척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

요약

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

초록

Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.

서문

때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀^1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택^4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.

마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도^6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된^{8, 9,10}. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석^10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (T_agg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.

이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경¹²immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가¹³를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.

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프로토콜

1. 셀의 시드

참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.

1. 셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입자가이 단계 동안 우물을 입력을 방지 하 고 살 균 조건을 유지 하기 위해 밀봉 접착제 알루미늄 호 일 접시 또는 조직 문화 후드에 드릴링 전에 접시 커버. 일반적으로, 각 접시 (짧은 가장자리)의 측면에 3.5 m m의 직경을 가진 3 구멍 충분.
2. 70% 에탄올으로 청소 하 여 층 류 벤치를 준비 합니다. 표준 무 균 조직 배양 기술, 다음 셀 플라스 크 또는 접시에서 미디어를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5-10 mL로 세포 세척 하 고 플라스 크에 트립 신 2 mL를 추가 합니다. A-431 셀 분리 될 때까지 플라스 크에서 37 ° C를 품 어. Haemocytometer 또는 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 문화 매체에 50, 000 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
3. 벌크 시 약 디스펜서 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (주는 잘 당 2000 셀 마지막 셀 밀도)의 40 µ L을 분배. 짧게 사이드-투-측면에서 접시의 바닥에 세포를 균일 하 게 분산 하는 접시를 이동 합니다.
4. 접시 가장자리 효과 최소화 하기 위해 층 류 두건 뒤 실 온에서 20 분에 대 한 분석 결과 접시의 하단에 정착을 셀 수 있습니다. 다음, 다습 한 대기권을 보장 하기 위해 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 접시를 놓습니다. 사용 전에 70% 에탄올과 플라스틱 용기를 닦아.
5. 기존의 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 2-3 일에 대 한 분석 결과 플레이트 상자를 품 어. 가벼운 현미경으로 검사 하 여 평가는 50-75%까지 셀의 confluency를 모니터링 합니다.

2. 복합 치료

1. 실험 당일, 잘 사용 하 여 각 접시 세탁기에서 중간 발음. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우에, 액체 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 제거할 수 있습니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 어떤 초과 액체 다음 종이 타월로 dabbing에 의해 제거 됩니다.
2. 자동 분배를 사용 하 여 세포 배양 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피 펫 적절된 농도를 희석 하는 화합물의 30 µ L를 추가 합니다. 각 분석 결과 접시에 여러 우물을 네거티브 (DMSO)와 긍정적인 (알려진된 ligand) 컨트롤을 추가 하려면 확인 하십시오. 이후이 열 교대 분석 실험, 화합물 농도 분리 상수 관찰 단백질 안정화를 초과 하는 것이 필요 하다. 따라서, 화합물 농도 대 한 대략적인 가이드라인은 50-100 번 IC₅₀, 하지만 화합물 농도 대 한 더 많은 세부 사항 설명을 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
   참고: 셀 라인의 DMSO 내성 실험 전에 시험 되어야 한다.
3. 인감 숨 플레이트 화합물 처리 분석 결과 플레이트 밀봉 하 고 30 분 동안 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 품 어.

3. 열 도전

1. 먼저, 원하는 온도에 물 목욕을 설정 합니다. 참고 분석 결과 접시의 우물 내부에 도달 최종 온도 물 목욕에 최종 온도에서 다를 수 있습니다. 더미 플레이트 및 열전대 온도계와 오프셋을 미리 조사. 그것은 일반적으로 원하는 온도에서 안정화 목욕 30 분 걸립니다.
2. 원하는 온도 난방 단계 분석 결과 격판덮개의 우물에서에 도달 확인, 분석 결과 접시와 매체의 동일한 볼륨을 포함 하는 봉인 되지 않은 더미 플레이트를 준비 합니다.
3. 인큐베이터에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 숨 봉인 해제 하 고 다시 물 물 목욕에 연속적인 난방 동안 우물에 누설 것 이다 되도록 꽉 접착제 알루미늄 호 일 화합물 취급 셀을 포함 하는 분석 결과 접시를 봉인. 플레이트 프레임에 드릴된 구멍 액세스할 수 있는지 확인 하십시오.
4. 접시 아래에서 밖으로 남아 있는 공기를 물 표면으로 각도 판의 아래쪽 물 목욕에 분석 결과 접시와 접시 더미를 놓습니다.
5. 열전대 온도계를 사용 하 여 새로운 더미 격판덮개의 우물 내부 온도 모니터링 합니다.
6. 분석 결과 접시 물 욕조에 3 분 동안 열. 즉시 다른 물 목욕을 5 분 동안 방 강화 물 분석 결과 및 더미 플레이트 전송. 분석 결과 격판덮개는 이제 추가 처리에 대 한 준비 이다.

4입니다. 고정

1. 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 접시에 직접 10 µ L 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA)을 분배. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
   참고: 일부 fixatives 발암으로 분류 되 고 기관 안전 규정을 따라야 한다.
2. PFA 솔루션 발음 하 고 접시 와셔를 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 씻어. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다.
   참고:이 절차는 최적화 되어 있는 액체는 동시에 적절 하 게 하 고 제거 접시 세탁기에 오버플로 프로토콜을 사용 하. 접시 와셔 또는 유사한 절차를 사용할 수 없는 경우 세척 단계 수동으로 수행할 수도 있습니다.
3. 수동 세척 절차: 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 우물에서 액체를 제거 합니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 멀티 채널 피 펫으로 PBS의 80 µ L을 추가 및 위에서 설명한 대로 다시 접시를 반전, 세척 절차를 두 번 반복. 마지막 세척 후 깨끗 한 종이 수건을 초과 액체를 제거에 대 한 접시를 되 리.

5입니다. permeabilization

1. 0.1% (v/v) NP 40를 멀티 채널 피펫으로와 웰 스의 20 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 셀을 씻어.
2. 또는 적절 한 경우 적용 한 항 원 검색 프로토콜, 예를 들면:
   1. 멀티 채널 피펫으로와 우물에 1 %SDS 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 고 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 씻어.
   2. PH 7.2에서 10 mM 글리신의 80 μ를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 글리신 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.

6. 차단

1. 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 PBS에서 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 15 µ L를 추가 합니다. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.

7. 1 차 항 체

1. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 차단 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
2. 1 차적인 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.

8. 2 차 항 체

1. 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 (단계 4.2) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 우물을 세척.
2. 알 렉 사 488 이차 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에. 1 시간 동안 실 온에서 품 어. 빛 으로부터 보호 하기 위해 접착제 알루미늄 호 일 인감과 접시를 봉인.
   참고:이 빛에서 접시와 후속 단계를 보호 합니다.

9. 핵 얼룩 및 셀 마스크

1. 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물 PBS에 0.05 mg/mL를 희석 하는 핵 염색의 10 µ L를 추가 합니다. 추가 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
2. 이차 항 체 및 Hoechst 솔루션 aspirate과 웰 스 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
3. 셀 마스크 200 ng/mL PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 희석의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
4. 셀 마스크 솔루션을 발음 하 고 우물 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
5. 접시 와셔, 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 모든 우물에 PBS의 60 µ L를 분배 하 고 밀봉 접착제 알루미늄 호 일로 접시.

10. 이미지 수집 및 분석

1. 3 형광 채널을 사용 하 여 높은 콘텐츠 영상에 이미지 캡처: DAPI (387/447), GFP (472/520) 및 TexasRed (562/624). 10 X 목표를 사용 하 여 잘 당 4 이미지를 취득 합니다. 자동된 레이저 자동 초점을 사용 하 고 범주화 2 중 적용. 16 비트, 회색 스케일 tiff 파일로 메타 데이터와 함께 이미지를 저장 합니다.
2. 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. DAPI (핵)와 TexasRed (세포질) 셀 점수 알고리즘을 사용 하 여 셀 경계를 식별 합니다.
3. 추가 데이터 분석에 대 한 모든 인수 파장에 대 한 평균 강도 추출 합니다.
4. 분석 결과의 안정성을 보장 하기 위해 Z 요소를 계산 합니다.
5. 다음 수식을 사용 하 여 % 안정화 계산: 100 * (1-(잘 강도-평균 잘 휘도 부정적인 제어) / (평균 휘도 긍정적인 제어 평균 강도 부정적인 제어)). 여기 부정적인 제어 DMSO 이며 긍정적인 컨트롤 참조 물질 이다. 각 화합물에 대 한 최대 및 최소 안정화 농도 제어 우물의 강도 값 대신 가끔 사용 됩니다 이후 최대 안정화 화합물 사이 다를 수 있으며 실제로 ITDRF 곡선에 대 한 긍정적인 통제 보다 클 수, .

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결과

그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약¹⁴의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 ...

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토론

결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System