Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Zusammenfassung

Messungen der Droge Ziel Engagement sind von zentraler Bedeutung für effektive Medikamentenentwicklung und chemische Sonde Validierung. Hier zeigen wir ein Protokoll zur Messung der Droge-Ziel Engagement mit hohen Inhalt Bildgebung in einer Mikrotestplatte-kompatiblen Adaption des zellulären thermische Verschiebung Assays (CETSA).

Zusammenfassung

Quantifizierung der Interaktion von kleinen Molekülen mit ihrer beabsichtigten Protein-Ziel ist entscheidend für die Arzneimittelentwicklung, Target-Validierung und chemische Sonde Validierung. Besonders wertvoll sind die Methoden, die dieses Phänomen ohne Änderung der Protein-Ziel oder kleines Molekül zu messen, aber technisch anspruchsvolle. Die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) ist eine Technik, Ziel Engagement in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Anpassung der ursprünglichen CETSA-Protokoll, das für hohen Durchsatz-Messungen unter Beibehaltung der subzellulären Lokalisierung auf der Ebene der einzelnen Zelle kann. Wir glauben, dass dieses Protokoll bietet wichtige Fortschritte für die Anwendung der CETSA für detaillierte Charakterisierung der Verbindung zu den Zielgruppen Interaktion, vor allem in heterogenen Bevölkerung der Zellen.

Einleitung

Bei der Entwicklung neuer Medikamente oder chemische Sonden es unerlässlich ist, die beobachteten pharmakologischen Wirkung oder funktionelle auslesen, Messungen der Ziel-Belegung oder Engagement in lebenden Zellen^1,2,3paar. Diese Daten sind notwendig, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül in der Tat das gewünschte Ziel erreicht und die biologischen Hypothese hinter Protein Ziel Auswahl^4,5zu überprüfen. Darüber hinaus werden während der Medikamentenentwicklung, Modellsysteme der zunehmenden Komplexität zur auswählen und einen Vorsprung vor klinischen Studien Verbindung bestätigen. Um die Übersetzung der Biologie dieser präklinischen systemübergreifend zu bestätigen, sind Methoden für Droge-Ziel Engagement verfolgen und begleitende Biologie während dieses Entwicklungsprozesses entscheidend.

Droge-Ziel Engagement ist traditionell schwierig, in lebenden Zellen mit unfunctionalized kleine Moleküle und Proteine, insbesondere auf der Ebene der Einzeller mit räumlicher Auflösung^6,7zu überwachen. Eine neue Methode zu beobachten, die Interaktion zwischen unveränderten Drogen und Proteine in lebenden Zellen ist die zelluläre thermische Verschiebung Assay (CETSA) in dem Liganden-induzierte Stabilisierung eines nativen Proteins als Reaktion auf eine Hitze-Herausforderung quantifizierte^{8ist, 9,10}. Dies geschieht durch Quantifizierung der verbleibenden lösliche Protein nach Exposition gegenüber einem Hitze-Herausforderung. In der ersten Offenlegung von CETSA wurde western-Blot zum Nachweis verwendet. Screening-Kampagnen aktivieren und Selektierung von größeren zusammengesetzten Sammlungen getroffen, haben Anstrengungen zur Erhöhung des Durchsatzes CETSA Experimente führten zur Entwicklung von mehreren homogenen, Mikrotestplatte basierende Assays^10,11. Eine Einschränkung mit diesen Methoden ist jedoch, dass derzeit zusammengesetzten Behandlung in Zellsuspensionen optimal und die Erkennung Zelle Lysis erfordert, führt zum Verlust der räumlichen Informationen. CETSA kann sein angewandt experimentell entweder als Liganden-induzierte Verschiebung in der thermischen Aggregation Temperatur (T_Agg) an einem einzigen Zusammenschluss kleiner Moleküle oder die Liganden-Konzentration notwendig, das Protein in einer einzelnen Temperatur zu stabilisieren. Letzteres wird als isothermen Dosis Antwort Fingerabdrücke (ITDRF), um die Abhängigkeit von diesen Messungen an bestimmten experimentellen Bedingungen bedeuten bezeichnet.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Ziel Engagement mit CETSA in adhärenten Zellen durch immunofluorescent (IF)-Antikörpernachweis mit High-Content Mikroskopie¹²messen. Dieses Verfahren reicht die ursprüngliche CETSA-Plattform, um einzellige Quantifizierung der Ziel-Engagement mit der Erhaltung der subzellulären Lokalisierung zu ermöglichen. Bemerkenswert ist, im Gegensatz zu vielen früheren Berichten in diesem Verfahren zusammengesetzte Behandlung erfolgt in lebenden adhärente Zellen ohne Oberflächen Ablösung oder waschen vor der Hitze-Challenge, so bewahrt das Gleichgewicht der etablierten Bindung wollen wir¹³messen. Derzeit ist die Methode für ein Ziel Protein p38α validiert (MAPK14) in mehrere Zellinien, und wir hoffen, dass durch den Austausch dieses Verfahren die Technik im großen und ganzen über das schmelzende Proteom angewendet werden kann. Wir erwarten, dass dieses Protokoll kann angepasst werden, während die Droge-Entwicklungs-Pipeline vom Screening, hit Selektierung durch Überwachung der Ziel Engagement in Vivo.

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Protokoll

(1) Aussaat von Zellen

Hinweis: Für einen allgemeinen Überblick über den Workflow siehe Abbildung 1. Eine detaillierte Liste der Materialien und Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung.

1. Vor der Aussaat der Zellen, die Bohrungen Sie mit einem standard Bohrer im Rahmen des schwarzen 384-Well Assay Bildplatten, wird unter der Platte später während der Heizung Schritt eingeschlossenen Luftbläschen zu vermeiden. Kunststoffpartikel Eingabe der Brunnen während dieses Schrittes zu vermeiden und sterile Bedingungen zu halten, die Platten mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie zu versiegeln oder die Platte vor dem Bohren in einer Gewebekultur Haube abdecken. Es genügt in der Regel 3 Löcher mit einem Durchmesser von 3,5 mm auf jeder Seite der Platte (kurze Seite).
2. Vorbereiten einer Laminar-Flow Bank durch Reinigung mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie nach standard aseptischen Gewebekultur Techniken Medien aus Zelle Kolben oder Schale. Waschen Sie Zellen mit 5-10 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 2 mL Trypsin in den Kolben. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C, bis die A-431 Zellen lösen. Zählen Sie den Zellen entweder mit einem Zählkammern oder Zelle Zähler. Bereiten Sie eine Zellsuspension von 50.000 Zellen/mL in Kulturmedium.
3. 40 µL Zellsuspension (was eine endgültige Zelldichte von 2.000 Zellen pro Well) in jede Vertiefung eines Test-Platte mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder eine Multi-Channel-pipettieren, je nach Umfang des Experiments zu verzichten. Kurz bewegen die Platte von einer Seite zur anderen Zellen gleichmäßig auf der Unterseite der Platte verteilen.
4. Zur Minimierung von Plattenrand Effekte ermöglichen Sie die Zellen am unteren Rand der Assay-Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf der Rückseite der Laminar-Flow-Haube zu begleichen. Legen Sie die Platte in einen Kunststoffbehälter mit feuchten Papiertüchern in feuchter Atmosphäre zu gewährleisten. Wischen Sie vor dem Einsatz den Kunststoffbehälter mit 70 % Ethanol.
5. Inkubieren Sie Feld mit der Assay-Platte für 2-3 Tage bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einem konventionellen befeuchteten Inkubator. Konfluenz der Zellen bis zu 50-75 %, zu überwachen, wie durch Sichtkontrolle mit einem Lichtmikroskop beurteilt.

(2) zusammengesetzte Behandlung

1. Am Tag des Experiments Aspirieren des Mediums aus jeder gut mit einer Platte Scheibe. Legen Sie die Platte auf die Platte Scheibe und wählen Sie das Ziel-Programm. Wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist, kann die Flüssigkeit entfernt werden, durch Umdrehen der Platte mit einem schnellen Hand Twist über eine Abfallfach oder Waschbecken. Vollständige Entfernung der Flüssigkeit ist wichtig für eine gute Leistung. Überschüssige Flüssigkeit wird dann durch Abtupfen mit einem Papiertuch entfernt.
2. Fügen Sie 30 µL verdünnt, um die angeeigneten Konzentration im Zellkulturmedium mit automatisierten Dosierung oder einer Mehrkanal-Pipette je nach Umfang des Experiments Verbindungen hinzu. Stellen Sie sicher um eine Negative (DMSO) und positiv (bekannte Liganden) Kontrolle mehrere Bohrungen auf jeder Assay-Platte hinzuzufügen. Da dies eine thermische Verschiebung-Assay ist, ist es notwendig, dass die Compoundkonzentration übersteigt die Dissoziationskonstante Eiweißstabilisierung zu beobachten. So eine grobe Richtlinie für Compoundkonzentration ist 50 - 100 Mal den IC₅₀, aber mehr Detail-Beschreibungen für zusammengesetzte Konzentrationen finden sich in Abschnitt Diskussion.
   Hinweis: DMSO Verträglichkeit der Zelllinien sollte vor dem Experiment getestet werden.
3. Abdichtung die Verbindung behandelt Assay-Platte mit einer atmungsaktiven Platte verschließen und 30 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.

3. Wärme Herausforderung

1. Stellen Sie zuerst das Wasserbad in die gewünschte Temperatur. Beachten Sie, dass die endgültige Temperatur, die in die Vertiefungen der Assay-Platte erreicht ist die Endtemperatur im Wasserbad abweichen kann. Untersuchen Sie den Versatz im Voraus mit einem Dummy-Platte und Thermoelement-Thermometer. Es dauert in der Regel 30 Minuten für das Bad auf der gewünschten Temperatur zu stabilisieren.
2. Um sicherzustellen, dass die gewünschte Temperatur, in den Vertiefungen der Assay-Platte während der Heizung Schritt erreicht ist, bereiten Sie eine unverschlossene Dummy-Platte mit dem gleichen Volumen des Mediums als der Assay-Platte.
3. Entfernen Sie der Assay-Platten aus dem Inkubator. Die atmungsaktive Dichtung abnehmen und neu versiegeln der Assay-Platte mit der Verbindung-behandelten Zellen mit einer engen Klebstoff Alufolie um sicherzustellen, dass kein Wasser in den Brunnen beim anschließenden Erhitzen im Wasserbad eindringen wird. Stellen Sie sicher, dass die Bohrlöcher in Kennzeichenrahmen zugänglich sind.
4. Platzieren der Assay-Platte und die Dummy-Platte im Wasserbad mit der Unterseite der Platte schräg in Richtung der Wasseroberfläche jede verbleibende Luft heraus unter den Platten zu erzwingen.
5. Überwachen Sie die Temperatur im Inneren der Brunnen einer neuen Dummy-Platte mit einem Thermoelement-Thermometer.
6. 3 Minuten erhitzen Sie die Assay-Platte im Wasserbad. Sofortüberweisung-Assay und Dummy-Platte zu einem anderen Wasserbad mit Raum-temperierten Wasser für 5 Minuten abkühlen lassen. Der Assay-Platte ist nun bereit zur Weiterverarbeitung.

4. Fixierung

1. 10 µL 16 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) direkt an der Assay-Platte mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren zu verzichten. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   Hinweis: Einige Fixiermittel werden als krebserregend eingestuft und institutionellen Sicherheitsvorschriften beachtet werden.
2. Aspirieren Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen mit 300 µL PBS mit einer Platte Waschmaschine. Legen Sie die Platte auf die Platte Scheibe und wählen Sie das Ziel-Programm.
   Hinweis: Dieses Verfahren ist mit einem Überlauf-Protokoll auf der Platte Unterlegscheibe in der Flüssigkeit gleichzeitig verzichtet und entfernt optimiert worden. Wenn eine Platte Scheibe oder ähnliches Verfahren nicht verfügbar ist, kann die Waschschritt alternativ manuell durchgeführt werden.
3. Manuellen Waschverfahren: Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte mit einem schnellen Hand Twist über eine Abfallfach oder Waschbecken. Vollständige Entfernung der Flüssigkeit ist wichtig für eine gute Leistung. Fügen Sie 80 µL PBS mit einer Mehrkanal-Pipette und invertieren Sie die Platte wieder wie oben beschrieben, wiederholen Sie den Waschvorgang zwei Mal. Tupfen Sie nach dem letzten Waschen die Platte gegen saubere Papiertücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

5. Permeabilisierung

1. Fügen Sie 20 µL von 0,1 % (V/V) NP-40 in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
2. Alternativ erfassen Sie gegebenenfalls gelten Sie ein Antigen Abruf Protokoll, z. B.:
   1. Der Brunnen mit einem Mehrkanal-Pipettieren 20 µL 1 % SDS hinzufügen. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren Sie und waschen Sie nach dem gleichen Verfahren beschrieben (Schritt 4.2).
   2. 80 μl 10 mM Glycin bei pH 7,2 hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die Glycin-Lösung unter Verwendung einer Platte Unterlegscheibe durch Platzierung auf der Platte Scheibe und zum Auswählen des Protokolls streben. Siehe Hinweise im 2.1 und 4.2, wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist.

6. Sperrung

1. Der Brunnen mit einem Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren fügen Sie 15 µL 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA hinzu) in PBS. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C mit einer Aluminium-Platte Folienversiegelung.

(7) Primärantikörper

1. Aspirieren Sie die blockierende Lösung unter Verwendung einer Platte Scheibe durch Platzierung auf der Platte Scheibe und zum Auswählen des Protokolls streben. Siehe Hinweise im 2.1 und 4.2, wenn eine Platte Scheibe nicht verfügbar ist.
2. Fügen Sie 10 µL Primärantikörper entsprechend verdünnt in 1 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C mit einer Aluminium-Platte Folienversiegelung.

(8) sekundäre Antikörper

1. Aspirieren Sie die primären Antikörper-Lösung und waschen Sie die Brunnen nach demselben Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
2. Fügen Sie 10 µL Alexa 488 Sekundärantikörper entsprechend verdünnt in 1 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer. 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Dichtplatte mit einem selbstklebenden Aluminium-Folie-Siegel um vor Licht zu schützen.
   Hinweis: Schützen Sie Platte aus Licht während dieser und weiteren Schritten.

(9) nukleare Färbung und Zelle Maske

1. Fügen Sie 10 µL des nuklearen Farbstoff verdünnt, um 0,05 mg/mL mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. Weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Aspirieren Sie Sekundärantikörper und Hoechst Lösung und waschen Sie die Brunnen, die mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2).
3. Fügen Sie 10 µL der Zelle Maske verdünnt auf 200 ng/mL mit PBS-Puffer in die Vertiefungen mit einem Mehrkanal-pipettieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Aspirieren Sie die Zelle-Maske-Lösung und waschen Sie der Brunnen mit dem gleichen Verfahren wie beschrieben (Schritt 4.2) zu.
5. 60 µL PBS in alle Vertiefungen mit der Platte Scheibe, ein Großteil Reagenz Dispenser oder ein Mehrkanal-Pipettieren zu verzichten, und die Platten mit einer selbstklebenden Aluminiumfolie verschließen.

10. Bild Erfassung und Analyse

1. Die Aufnahmen auf einen hohen Inhalt Imager mit 3 Leuchtstoffröhren Kanäle: DAPI (387/447), GLP (472/520) und TexasRed (562/624). 4 Bilder pro Bohrloch mit 10 X-Objektiv zu erwerben. Verwenden Sie automatisierte Laser-Autofokus und wenden Sie binning 2 während der Akquisition an. Speichern von Bildern als 16-Bit, graue Skala TIFF-Dateien mit Metadaten.
2. Bilder mit verfügbare Software zu analysieren. Zellgrenzen mit einer Zelle Scoring-Algorithmus mit DAPI (Kern) und TexasRed (Zytoplasma) zu identifizieren.
3. Mittlere Intensität für alle erworbenen Wellenlängen für weitere Datenanalyse zu extrahieren.
4. Berechnen Sie den Z-Faktor um die Robustheit des Tests zu gewährleisten.
5. % Stabilisierung anhand der folgenden Formel berechnen: 100 * (1-(gut Intensität – mittlere gut Intensità ¤ t Negativkontrolle) / (mittlere Intensität positive Kontrolle-Durchschnitt Intensität Negativkontrolle)). Hier negative Kontrolle ist DMSO und Positivkontrolle Referenzstoff. Da die maximale Stabilisierung zwischen Verbindungen kann variieren und in der Tat größer sein als die positive Kontrolle für ITDRF Kurven, sind die maximalen und minimalen Stabilisierung Intensitäten für jede Verbindung manchmal anstelle der Intensitätswerte des Kontroll-Vertiefungen verwendet. .

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Ergebnisse

Das Protokoll gemäß Abbildung 1 beschreibt die grundlegenden Workflow für die Ausführung CETSA Assays auf adhärente Zellen mit Erkennung der verbleibenden lösliche Protein von hoher Content Imaging. Dieser Workflow kann durch Bearbeiten des Layouts der Platte der Verbindungen oder Reagenzien¹⁴leicht an allen Phasen der Assay-Entwicklung angepasst. Wir ausführlich die erwarteten Ergebnisse für mehrere erwartet folgenden Fällen ...

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Diskussion

Wie im Abschnitt "Ergebnisse", gibt es mehrere wichtige Schritte des Verfahrens. Erstens ist es wichtig, eine qualitativ hochwertige Affinität Reagenz zu identifizieren. Es wird empfohlen, eine kleine Bibliothek von Antikörpern für jedes gewünschte Ziel screening. Nachdem Sie ein primärer Antikörper ausgewählt hat, ist es auch wichtig zur Validierung des Systems für eine Reihe von verschiedenen Bindungsstellen des Protein-Ziel gegebenenfalls. Counter-Screening für Verbindungen, die mit dem Assay-Signal stören, ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System