態を維持するために、粘着アルミ箔でプレートをシールまたはティッシュ文化フードの掘削前にプレートをカバーします。通常、各プレート (短辺) の側に 3.5 mm の直径の 3 つの穴で十分です。
2. 層流ベンチを準備するには、70% エタノールで洗浄します。以下の標準的な無菌培養技術、セル フラスコまたは皿からメディアを削除します。5-10 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の細胞を洗浄し、フラスコに 2 mL のトリプシンを追加します。A-431 細胞を切り離すまでは、37 ° C でフラスコを孵化させなさい。Haemocytometer またはセルのカウンターを使用していずれかのセルをカウントします。50,000 セル/mL の培養液中の細胞懸濁液を準備します。
3. バルク試薬ディスペンサーまたは実験の規模によって、マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートの各ウェルに細胞懸濁液 (ウェルあたり 2,000 セルの最終的な細胞密度を与える) の 40 μ L を分注します。簡単にプレートの底にセルを均等に分散する側からプレートを移動します。
4. プレート エッジ効果を最小限に抑えるために層流フードの奥に室温で 20 分のアッセイ プレートの下部に解決するために細胞を許可します。次に、湿気のある大気を確保するため少し湿らせたペーパー タオルでプラスチック容器にプレートを置きます。使用前に 70% のエタノールでプラスチック容器を拭きます。
5. 従来の加湿インキュベーターで CO₂を 37 ° C、5% で 2 〜 3 日のアッセイ プレートとボックスを孵化させなさい。光顕微鏡による目視検査により評価した 50-75% まで細胞の密度を監視します。

2. 複合治療

1. 実験の日、よくプレート ワッシャーを使用して各から媒体を吸引します。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。板ワッシャーが使用できない場合、切片屑トレーまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートの反転によって液体を削除できます。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。余分な液体が紙タオルで軽くたたくことにより削除されます。
2. 細胞培養培地自動調剤を使用してまたは実験の規模によってマルチ チャンネル ピペットで充当の濃度に希釈して化合物の 30 μ L を追加します。各アッセイ プレート上のいくつかの井戸に負 (DMSO) と正 (知られている配位子) コントロールを追加することを確認します。これは熱シフト試金は、化合物の濃度が安定化タンパク質を観察する解離定数を超えている必要があります。したがって、化合物の濃度についての大まかな指針は 50-100 回 IC₅₀が、ディスカッション セクションに化合物濃度のより詳細な説明があります。
   注: セル行の DMSO を忍容性は、実験前にテスト必要があります。
3. シール通気性のある板で化合物処理アッセイ プレート シールし、加湿のインキュベーターで CO₂を 5% と 37 ° C で 30 分間インキュベートします。

3. 熱チャレンジ

1. まず、風呂の水を所望の温度に設定します。アッセイ プレートのウェル内に達し最終的な温度水のバスで最終の温度とは異なることに注意してください。ダミー プレートと熱電対温度計とオフセットを事前調査します。通常、所望の温度で安定するお風呂に 30 分かかります。
2. 加熱ステップ中にアッセイ プレートの井戸に所望の温度が達されることを確認するためアッセイ プレートとして媒体の同じボリュームを含む封印されていないダミー プレートを準備します。
3. インキュベーターからアッセイ プレートを削除します。通気性のあるシール離陸し、水浴の後の加熱時に、井戸に水が漏れないようにタイトな粘着アルミ箔複合処理細胞を含むアッセイ プレートを再シールします。プレート フレームの穴がアクセスできることを確認します。
4. アッセイ プレートとダミー プレートを風呂の水でプレートの下から出て残りの空気を強制的に水面に向かって傾斜プレートの下部に配置します。
5. 熱電対温度計を使用して新しいダミー プレートの井戸の中の温度を監視します。
6. 熱で 3 分間湯せんアッセイ プレート。すぐに 5 分間クールダウン ルーム鍛えて水で別水槽にアッセイとダミー プレートを転送します。アッセイ プレートは、さらに処理の準備が整いました。

4. 固定

1. バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートに直接 10 μ L 16% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を分配します。室温で 20 分間インキュベートします。
   注: いくつかの定着剤は発がん性として分類され、機関の安全規則に従う必要があります。
2. PFA ソリューションを吸引し、プレート ワッシャーを使用して 300 μ L の PBS のセルを洗ってください。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。
   注: この手順は、プレートの洗濯機、液体は同時に分配され、削除のオーバーフロー プロトコルを使用して最適化されています。プレート洗浄機または同様の手順を使用できない場合洗浄のステップまたは手動で実行できます。
3. プロシージャを洗浄マニュアル:井戸から液体を削除するには、廃棄物トレイまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートを反転します。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。マルチ チャンネル ピペットに 80 μ L の PBS を追加上記として再びプレートを反転、2 回洗濯の手順を繰り返します。最後の洗浄後、余分な液体を削除するきれいなペーパー タオルに対してプレートをしみ。

5. 透過

1. 0.1% (v/v) NP 40 マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸の 20 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。(ステップ 4.2) 上記のように同じ手順を使用してセルを洗浄します。
2. または、適切な場合、抗原検索のプロトコル、例えばに適用します。
   1. マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸に 1 %sds の 20 μ L を追加します。室温で 5 分間インキュベートし、(手順 4.2) 上記同じ手順に従って洗ってください。
   2. Ph 7.2 10 mM グリシンの 80 μ L を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。プレート ワッシャーに配置し、吸引プロトコルの選択によるプレート ワッシャー グリシン ソリューションを吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。

6 ブロック

1. バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) の 15 μ L を追加します。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。

7. 一次抗体

1. プレート ワッシャーに配置し吸引プロトコルを選択するプレート ワッシャーを使用してブロッキング液を吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。
2. 適宜希釈した一次抗体の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸へ。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。

8. 二次抗体

1. 一次抗体溶液を吸引し、(手順 4.2) 上記のように、同じ手順に従って洗浄します。
2. アレクサ 488 二次抗体のに応じて希薄化後の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS で。室温で 1 時間インキュベートします。プレートは、光から保護するために粘着アルミ箔シールとシールします。
   注: は、この中に光からプレートと後続の手順を保護します。

9. 核染色と細胞マスク

1. マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 0.05 mg/mL に希釈して核の色素の 10 μ L を追加します。室温でさらに 10 分間インキュベートします。
2. 二次抗体とヘキスト ソリューションを吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。
3. 携帯マスク 200 ng/mL の PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に希薄化後の 10 μ L を追加します。室温で 30 分間インキュベートします。
4. 細胞マスク液を吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。
5. プレート洗浄機、バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してすべてのウェルに 60 μ L の PBS を調剤し、粘着アルミ箔でプレートをシールします。

10 画像集録および解析

1. 3 蛍光チャネルを使用して高いコンテンツ撮像素子で画像をキャプチャ: DAPI (387/447)、GFP (472/520)、および TexasRed (562/624)。対物レンズ 10 倍を用いたあたり 4 枚の画像を取得します。オート フォーカス自動レーザーを使用し、集録時に合算 2 を適用します。メタデータと共に 16 ビット、グレー スケールの tiff ファイルとしてイメージを保存します。
2. 利用可能なソフトウェアを使用して画像を分析します。DAPI (核) と TexasRed (細胞質) セル スコアリング アルゴリズムを使用して、セルの境界を識別します。
3. さらにデータ解析のためのすべての取得した波長の平均強度を抽出します。
4. アッセイの堅牢性を確保するため Z 係数を計算します。
5. 計算する次の数式を使用して % 安定化: 100 * (1-(よく強度-平均よく強度ネガティブ コントロール) (平均強度肯定的な制御の平均強度ネガティブ コントロール)/)。ここで否定的な制御は DMSO と肯定的な制御の参照物質。各化合物の最大値と最小の安定強度を制御井戸の強度値の代わりに使用されることが化合物間の最大の安定化することができます異なります ITDRF 曲線の肯定的な制御より大きくなければ実際にので、.

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結果

図 1で説明したプロトコルでは、残りの可溶性タンパク質の検出と付着性のセルで高いコンテンツ イメージングによる CETSA 試金を実行するための基本的なワークフローについて説明します。このワークフローは、化合物や試薬¹⁴プレート レイアウトを変更することによりアッセイ開発のすべての段階に容易に適応することがで...

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ディスカッション

結果のセクションで説明したように、方法は、いくつかのキー手順があります。まず、質の高い親和性の試薬を識別するために重要です。各ターゲットのための抗体の小さなライブラリをスクリーニングをお勧めします。一次抗体を選択すると、また適切な蛋白質ターゲットの異なる結合部位数のシステムを検証することが重要です。カウンター熱チャレンジを省略することによって

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System