Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Резюме

В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.

Аннотация

Жировой ткани является важным органом метаболизма с высокой пластичностью и реагировать на экологические стимулы и питательный статус. Таким образом были разработаны различные методы для изучения морфологии и биологии жировой ткани. Однако обычные визуализации методы ограничены к изучению ткани в 2D разрезах, сумев захватить 3D архитектура весь орган. Здесь мы представляем в целом гора окрашивание, иммуногистохимия метод, который сохраняет нетронутыми жировой ткани морфология с минимальной обработки шагов. Следовательно без искажений, достижение наиболее представительных 3D визуализации тканей поддерживаются структуры адипоциты и других клеточных компонентов. Кроме того всего гора пятнать может сочетаться с линии методы трассировки для определения решения судьбы клетки. Однако этот метод имеет некоторые ограничения для предоставления точной информации в отношении более глубоких частях жировой ткани. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивание всей гора далее комбинируется с ткани, очистка методов для удаления непрозрачность ткани и полная визуализация анатомии всей жировой ткани с помощью флуоресцентной микроскопии свет лист. Таким образом более высокое разрешение и более точное представление о жировой ткани структуры могут быть захвачены с сочетанием этих методов.

Введение

Жировой ткани является важным органом для хранения энергии и характеризуется динамической перепланировка и практически неограниченного расширения¹. Помимо энергетического гомеостаза жировой ткани также играет важную роль в секреции гормона из более чем 50 адипокинов чтобы модулировать всего тела метаболические функции². Жировая ткань имеет различные архитектуры, состоящий из различных типов клеток, включая пожилые адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и Адипоцит прогениторных клеток³. Недавние исследования показали, что ожирение и другие метаболические дисфункции может значительно изменить функции жировой ткани и ее микроокружения, которая включает, но не ограничивается расширения адипоциты, инфильтрация воспалительных клеток (например, макрофагов) и сосудистые дисфункции³.

Обычные Морфологические методы, такие как cryosectioning и гистологии продемонстрировать некоторые ограничения в изучении жировой биология таких продолжительных химической обработки шагов, которые могут привести к ткани усадки и структура искажения^{3, 4}. Кроме того эти 2D методы недостаточны соблюдать межклеточных взаимодействий, оказываемое различных типов клеток, так как полученные разделы ограничены для небольших участков всей ткани³. По сравнению с обычными методами флуоресцентных изображений, окрашивание всей гора не требуют дополнительных инвазивных шаги, такие как встраивание, секционирование и обезвоживания; Таким образом это позволяет избежать проблемы уменьшения специфичность антитела. Таким образом это простой и эффективный метод для визуализации жировой ткани, с лучшей сохранности Адипоцит морфологии и структуре общей жировой ткани⁵. Таким образом всего гора окрашивание как метод быстрый и недорогой immunolabeling был создан для сохранения жировой ткани 3D архитектура^1,6,,78.

Однако несмотря на сохранение жировой ткани морфологии с использованием всего гора окрашивание, этот метод все еще не удается визуализировать внутренней структуры под поверхностью липидов в ткани. Несколько недавних исследований^9,10 установили очистка методов в сочетании с целом гора immunolabeling^1,6 для всеобъемлющей 3D визуализации в жировой ткани. В частности плотной сети нервных и сосудистую были подробно освещены в последние исследования^9,10,11,12 с визуализации 3D-объем. Действительно изучая пластичности нервной и сосудистой жировой ткани в различных физиологических условиях имеет важное значение для изучения его биологии. Immunolabeling с поддержкой трехмерных изображений очистки ткани растворителя очищены органов (iDISCO +) представляет собой процесс состоит из метанола предварительной обработки, immunolabeling и очистка непрозрачность ткани с органические химические реагенты Дихлорметан (DCM ) и dibenzyl эфира (DBE)^13,14. Делая жировой ткани полностью прозрачным,^9,10можно получить более точное представление об анатомии в ткани, такие как кровеносных сосудов и нервных волокон. IDISCO + имеет преимущества в том, что он совместим с различными антител и флуоресцентные журналистам^11,14, и он продемонстрировал успех в различных органах и даже embryoes¹⁴. Однако его основным ограничением является длительный инкубационный время, в котором 18-20 дней, необходимых для завершения всего эксперимента.

Другое важное применение всего гора окрашивания является визуализация судьбы клеток в сочетании с системой трассировки линии. Родословная трассировки является маркировка конкретных генов/маркера в ячейке, может быть передан все клетки дочи и сохраняется в течение времени¹⁵. Таким образом он является мощным инструментом, который может использоваться для определения судьбы клетки потомства¹⁵. Начиная с 90-х годов, КРР-LoxP Рекомбинатные системы стало мощный подход для трассировки линии в живых организмов¹⁵. Когда мышь линию, которая выражает Cre, рекомбиназа фермента ДНК, пересекается с другой мыши линии, выражая репортером, которая примыкает к loxP стоп loxP последовательность, репортер белок является выраженным¹⁵.

Для окрашивания целом гора, использование флуоресцентных многоцветной Репортеры подходит для изображений из жировой ткани, потому что она позволяет для минимального вмешательства с внутриклеточной деятельности Адипоцит¹⁶. Однако традиционные репортерам обычно пятно цитоплазме, что делает его трудно проследить родословную белых адипоциты, которые имеют ограниченный цитоплазматических содержание¹⁷. Для преодоления этой проблемы, использование мембранных привязкой флуоресцентный tdTomato/мембраны eGFP (mT/мг) репортер маркер является идеальным инструментом. Ориентированные на мембране tdTomato выражается в Cre отрицательные клетки¹⁸. После иссечения Cre происходит переключение на выражение мембраны целевой eGFP, что делает этот репортер подходит для отслеживания lineage Адипоцит прародителями^17,18 (Дополнительный рис . 1).

Цель этого документа должна предоставить подробный протокол для окрашивания целом гора и показать, каким образом оно может сочетаться с другими методами для изучения развития и физиологии жировой ткани. Двумя примерами приложений, описанных в настоящем Протоколе являются его использования с 1) многоцветная репортер мыши линий для выявления различного происхождения адипоциты и 2) ткани, очистка далее визуализировать нейронные арборизация в белой жировой ткани (Ват).

протокол

Все экспериментальных животных протоколы были утверждены Комитетом животное уход центр для Phenogenomics (TCP), соответствует стандартам Канадского совета по лечению животных. Мыши были на 12-h свет/темно циклов и обеспечен свободный доступ к воде и пище. 7 месяцев старых самцов мышей C57BL/6J были использованы в целом гора окрашивание эксперимент.

Примечание: Разделы 1-2 находятся в хронологическом порядке, с разделом 3 является необязательный шаг сразу после раздела 1. Раздел 4 может выполняться для анализа плотности Адипоцит размер и кровеносных сосудов после завершения раздела 2.

1. Подготовка материалов и тканей изоляции

1. Подготовьте свежие 1% параформальдегида (PFA) разводят в 1 x фосфатный буфер (PBS) для фиксации ткани. Подготовить 0,3% Неионогенное ПАВ, разбавленных в однократном ПБС (далее именуемые как PBS-0.3T) для последующего мытья шаги ткани.
   Примечание: Для каждой ткани, подготовить примерно 1,5 мл 1% PFA для обеспечения полного погружения. Фиксация объема может быть увеличивается или уменьшается в зависимости от размера ткани.
   Предупреждение: Этот шаг является опасной, как PFA коррозионные и токсичных. Износ личного защитного оборудования (например, перчатки нитриловые, лаборатории пальто, обувь, очки) и ручкой в зонта.
2. Усыпить животных согласно утвержденной процедуре (например, вывих шейного или удушья двуокиси углерода). Без промедления вскрыть желаемого жировой ткани депо (например, паховые белой жировой ткани или perigonadal белой жировой ткани)¹⁸.
3. Рассечение ножницами, нарезать кусочки примерно 0,5 – 1 см размер ткани на 100 x 15 мм² Петри и погрузить их в microcentrifuge трубы заполнены с 1% PFA. Держите на льду.

2. всего гора пятнать белой жировой ткани

1. После завершения рассечение переместить образцы тканей в 1% PFA от льда комнатной температуре (RT) за 1 ч, а затем перевести тканей к пластине культуры клеток 12 - или 24-также для мытья быстрее.
2. Вымойте тканей с PBS-0.3T, 3 раза по 5 минут каждый в РТ на шейкер наклонена на 22 °, с 20 – 25 наклоняется в минуту как скорость.
   Примечание: Используйте этот наклон и скорость для всех последующих шагов, связанных с использованием шейкер.
   Примечание: При использовании мыши линии многоцветной репортер как mT/мг и дополнительные Пятнать антитела не требуется, ткани готова для микроскопии после шага 2.2.
3. Добавить 0,5 – 1 мл блокирующий буфер (5% животных сыворотку разводят в PBS-0.3T). Положите пластину на шейкер и инкубировать 1 час в рт.
4. Аспирационная блокировки решение и добавить первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1% животных сыворотки.
5. Место пластину на шейкер на 4 ° C на ночь.
6. Следующий день, стирать ткани с PBS-0.3T 3 раза по 5 минут каждый в рт.
7. Использовать соответствующие вторичные антитела, разбавленных в PBS-0.3T. Добавить 0,5 – 1 мл вторичное антитело решения для каждой скважины. Оберните пластину в алюминиевой фольги и инкубировать на шейкер за 1 час на RT.
   Примечание: Разбавленных вторичных антител в темноте, чтобы предотвратить Фотообесцвечивание.
8. После вторичное антитело инкубации, мыть с PBS-0.3T дважды за 5 мин, каждый в RT. изображения образцов Если пятно липидный нейтральными нежелательно. Если визуализация липидного капель необходимо с помощью нейтральных липидные пятна, мыть с ПБС (без неионных ПАВ) дважды, за 5 мин.
9. После стирки шагов инкубации с нейтральной липидов пятно, разбавляют коэффициент разбавления 1: 1500 в PBS 1 x 30 мин в рт. Тканях теперь готовы для микроскопии. Для будущих изображений, тканях может храниться в этом растворе в 4 ° C.
   Примечание: Качественное изображение уменьшается с течением времени; Следовательно лучшее время для изображений — в течение 1 или 2 дней.
10. С помощью щипцов, заложить плашмя на 24 x 60 мм² стекла coverslip ткани и поместите его на системе Перевернутый конфокальный лазерный микроскоп.
11. По желанию окрашивания ядер с DAPI, добавьте 1-2 капли средства монтажа, содержащие DAPI полностью погрузиться ткань и предотвратить его от высыхания.
12. Для получения изображения всего гора окрашенных тканей на нескольких фокальной плоскости, выполняют Z-штабеля 100-150 мкм в глубину с 4 – 6 мкм-размер шага на желаемый масштаб.

3. ткань клиринга и Immunolabeling с помощью iDISCO +

Примечание: Этот протокол основан на ранее опубликованных процедур^9,10,19.

1. Фиксация и метанола предварительной обработки
   1. Инкубируйте ткани в 4%, что ПФА разводят в 1 x PBS на 4 ° C на ночь в 2 мл microcentrifuge трубы.
      Примечание: Оставьте ткани в 2 мл трубки для всех следующих процедур до изображений.
   2. Следующий день, стирать ткани в однократном ПБС три раза, за 1 час на шейкер на RT.
      Примечание: Этот шаг может быть точкой приостановка оставить образец ночь в РТ или 4 ° C.
   3. Впоследствии, обезвоживания тканей в РТ в 20%, 40%, 60% и 80% метанола, за 1 ч. Обезвоживает в 100% метанола в РТ за 1 час, затем передать свежие 100% метанола тканей и инкубировать в отеле 4 C 1 h.
      Примечание: Разбавляют метанола в дистиллированной воде. Во время инкубации метанола нет необходимости поставить образцы на шейкер, до тех пор, как образцы тканей погружены.
      Предупреждение: Этот шаг является опасной, как метанол является токсичным. Это очень горюч после открытого пламени. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта. Храните метанола от зажигания и легковоспламеняющиеся безопасности кабинета.
   4. Отбеливание тканей с 5% пероксида водорода (H₂O₂; 1 объем 30% H₂O₂ разводят в 5 томах 100% метанола) на ночь при 4 ° C.
      Предупреждение: 30% перекись водорода является весьма опасные на кожу и в глаза. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта.
   5. Впоследствии, увлажняет тканей в РТ в 80%, 60%, 40% и 20% метанола и ПБС, за 1 час.
   6. Вымойте с 0,2% Неионогенное ПАВ, разводят в 1 x PBS дважды, за 1 ч на шейкер на RT.
2. Immunolabeling
   Примечание: Заполните вверх 2 мл пробирки, содержащие ткани в верхней части трубки с решения, используемые в каждом шаге для предотвращения окисления тканей, как только начинается immunolabeling, до завершения очистки.
   1. Разрушения тканей путем инкубации их в раствор ПБС, неионогенные ПАВ 0,2%, 20% диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,3 М глицин при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер на 2 дня.
      Примечание: Максимальный инкубационный время 37 ° C permeabilization шаг-2 дня.
   2. Блокировать тканей в растворе 1 x PBS, неионогенные ПАВ 0,2%, 10% ДМСО, осел 5% сыворотки и блок ФК 1% при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер на 2 дня.
      Примечание: Максимальный инкубационный время блокировки шаг-2 дня.
   3. Инкубировать ткани в первичных антител интерес в раствор ПБС, 0,2% Полисорбат 20, 10 мкг/мл гепарина, 5% ДМСО и 5% осла сыворотки при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер для 4 дней.
   4. Вымойте с 1 x PBS, 0,2% Полисорбат 20 и 10 мкг/мл гепарина на шейкер на RT пять раз, каждый 1 час.
      Примечание: Этот шаг может быть точкой паузы на ночь оставить образцы в рт.
   5. Инкубировать тканей с вторичное антитело в раствор ПБС, 0,2% Полисорбат 20, 10 мкг/мл гепарина и 5% осла сыворотки при 37 ° C на настольные орбитальный шейкер для 4 дней.
      Примечание: От шага 3.2.5, все образцы должны быть обернуты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить Фотообесцвечивание вторичное антитело.
   6. Вымойте тканей в растворе 1 x PBS, 0,2% Полисорбат 20 и 10 мкг/мл гепарина на шейкер в РТ пять раз, за 2 ч.
      Примечание: Этот шаг может быть приостановка точку на ночь оставить образцы на RT.
3. Ткани, очистка белой жировой ткани и объема изображения
   1. Обезвоживания тканей, содержащиеся в 2 мл пробирок инкубации в 20%, 40%, 60% и 80% метанола, впоследствии, каждый 1 час на RT. Затем обезвоживает образцы в 100% метанола дважды на RT.
      Примечание: Этот шаг может быть точкой приостановка оставить ваши образцы в 100% метанола на ночь на RT.
   2. Инкубируйте тканей смесью 2 тома 1 объем метанола для 3 h на RT на шейкер ДКМ.
      Примечание: Система DCM является неустойчивым. Убедитесь, что трубки плотно закрытыми для предотвращения испарения.
      Предупреждение: Этот шаг является опасной. ДКМ токсичен при вдыхании. Длительное воздействие может вызвать химические ожоги. Носите средства индивидуальной защиты (например, перчатки нитриловые, лаборатории пальто, обувь, защитные очки). Использование вытяжного шкафа.
   3. Инкубировать ткани 100% DCM дважды, за 15 мин на шейкер на RT.
   4. Инкубировать в 100% DBE в РТ до визуализации и хранения проб. До обработки изображений, Инвертируйте трубы несколько раз перемешать решения.
      Примечание: Полностью заполните трубы с DBE для предотвращения окисления, которое может привести к неудачной очистки ткани. Не трясите трубы во время инкубации DBE.
      Предупреждение: Этот шаг является опасной. DBE является токсичным. Это может вызвать раздражение глаз и кожи. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта.
   5. Изображения образца всей ткани с световой микроскоп, который соответствует преломления органических растворителей DBE. Выполните Z-укладки на желаемый масштаб и размер шага для всей ткани.

4. примеры анализа данных из состава Гора окрашенные ткани изображения с помощью ImageJ

Примечание: Смотрите https://imageJ.nih.gov/ij/download.html для загрузки и инструкции по установке.

1. Количественная оценка плотности кровеносных сосудов ( Рисунок 2дополнительных )
   1. Импортируйте сохраненные изображения только канал с иммуноокрашивания кровеносных сосудов на ImageJ.
      Примечание: Изображения для количественной оценки должны согласовываться с точки зрения пятная процедуру и условия приобретения изображений. Должны использоваться идентичные реагентов. Время экспозиции, интенсивности и увеличение также должны быть эквивалентными в визуализации процесса²⁰.
   2. Преобразуйте цвета изображения в черно-белой для количественного определения плотности кровеносного сосуда. Для этого на вкладке «Изображение» выберите команду «Настройка» , затем параметр «порог цвета» . В «порог цвета» окно, выберите «Темный фон»²⁰ и «B & W» под «порог цвета».
   3. Чтобы измерить процент области кровеносный сосуд сигнала фоне, выберите вкладку «Анализировать» , затем команду «анализ частиц» . В разделе Отображение «анализ частиц»выберите параметры «Очистить результаты» и «Суммировать» . Нажмите кнопку «ОК».
   4. Скопируйте и вставьте значение области процент на вкладке резюме в электронную таблицу для анализа. Процент от области будет указывать плотность кровеносного сосуда. Повторите шаги 4.3.1–4.3.4 для каждого индивидуального образа.
2. Количественная оценка Адипоцит размер²¹ ( рис. 3дополнительных )
   1. Импортируйте сохраненные изображения адипоцитов на ImageJ.
   2. Чтобы задать масштаб изображения, Измерьте длину шкалы в пикселях трассировки линии к шкале с известным расстоянием на изображении с помощью инструмента выделения прямой линии. На вкладке «Анализировать» выберите команду «Задать шкалу» . Расстояние от линии, которая была прослежена до будет автоматически рассчитывается в пикселях.
   3. Появится поле «Задать шкалу» . Введите известные расстояние и единицы длины. Выберите «Глобальные» применять шкалу для всех импортированных изображений и нажмите кнопку «ОК».
   4. Чтобы выбрать область как метод измерения, во вкладке «Анализировать» выберите команду «задать измерения» . Появится список различных вариантов для измерений. Выберите параметр «Область» и нажмите «OK».
   5. Используя инструмент выделения произвольной, проследить по периметру каждого Адипоцит интерес. На вкладке «Анализировать» выберите команду «Мера (Ctrl + M)» , и появится область Адипоцит. Повторите эту процедуру для других адипоцитов в изображении.
      Примечание: Для обеспечения точных измерений, используйте несколько изображений для количественной оценки.
   6. Скопируйте и вставьте область измерений в электронную таблицу для дальнейшего анализа данных.

Результаты

Из-за хрупкости жировой ткани методы с участием нескольких шагов обработки и секционирование может привести к disfigurement жировой ткани морфология³ (рис. 1A). Однако всего гора пятнать может сохранить морфология адипоциты, обеспечение точной интерпретации резул...

Обсуждение

Хотя обычные методы, такие как cryosection и гистологии предлагают преимущества для наблюдения за внутриклеточные структуры, окрашивание всей гора предоставляет различные перспективы в исследованиях жировой ткани, что позволяет 3D визуализация сотовой связи Архитектура минимально обрабо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)