JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تركيز هذه الدراسة لإثبات هذه التقنية إيمونوستينينج والتصور الجامع-جبل كطريقة مثالية لتصوير ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البنية والخلوية المكون.

Abstract

الأنسجة الدهنية جهازا هاما ايضية مع اللدونة العالية والاستجابة للمحفزات البيئية والحالة الغذائية. على هذا النحو، تم وضع تقنيات مختلفة لدراسة مورفولوجية وبيولوجيا الأنسجة الدهنية. مع ذلك، تقتصر أساليب التصور التقليدي لدراسة الأنسجة في 2D المقاطع، الفشل في القبض على بنية ثلاثية الأبعاد للجهاز كله. نقدم هنا كل جبل تلطيخ، أسلوب إيمونوهيستوتشيميستري الذي يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية سليمة مع خطوات الحد الأدنى من المعالجة. ومن ثم، يتم الاحتفاظ بهياكل adipocytes والمكونات الخلوية الأخرى دون تشويه، تحقيق التصور 3D الأكثر تمثيلاً من الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الجامع-جبل تلطيخ مع النسب تتبع أساليب لتحديد الخلية مصير القرارات. ومع ذلك، هذه التقنية على بعض القيود لتوفير معلومات دقيقة فيما يتعلق بأجزاء أعمق من الأنسجة الدهنية. للتغلب على هذا التحديد، تلطيخ كل جبل يمكن أن تكون كذلك جنبا إلى جنب مع الأنسجة تبادل تقنيات إزالة التكتم الأنسجة والسماح للتصور الكامل لتشريح الأنسجة الدهنية كاملة باستخدام ورقة الضوء الفلورسنت الفحص المجهري. ولذلك، يمكن التقاط دقة أعلى وتمثيل أكثر دقة لهياكل الأنسجة الدهنية مع المزيج من هذه الأساليب.

Introduction

الأنسجة الدهنية جهازا أساسيا لتخزين الطاقة وتتميز بتجديد حيوية والتوسع غير محدود تقريبا1. بالإضافة إلى التوازن الطاقة، الأنسجة الدهنية أيضا دوراً أساسيا في إفراز هرمون أديبوكينيس ما يزيد على 50 تعدل وظيفة التمثيل الغذائي في الجسم كله2. وقد الأنسجة الدهنية الهندسة المعمارية المتنوعة وتضم مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك adipocytes ناضجة والليفية، وخلايا بطانية، الخلايا المناعية و الخلايا السلف adipocyte3. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن السمنة وغيرها الخلل الأيضي يمكن أن يغير كثيرا من وظيفة الأنسجة الدهنية ولها المكروية، التي تشمل ولكن لا تقتصر على توسيع adipocytes، تسلل الخلايا التحريضية (مثلاً، الضامة)، و3من خلل الأوعية الدموية.

التقنيات المورفولوجية التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيونينج تثبت العديد من القيود في دراسة البيولوجيا الدهنية مثل خطوات المعالجة الكيميائية الطويلة، التي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة انكماش وهيكل التشويه3، 4. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات 2D غير كافية لمراقبة التفاعلات بين الخلايا التي تمارسها أنواع الخلايا المختلفة، حيث أن المقاطع التي تم الحصول عليها محدودة إلى مناطق أصغر من الأنسجة كامل3. أساليب التصوير الفلورسنت مقارنة بالتقليدية، يلطخ كل جبل لا يتطلب خطوات إضافية الغازية، مثل التضمين وتمزيقها والجفاف؛ وهكذا، حتى تتجنب مشكلة تناقص خصوصية جسم. على هذا النحو، وطريقة بسيطة وفعالة لتصوير الأنسجة الدهنية، مع الحفاظ على أفضل مورفولوجيا adipocyte و هيكل الأنسجة الدهنية عموما5. ولذلك، كل جبل تلطيخ كما أنشئت تقنية إيمونولابيلينج سريعة وغير مكلفة للمحافظة على الأنسجة الدهنية البنية ثلاثية الأبعاد1،6،،من78.

ومع ذلك، على الرغم من المحافظة على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية مع استخدام تلوين كل جبل، هذا الأسلوب لا يزال غير قادر على تصور الهياكل الداخلية تحت سطح الأنسجة الدهنية. وقد أنشأت مؤخرا عدة دراسات9،10 الأنسجة تبادل التقنيات جنبا إلى جنب مع الجامعة-جبل إيمونولابيلينج1،6 للسماح للتصور 3D شاملة داخل الأنسجة الدهنية. على وجه الخصوص، كانت تصور الشبكات العصبية والمفرج كثيفة في الأخيرة دراسات9،10،،من1112 مع تصوير حجم ثلاثي الأبعاد. في الواقع، دراسة اللدونة العصبية والأوعية الدموية للأنسجة الدهنية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة ضروري لدراسة عن علم الأحياء. تمكين إيمونولابيلينج تصوير ثلاثي الأبعاد لإزالة الأنسجة أجهزة مسح مذيب (إيديسكو +) عملية تتألف من الميثانول المعالجة المسبقة، إيمونولابيلينج، وإزالة الأنسجة التكتم مع الكواشف الكيميائية العضوية الميثان (DCM ) وخماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) ديبينزيل13،14. بجعل الأنسجة الدهنية شفافة تماما، تمثيل أكثر دقة للتشريح داخل الأنسجة مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية ويمكن الحصول على9،10. إيديسكو + مزايا في هذا ومتوافق مع مختلف الأجسام المضادة والصحفيين الفلورسنت11،14، وقد أثبت نجاحا في العديد من الأجهزة وامبريوس حتى14. غير أن القيد الرئيسي وقت حضانة طويلة، التي تحتاج إلى 18 إلى 20 يوما لإكمال هذه التجربة كاملة.

تطبيق هام آخر لتلطيخ كل جبل هو تصور مصير الخلية في تركيبة مع نظام تتبع نسب. تتبع النسب هو وسم الجينات/علامة معينة في خلية التي يمكن أن تنتقل إلى كافة الخلايا الوليدة، وهو يحافظ على مر الوقت15. على هذا النحو، هو أداة قوية يمكن استخدامها لتحديد مصير أي خلية ذرية15. منذ التسعينات، أصبح النظام المؤتلف Cre-لوكسب نهج قوية لتتبع النسب في معيشة الكائنات الحية15. عندما يتم عبرت خط ماوس تعرب لجنة المساواة العرقية، إنزيم الحمض النووي recombinase، مع آخر سطر الماوس معربا عن مراسل المجاورة لتسلسل لوكسب-توقف-لوكسب، هو بروتين مراسل أعرب15.

لتلوين كل جبل، استخدام الصحفيين متعدد الألوان الفلورية مناسبة للتصوير من الأنسجة الدهنية لأنه يسمح لتدخل الحد الأدنى مع الأنشطة داخل الخلايا من adipocyte16. إلا أن الصحفيين التقليدية عادة وصمة عار السيتوبلازم، مما يجعل من الصعب تتبع نسب adipocytes بيضاء، التي حدت من هيولى المحتوى17. للتغلب على هذه المشكلة، استخدام الغشاء زمنياً الفلورسنت تدتوماتو/غشاء اجفب (mT/mG) مراسل ماركر أداة مثالية. يتم التعبير عن تدتوماتو المستهدفة للغشاء في الخلايا Cre سالب18. عند ختان لجنة المساواة العرقية، ويحدث التحول إلى التعبير عن اجفب المستهدفة للغشاء، مما يجعل هذا المراسل مناسبة لتتبع نسب adipocyte المتكفل17،18 (تكميلية الشكل رقم 1).

والغرض من هذه الورقة هو تقديم بروتوكول مفصل لتلطيخ كل جبل، وإظهار كيف أنه يمكن دمجها مع تقنيات أخرى لدراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء من الأنسجة الدهنية. أمثلة اثنين من الطلبات المبينة في هذا البروتوكول يتم استخدامه مع خطوط الماوس مراسل 1) متعدد الألوان لتحديد أصول مختلفة adipocytes و 2) الأنسجة المقاصة لمزيد تصور أربوريزيشن العصبية في الأنسجة الدهنية البيضاء (وات).

Protocol

كافة البروتوكولات الحيوانات التجريبية أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان بمركز" فينوجينوميكس (TCP) تتفق مع معايير "المجلس الكندي للعناية بالحيوان". تم الإبقاء على دورات الضوء/الظلام 12-ح الفئران وتوفير حرية الوصول إلى المياه والغذاء. تجربة شهر 7 الفئران الذكور C57BL/6J قديمة استخدمت في تلطيخ كل جبل.

ملاحظة: الأقسام من 1 إلى 2 بالترتيب الزمني، مع القسم 3 يجري خطوة اختيارية الحق بعد القسم 1. يمكن أن يؤديها القسم 4 لتحليل كثافة adipocyte الحجم والأوعية الدموية بعد انتهاء القسم 2.

1-مواد التحضير وعزل الأنسجة

  1. إعداد الطازجة 1% بارافورمالدهيد (PFA) المخفف في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتثبيت الأنسجة. تحضير السطح النطاق 0.3% المخفف في برنامج تلفزيوني 1 x (المشار إليها كبرنامج تلفزيوني-0.3T) للأنسجة اللاحقة الغسيل الخطوات.
    ملاحظة: لكل الأنسجة، وإعداد ما يقرب من 1.5 مل من 1% منهاج العمل التأكد من الغمر الكامل. قد ازداد حجم التثبيت أو انخفضت تبعاً لحجم الأنسجة.
    تنبيه: هذه الخطوة الخطرة، كمنهاج عمل بيجين التآكل والسامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات النتريل، معطف مختبر، الأحذية، ونظارات واقية) والتعامل مع غطاء دخان.
  2. Euthanize الحيوانات وفقا لإجراءات معتمدة (مثلاً، والتفكك عنق الرحم و/أو الخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون). دون تأخير، تشريح مستودعات (مثلاً، والأنسجة الدهنية البيضاء الاربية أو الأنسجة الدهنية بيريجونادال الأبيض) المطلوب من الأنسجة الدهنية18.
  3. مع مقص التشريح، قطع الأنسجة على 100 × 15 ملم2 طبق بتري إلى قطع حوالي 0.5 – 1 سم في الحجم، وتزج لهم في أنابيب ميكروسينتريفوجي مليئة 1% منهاج عمل بيجين. الحفاظ على الجليد.

2-كل-جبل تلطيخ من الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. بعد الانتهاء من التشريح، نقل عينات الأنسجة في 1% منهاج عمل بيجين من الجليد غرفة درجة الحرارة (RT) ح 1، ومن ثم نقل الأنسجة إلى لوحة ثقافة خلية 12 أو 24 جيدا للغسيل أسرع.
  2. تغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني-0.3T، 3 مرات لمدة 5 دقائق في RT على شاكر كل إمالة في 22 °، مع 20 – 25 يميل كل دقيقة بالسرعة.
    ملاحظة: استخدم هذا الميل والسرعة لجميع الخطوات اللاحقة التي تنطوي على استخدام شاكر.
    ملاحظة: في حالة استخدام خط ماوس مراسل متعدد الألوان مثل mT/mG وإضافية تلطيخ جسم ليست هناك حاجة، والأنسجة جاهز للفحص المجهري بعد الخطوة 2، 2.
  3. إضافة 0.5-1 مل حظر المخزن المؤقت (5% مصل الحيوان تضعف في برنامج تلفزيوني-0.3T). وضع اللوحة على شاكر واحتضانها ح 1 في الرايت
  4. نضح عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأساسي المخفف في برنامج تلفزيوني-0.3T مع 1% مصل الحيوان.
  5. وضع لوحة على شاكر عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. وفي اليوم التالي يغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني-0.3T 3 مرات على 5 دقائق كل في الرايت
  7. استخدام الأجسام المضادة الثانوي المناسب المخفف في برنامج تلفزيوني-0.3T. إضافة 0.5-1 مل جسم ثانوي حلول لكل بئر. التفاف اللوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان على شاكر لمدة 1 ساعة في الرايت
    ملاحظة: يؤدي إلى تمييع جسم الثانوية في الظلام لمنع فوتوبليتشينج.
  8. بعد حضانة جسم الثانوية، يغسل مع برنامج تلفزيوني-0.3T مرتين لمدة 5 دقائق، كل منهما في الرايت صورة العينات إذا كان ليس هو المطلوب وصمة دهن محايدة. إذا كان تصور قطرات الدهن يلزم استخدام الدهن محايدة وصمة عار، يغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x (دون الفاعل غير أيونى) مرتين، لمدة 5 دقائق في كل.
  9. وبعد خطوات الغسيل، احتضان مع وصمة عار الدهن محايدة المخفف بعامل إضعاف 1:1500 في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في الرايت الأنسجة جاهزة الآن للفحص المجهري. لتصوير المستقبل، يمكن تخزين الأنسجة في هذا الحل في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: التصوير نوعية تتناقص بمرور الوقت؛ ومن ثم فأفضل وقت للتصوير في غضون أيام 1 أو 2.
  10. استخدام الملقط، تكمن في الأنسجة شقة في 24 × 60 ملم ² زجاج ساترة ووضعه على نظام مجهر مقلوب ليزر [كنفوكل].
  11. إذا كان المطلوب هو تلطيخ من الأنوية مع DAPI، إضافة 1-2 قطرات من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI تماما تغرق الأنسجة ومنعها من التجفيف.
  12. للحصول على صور للجامعة-جبل الملون الأنسجة في عدة طائرات المحورية، أداء Z-رزمة من 100-150 ميكرومتر في العمق مع 4 – 6 ميكرومتر خطوة الحجم في التكبير المطلوب.

3-الأنسجة المقاصة واستخدام إيمونولابيلينج إيديسكو +

ملاحظة: هذا البروتوكول على أساس الإجراءات المنشورة سابقا9،،من1019.

  1. التثبيت والميثانول ما قبل المعالجة
    1. احتضان الأنسجة في 4% المخفف منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل.
      ملاحظة: ترك الأنسجة في أنابيب 2 مل لجميع العلاجات التالية حتى التصوير.
    2. في اليوم التالي، تغسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات، لمدة ساعة واحدة كل على شاكر في الرايت
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينة بين عشية وضحاها في الرايت أو 4 درجات مئوية.
    3. يذوي الأنسجة في RT في 20% و 40% 60% 80% ميثانول، فيما بعد، لكل 1 ح. يذوي في 100 ٪ الميثانول في RT 1 ساعة، ثم نقل الأنسجة جديدة 100 ٪ الميثانول واحتضان في ج 4 ح 1.
      ملاحظة: يؤدي إلى تمييع الميثانول في الماء المقطر. أثناء الاحتضان الميثانول، ليست هناك حاجة لوضع العينات على شاكر طالما عينات الأنسجة مغمورة.
      تنبيه: هذه الخطوة غير خطرة، كما الميثانول السامة. أنها شديدة الاشتعال عند فتح النيران. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان. تخزين الميثانول بعيداً عن الاشتعال وفي سلامة القابلة للاشتعال مجلس الوزراء.
    4. بليتش الأنسجة مع 5% فوق أكسيد الهيدروجين (H2O2؛ المجلد 1 من 30 ٪ ح2س2 المخفف في 5 مجلدات من الميثانول 100 ٪) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      تنبيه: 30% بيروكسيد الهيدروجين خطرة جداً على الجلد، والاتصال بالعين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان.
    5. ترطيب الأنسجة في RT في 80%، 60%، 40%، و 20% والميثانول و 1 x PBS، فيما بعد، لكل 1 ساعة.
    6. يغسل مع السطح النطاق 0.2% المخفف في برنامج تلفزيوني x 1 مرتين، ل 1 ح في شاكر في الرايت
  2. إيمونولابيلينج
    ملاحظة: تعبئة أنابيب 2 مل تحتوي على الأنسجة إلى الجزء العلوي من الأنبوب مع الحل المستخدم في كل خطوة لمنع أكسدة الأنسجة حالما يبدأ إيمونولابيلينج، حتى يتم إكمال تطهير.
    1. بيرميبيليزي الأنسجة التي تفرخ لهم في حل 1 x PBS والفاعل النطاق 0.2%، 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وجليكاين 0.3 متر عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة يومين.
      ملاحظة: فترة الحضانة القصوى للخطوة permeabilization 37 درجة مئوية 2 يوما.
    2. كتلة الأنسجة في حل 1 × برنامج تلفزيوني والفاعل النطاق 0.2%، 10% [دمس]، المصل حمار 5% وكتلة Fc 1% عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة يومين.
      ملاحظة: فترة الحضانة القصوى لخطوة حظر 2 يوما.
    3. احتضان الأنسجة في أجسام الأولية من مصلحة في التوصل إلى حل لبرنامج تلفزيوني 1 x، 0.2% بوليسوربيت 20، 10 الهيبارين ميكروغرام/مل و [دمس] 5% 5% حمار المصل في 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة 4 أيام.
    4. يغسل مع 1 × برنامج تلفزيوني و 0.2% بوليسوربيت 20 و 10 ميكروغرام/مل الهيبارين على شاكر في الرايت خمس مرات، كل من ح 1.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف مؤقت ترك عينات بين عشية وضحاها في الرايت
    5. احتضان الأنسجة بالجسم المضاد الثانوي في إيجاد حل لبرنامج تلفزيوني 1 x، 0.2% بوليسوربيت 20، 10 ميكروغرام/مل الهيبارين، و 5% حمار المصل في 37 درجة مئوية في منضدية شاكر مدارية لمدة 4 أيام.
      ملاحظة: من الخطوة 3.2.5، جميع العينات تحتاج إلى أن تكون ملفوفة برقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج جسم الثانوية.
    6. غسل الأنسجة في حل 1 x برنامج تلفزيوني، 0.2% بوليسوربيت 20، و 10 ميكروغرام/مل الهيبارين على شاكر في الرايت خمس مرات، لمدة 2 حاء.
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينات بين عشية وضحاها في الرايت
  3. إزالة الأنسجة الدهنية البيضاء وتصوير حجم الأنسجة
    1. يذوي الأنسجة الواردة في أنابيب 2 مل بحضانة في 20%، 40%، 60%، و 80 ٪ الميثانول، فيما بعد، كل منهما لمدة ساعة واحدة في الرايت ثم يذوي العينات في 100 ٪ الميثانول مرتين في الرايت
      ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينات الخاصة بك في الميثانول 100% بين عشية وضحاها في الرايت
    2. احتضان الأنسجة بمزيج أحجام DCM 2 بحجم 1 من الميثانول ح 3 في RT على شاكر.
      ملاحظة: DCM قابلة للاشتعال. تأكد من الأنابيب محكم مختومة لمنع التبخر.
      تنبيه: هذه الخطوة الخطرة. • قرار مجلس الوزراء السمية عند استنشاقه. التعرض لفترة طويلة يمكن أن تسبب الحروق الكيميائية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات النتريل، معطف مختبر، الأحذية، ونظارات واقية). استخدام غطاء دخان.
    3. احتضان الأنسجة في DCM 100% مرتين، لمدة كل 15 دقيقة على شاكر في الرايت
    4. احتضان في 100% قسم تعزيز الحدود في الرايت حتى تصوير وتخزين العينة. قبل التصوير، وعكس الأنابيب عدة مرات لخلط الحلول.
      ملاحظة: ملء تماما أنابيب مع قسم تعزيز الحدود لمنع الأكسدة، التي يمكن أن تؤدي في الأنسجة غير ناجحة المقاصة. لا تهز الأنابيب خلال الحضانة قسم تعزيز الحدود.
      تنبيه: هذه الخطوة الخطرة. قسم تعزيز الحدود السامة. يمكن أن يسبب تهيج العينين والجلد. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان.
    5. صورة عينة الأنسجة كاملة مع مجهر ضوء الذي يطابق الانكسار من قسم تعزيز الحدود المذيبات العضوية. أداء التراص Z في التكبير المطلوب وحجم الخطوة للنسيج كله.

4-أمثلة لتحليل البيانات من كل جبل الملون صور الأنسجة باستخدام إيماجيج

ملاحظة: انظر https://imageJ.nih.gov/ij/download.html للحصول على إرشادات التحميل والتثبيت.

  1. التحديد الكمي لكثافة الأوعية الدموية (الملحق الرقم 2)
    1. استيراد الصور المحفوظة فقط القناة مع الأوعية الدموية إيمونوستينينج على إيماجيج.
      ملاحظة: يجب أن تكون الصور للقياس الكمي متسقة من حيث الإجراء المصبوغة وشرط الحصول على الصورة. وينبغي استخدام الكواشف متطابقة. زمن التعرض، كثافة، والتكبير كما ينبغي ما يعادل في عملية التصوير20.
    2. تحويل لون الصورة إلى أبيض وأسود للتحديد الكمي كثافة الأوعية الدموية. للقيام بذلك، ضمن علامة التبويب "صورة" ، اختر الأمر "ضبط" ، ثم الخيار "لون عتبة" . في "لون عتبة" عرض مربع واختر "خلفية داكنة"20 وحدد "B & W" تحت "عتبة اللون".
    3. لقياس النسبة المئوية لمجال الأوعية الدموية الإشارات الخلفية، حدد علامة التبويب "تحليل" , ثم الأمر "تحليل الجزيئات" . ضمن عرض "تحليلالجزيئات"، حدد خيارات "نتائج واضحة" و "تلخيص" . انقر فوق "موافق".
    4. نسخ ولصق القيمة للمنطقة النسبة المئوية ضمن علامة التبويب ملخص إلى جدول بيانات لتحليل. النسبة المئوية للمساحة سوف تبين كثافة الأوعية الدموية. كرر الخطوات 4.3.1–4.3.4 لكل صورة فردية.
  2. التحديد الكمي ل adipocyte حجم21 (التكميلية الرقم 3)
    1. استيراد الصور المحفوظة في adipocytes على ImageJ.
    2. لتعيين حجم الصورة، قياس طول الجدول في بكسل عن طريق تتبع خط للمقياس بمسافة معروفة في الصورة باستخدام أداة التحديد الخط المستقيم. ضمن علامة التبويب "تحليل" ، اختر الأمر "تعيين مقياس" . سيتم تلقائياً حساب المسافة بين السطر الذي تم تتبعه قبل بالبكسل.
    3. سوف يظهر مربع عرض "تعيين مقياس" . أدخل المسافة المعروفة ووحدة الطول. حدد "العالمي" لتطبيق جدول تعيين لكل الصور المستوردة وانقر فوق "موافق".
    4. اختيار تحديد المنطقة كالأسلوب للقياس، ضمن علامة التبويب "تحليل" الأمر "تعيين قياسات" . سوف تظهر قائمة بخيارات مختلفة للقياسات. حدد الخيار "المنطقة" وانقر فوق "موافق".
    5. باستخدام أداة التحديد اليدوي، تتبع محيط adipocyte كل الاهتمام. ضمن علامة التبويب "تحليل" ، اختر الأمر "التدبير (Ctrl + M)" ، ومنطقة adipocyte ستظهر. كرر هذا الإجراء لأخرى adipocytes في الصورة.
      ملاحظة: لضمان دقة القياسات، استخدام صور متعددة للقياس الكمي.
    6. نسخ ولصق قياسات المجال في جداول بيانات لتحليل البيانات كذلك.

النتائج

بسبب هشاشة الأنسجة الدهنية، الأساليب التي تنطوي على عدة خطوات المعالجة وتمزيقها يمكن أن تؤدي إلى تشوهات في الأنسجة الدهنية مورفولوجيا3 (الشكل 1A). ومع ذلك، تلطيخ كل جبل يمكن الحفاظ على مورفولوجية adipocytes، ضمان التفسير الدقيق للنتائج (الشكل 1B).

Discussion

على الرغم من أن تعود بفوائد التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيون لمراقبة الهيكل داخل الخلايا، يلطخ كل-جبل يقدم وجهة نظر مختلفة في الأنسجة الدهنية للبحوث، التي تمكن 3D التصور الخلوي هندسة الأنسجة المجهزة الحد الأدنى.

من أجل نجاح أداء الجامعة-جبل تلطيخ، الاقتراحات ال?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) من كندا، والطيار ومنحة دراسة الجدوى من بانتنغ وأفضل السكري المركز (بدك)، "الصندوق بدء سيككيدس" إلى ح-ك. س.، "برنامج مركز البحوث الطبية" (2015R1A5A2009124) عبر الوطنية البحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، وتخطيط المستقبل إلى ي-ر. ك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
LipidToxLife TechnologiesH34477
PECAM-1 primary antibodyMilliporeMAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibodyMilliporeAB152, AB1542
DAPI stainBD Pharmingen564907
Nikon A1R confocal microscopeNikonConfocal microscope
Ultramicroscope ILaVision BioTecLight sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodiesJackson ImmunoResearchWavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32BioSciences553141
DichloromethaneSigma-Aldrich270997
Dibenzyl-etherSigma-Aldrich33630
MethanolFisher ChemicalA452-1
30% Hydrogen PeroxideBIO BASIC CANADA INCHC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GlycineSigma-AldrichJ7126
HeparinSigma-AldrichH3393
Lectin kit I, fluorescein labeledVECTOR LABORATORIESFLK-2100
F4/80Bio-RadMCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPIVECTOR LABORATORIESH-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)

References

  1. Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
  2. Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
  3. Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
  4. Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
  5. Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  6. Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  7. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
  8. Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
  9. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  10. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  11. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
  12. Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
  13. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  16. Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
  17. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
  20. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  21. Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
  22. Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
  23. Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
  24. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  25. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved