Visualisation de la Structure du tissu adipeux blanc 3D utilisant entier-Montez la souillure

Résumé

L’objectif de la présente étude est de montrer la technique d’immunohistochimie et visualisation entier-montent comme une méthode idéale pour l’imagerie 3D du composant d’architecture et cellulaires du tissu adipeux.

Résumé

Le tissu adipeux est un organe métabolique avec grande plasticité et est sensible aux stimuli de l’environnement et l’état nutritionnel. Par conséquent, différentes techniques ont été développées pour étudier la morphologie et la biologie du tissu adipeux. Cependant, les méthodes de visualisation conventionnels sont limitées à l’étude du tissu dans des sections 2D, de la capture de l’architecture 3D de la totalité de l’organe. Nous présentons ensemble monture coloration, une méthode immunohistochimique qui conserve intact le tissu adipeux morphologie avec des étapes de traitement minimal. Par conséquent, les structures des adipocytes et autres constituants cellulaires sont maintenues sans distorsion, atteindre la visualisation 3D plus représentative du tissu. En outre, entier-Montez la souillure est cumulable avec les méthodes de traçage de lignée afin de déterminer les décisions de destin cellulaire. Cependant, cette technique a quelques limitations à fournir des renseignements exacts au sujet des parties plus profondes du tissu adipeux. Pour contourner cette limitation, entier-Montez la souillure peut être combinée avec des tissus techniques pour supprimer l’opacité des tissus et permettre une visualisation complète d’anatomie de tout le tissu adipeux en microscopie fluorescente lumière-feuille de compensation. Par conséquent, une résolution plus élevée et la plus fidèle des structures de tissu adipeux peuvent être capturés avec la combinaison de ces techniques.

Introduction

Le tissu adipeux est un organe essentiel pour le stockage de l’énergie et se caractérise par la dynamique de rénovation et expansion presque illimitée¹. En plus de l’homéostasie énergétique, tissu adipeux joue également un rôle essentiel dans la sécrétion de l’hormone de plus de 50 adipokines pour moduler la fonction métabolique corps entier². Le tissu adipeux a une architecture diversifiée composée de divers types de cellules, y compris les adipocytes matures, fibroblastes, cellules endothéliales, les cellules immunitaires et de cellules progéniteurs adipocytaires³. Des études récentes ont montré que l’obésité et autres dysfonctions métaboliques peuvent modifier considérablement fonction du tissu adipeux et son microenvironnement, qui inclut, mais n’est pas limité à l’élargissement des adipocytes, infiltration de cellules inflammatoires (par exemple, macrophages) et la dysfonction vasculaire³.

Techniques morphologiques classiques comme l’histologie et cryosectioning démontrent plusieurs limitations dans l’étude de la biologie adipeuse comme étapes longues de traitement chimique, qui peut conduire au tissu structure et rétrécissement distorsion^{3, 4}. En outre, ces techniques 2D ne suffisent pas à observer les interactions intercellulaires exercées par différents types de cellules, comme les sections obtenues sont limitées à des régions plus petites du tissu entier³. Par rapport aux classiques des méthodes d’imagerie fluorescente, entier-Montez la souillure n’exige pas des étapes supplémentaires d’envahissantes, telles que l’incorporation, le sectionnement et la déshydratation ; ainsi, cela évite le problème de diminuer la spécificité de l’anticorps. Par conséquent, c’est une méthode simple et efficace pour l’imagerie du tissu adipeux, avec une meilleure conservation de la morphologie de l’adipocyte et globale du tissu adipeux structure⁵. Par conséquent, entier-Montez souillure comme une technique rapide et peu coûteux immunomarquage a été créée pour préserver le tissu adipeux architecture 3D^1,6,7,8.

Cependant, malgré la conservation de la morphologie du tissu adipeux avec utilisation d’entier-Montez la souillure, cette technique est toujours pas en mesure de visualiser les structures intérieures sous la surface des lipides du tissu. Plusieurs récentes études^9,10 ont mis en place les tissus techniques combinées avec ensemble monture immunomarquage^1,6 , permettant la visualisation 3D complète dans le tissu adipeux de compensation. En particulier, denses réseaux neurones et système vasculaire ont été visualisées dans les récentes études^9,10,11,12 avec l’imagerie 3D volume. En effet, il est essentiel d’étudier la biologie d’étudier la plasticité neuronale et vasculaire du tissu adipeux dans différentes conditions physiologiques. Imagerie en trois dimensions compatibles immunomarquage de compensation des tissus organes cote de solvant (iDISCO +) est un processus composé de prétraitement de méthanol, immunomarquage et dégagement d’opacité des tissus avec des réactifs chimiques organiques dichlorométhane (DCM ) et de dibenzyle éther (DBE)^13,14. En rendant le tissu adipeux entièrement transparente, une représentation plus précise de l’anatomie dans les tissus tels que les vaisseaux sanguins et fibres neurales peut être obtenue à^9,10. IDISCO + a des avantages car il est compatible avec divers anticorps et reporters fluorescent^11,14, et il a démontré le succès dans plusieurs organes et même embryonnés¹⁴. Cependant, sa principale limitation est un temps d’incubation longue, dont 18 à 20 jours sont nécessaires pour compléter l’expérience entière.

Une autre application importante d’entier-Montez la souillure est la visualisation du sort de la cellule en combinaison avec un système de traçage de lignage. Suivi de lignée est l’étiquetage d’un gène spécifique/marqueur dans une cellule qui peut être transmis à toutes les cellules de fille et est conservée au fil du temps¹⁵. Par conséquent, il est un outil puissant qui peut être utilisé pour déterminer le sort de progéniture^{15 une cellule}. Depuis les années 1990, le système de recombinaison Cre-LoxP est devenu une approche puissante pour le traçage de la lignée dans la vie des organismes¹⁵. Quand une lignée de souris qui exprime la Cre, une enzyme de recombinase ADN, est croisée avec une autre lignée de souris exprimant un journaliste qui est adjacent à une séquence de STOP-loxP-loxP, la protéine de journaliste est exprimée¹⁵.

Entier-Montez la souillure, l’utilisation de reporters multicolores fluorescents est adaptée pour l’imagerie du tissu adipeux, parce qu’il permet une interférence minimale avec activités intracellulaires de l' adipocyte¹⁶. Cependant, les journalistes traditionnels tachent généralement le cytoplasme, rendant difficile de remonter la lignée des adipocytes blancs, qui ont peu de contenu cytoplasmique¹⁷. Pour contourner ce problème, l’utilisation du marqueur de journaliste membranaires fluorescents tdTomato/membrane eGFP (mT/mG) est un outil idéal. Axés sur la membrane tdTomato est exprimée en Cre-négatif cellules¹⁸. À l’excision, le Cre un interrupteur pour l’expression de membrane ciblées eGFP survient, ce qui rend ce journaliste appropriés pour le suivi de la lignée des adipocytes progéniteurs^17,18 (Complémentaire de la Figure 1).

Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé pour entier-Montez la souillure et de montrer comment elle peut être combinée avec d’autres techniques pour étudier le développement et la physiologie du tissu adipeux. Son utilisation avec des lignées de souris journaliste 1) multicolore pour identifier les origines diverses des adipocytes et 2) tissus de compensation pour visualiser davantage l’arborisation neurale dans le tissu adipeux blanc (WAT) en sont deux exemples d’applications décrites dans le présent protocole.

Protocole

Tous les protocoles animaux expérimentaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Centre pour Phenogenomics (TCP) sont conformes aux normes du Conseil canadien de protection des animaux. Souris ont été maintenus sur les cycles de lumière/obscurité de 12 h et fournis avec libre accès à l’eau et de nourriture. expérience de 7 mois vieux C57BL/6J souris mâles ont été utilisés dans l’entier-Montez la souillure.

Remarque : Les Sections 1 à 2 sont dans l’ordre chronologique, à l’article 3 est une étape facultative dès l’article 1. L’article 4 peut être effectuée pour analyser la densité de taille et des vaisseaux sanguins des adipocytes à l’issue de l’article 2.

1. préparation matériaux et tissus Isolation

1. Préparer les frais paraformaldéhyde à 1 % (PFA) dilué dans 1 x tamponné phosphate salin (PBS) pour la fixation du tissu. Préparer les 0,3 % tensioactif nonionique dilué dans du PBS 1 x (ci-après dénommé PBS-0.3T) pour tissus ultérieures étapes de lavage.
   Remarque : Pour chacun des tissus, préparer environ 1,5 mL de 1 % PFA afin d’assurer une immersion complète. Volume de fixation peut être augmenté ou diminué selon la taille du tissu.
   ATTENTION : Cette étape est dangereuse, comme PFA est corrosif et toxique. Porter un équipement protecteur personnel (p. ex., des gants en nitrile, blouse, chaussures, lunettes de protection) et la poignée sous une hotte.
2. Euthanasier les animaux selon une méthode approuvée (p. ex., dislocation cervicale ou asphyxie de dioxyde de carbone). Sans tarder, disséquer la désirée du tissu adipeux dépôts (par exemple, le tissu adipeux blanc inguinal ou le tissu adipeux blanc perigonadal)¹⁸.
3. Avec des ciseaux de dissection, découper le tissu, un 100 x 15 mm² boîte de Pétri en morceaux environ 0,5 à 1 cm de taille et immerge-les dans des tubes de microcentrifuge remplis 1 % PFA. Rester sur la glace.

2. entier-Montez la souillure du tissu adipeux blanc

1. Après dissection est terminée, déplacez les échantillons de tissus chez 1 % PFA de la glace à la température (RT) pendant 1 h de la salle et ensuite transférer les tissus à une plaque de culture de cellules de 12 ou 24 puits pour un lavage plus rapide.
2. Laver les tissus avec du PBS-0.3T, 3 fois pendant 5 min chacun dans RT sur un agitateur incliné à 22 °, avec des inclinaisons de 20 à 25 par minute comme la vitesse.
   Remarque : Utilisez cette inclinaison et la vitesse pour toutes les étapes ultérieures impliquant l’utilisation d’un shaker.
   Remarque : Si vous utilisez une lignée de souris journaliste multicolore comme mT/mG et autres anticorps n’est pas nécessaire, le tissu est prêt pour la microscopie après l’étape 2.2.
3. Ajouter 0,5 à 1 mL de tampon de blocage (5 % de sérum animal dilué dans du PBS-0.3T). Mettre la plaque sur l’agitateur et incuber pendant 1 heure en RT
4. Aspirer la solution de blocage et d’ajouter des anticorps primaires dilués dans du PBS-0.3T avec 1 % sérum animal.
5. Place la plaque sur un agitateur à 4 ° C la nuit.
6. Le lendemain, laver les tissus avec du PBS-0.3T 3 fois pendant 5 minutes chacune en RT
7. Utiliser des anticorps secondaires appropriés dilués dans du PBS-0.3T. Ajouter 0,5 – 1 solutions d’anticorps secondaire mL dans chaque puits. Enrouler la plaque dans du papier d’aluminium et laisser incuber sur un agitateur 1 heure à température ambiante.
   NOTE : Diluer l’anticorps secondaire dans l’obscurité pour empêcher le photoblanchiment.
8. Après incubation de l’anticorps secondaire, laver avec du PBS-0.3T deux fois pendant 5 min, chacun en RT. les échantillons d’images si une tache de lipides neutres n’est pas souhaitée. Si la visualisation de gouttelettes lipidiques est nécessaire en utilisant les lipides neutres tacher, laver avec du PBS 1 x (sans surfactant non ionique) deux fois, de 5 min chacun.
9. Après les étapes de lavage, incuber avec la tache de lipides neutres diluée avec le facteur de dilution de 1:1500 dans du PBS 1 x pendant 30 min en RT Les tissus sont maintenant prêts pour la microscopie. Pour l’imagerie futur, les tissus peuvent être stockés dans cette solution à 4 ° C.
   Nota : Qualité d’image diminue avec le temps ; le meilleur moment pour l’imagerie est donc, dans 1 ou 2 jours.
10. À l’aide de pinces, poser le tissu à plat sur une lamelle de verre 24 x 60 mm² et placez-le sur un système de microscope inversé laser confocale.
11. Si une coloration des noyaux au DAPI est souhaitée, ajouter 1 à 2 gouttes de milieu de montage contenant DAPI pour complètement submerger le tissu et empêchez-le de séchage.
12. Pour obtenir des images d’entier-montent, coloré des tissus aux multiples plans focaux, effectuer Z-piles de 100 – 150 μm en profondeur avec 4 à 6 μm étape-taille au grossissement désiré.

3. tissu compensation et à l’aide de l’immunomarquage iDISCO +

Remarque : Ce protocole est basé sur les procédures précédemment publiées^9,10,19.

1. Fixation et prétraitement de méthanol
   1. Incuber les tissus en PFA dilué dans du PBS 1 x à 4° C durant la nuit dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL, 4 %.
      NOTE : Laisser les tissus dans les tubes de 2 mL pour tous les traitements suivants jusqu'à l’imagerie.
   2. Le lendemain, laver les tissus dans du PBS 1 x trois fois, pendant 1 heure chacune sur un agitateur à température ambiante.
      Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser l’échantillon pendant une nuit à RT ou 4 ° C.
   3. Déshydrater les tissus à ta dans 20 %, 40 %, 60 % et 80 % de méthanol, par la suite, pendant 1 h chaque. Déshydrater dans le méthanol 100 % à la droite pendant 1 heure, puis transférer les tissus frais 100 % de méthanol et incuber à 4 C pendant 1 h.
      Remarque : Le méthanol dilué dans l’eau distillée. Durant l’incubation de méthanol, il est inutile de mettre des échantillons sur un agitateur, tant que les échantillons de tissus sont immergés.
      ATTENTION : Cette étape n’est dangereuse, tel que le méthanol est toxique. Il est hautement inflammable sur une flamme nue. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte. Stocker le méthanol loin d’allumage et dans une armoire de sécurité inflammable.
   4. Blanchir les tissus avec 5 % de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂; 1 volume de 30 % H₂O₂ dilué dans 5 volumes de méthanol 100 %) pendant la nuit à 4 ° C.
      ATTENTION : le peroxyde d’hydrogène 30 % est très dangereux sur la peau et contact avec les yeux. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte.
   5. Réhydrater les tissus à RT à 80 %, 60 %, 40 % et 20 % de méthanol et 1 x PBS, par la suite, pendant une heure chaque.
   6. Laver avec 0,2 % surfactif dilué dans du PBS de x 1 deux fois, pendant 1 heures chacun sur un agitateur à température ambiante.
2. Immunomarquage
   Remarque : Remplir les tubes de 2 mL contenant le tissu vers le haut du tube avec la solution utilisée à chaque étape pour éviter l’oxydation de tissu dès qu’immunomarquage commence, jusqu'à ce que la compensation est terminée.
   1. Permeabilize les tissus de leur incubation dans une solution de la solution 1 PBS x 0,2 % tensioactifs non ioniques, 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et glycine de 0,3 M à 37 ° C dans un agitateur orbital table incubé durant 2 jours.
      NOTE : Le temps d’incubation maximale pour l’étape de perméabilisation de 37 ° C est de 2 jours.
   2. Bloquer les tissus dans une solution de 1 x PBS, 0,2 % tensioactifs non ioniques, 10 % DMSO, sérum âne 5 % et 1 % Fc bloc à 37 ° C dans un agitateur orbital table couvé pendant 2 jours.
      Remarque : La durée maximale d’incubation pour l’étape de blocage est de 2 jours.
   3. Incuber les tissus en anticorps primaires d’intérêt dans une solution de PBS 1 x, 0,2 %, polysorbate 20, 10 µg/mL héparine, DMSO 5 % et 5 % de sérum d’âne à 37 ° C dans un agitateur orbital table incubé pendant 4 jours.
   4. Laver avec 1 x PBS, 0,2 %, polysorbate 20 et 10 µg/mL héparine sur un agitateur à ta cinq fois, chacune pendant 1 h.
      Remarque : Cette étape peut être un point de pause pour laisser des échantillons du jour au lendemain en RT
   5. Incuber les tissus avec un anticorps secondaire dans une solution de PBS 1 x, 0,2 %, polysorbate 20, 10 µg/mL héparine et 5 % de sérum d’âne à 37 ° C dans un agitateur orbital sur table pendant 4 jours.
      NOTE : Étape 3.2.5, tous les échantillons doivent être recouverts de papier aluminium pour éviter le photoblanchiment de l’anticorps secondaire.
   6. Laver les tissus dans une solution de 1 x PBS, 0,2 %, polysorbate 20 et 10 µg/mL héparine sur un agitateur dans RT cinq fois, pendant 2 heures chacun.
      Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser les échantillons une nuit à température ambiante.
3. Tissu de nettoyage du tissu adipeux blanc et l’imagerie de volume
   1. Déshydrater les tissus contenus dans des tubes de 2 mL par incubation à 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol, par la suite, chacune pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, mettre en attente les échantillons dans le méthanol 100 % deux fois à température ambiante.
      Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser vos échantillons dans 100 % de méthanol pendant une nuit à température ambiante.
   2. Incuber les tissus avec un mélange de 2 volumes de DCM pour 1 volume de méthanol pendant 3 h à ta sur un agitateur.
      Remarque : Le DCM est volatile. Assurez-vous que les tubes sont bien scellées pour empêcher l’évaporation.
      ATTENTION : Cette étape est dangereuse. DCM est toxique à l’inhalation. Une exposition prolongée peut causer des brûlures chimiques. Porter des équipements de protection individuelle (par exemple, des gants en nitrile, blouse, chaussures, lunettes de protection). Utiliser une hotte aspirante.
   3. Incuber les tissus en 100 % DCM deux fois, pendant 15 min chacun sur un agitateur à température ambiante.
   4. Incuber à 100 % DBE en RT jusqu’en imagerie et pour la conservation de l’échantillon. Avant l’imagerie, inverser les tubes plusieurs fois pour mélanger les solutions.
      Remarque : Remplir complètement les tubes avec DBE pour éviter l’oxydation, ce qui peut entraîner dans le tissu infructueux de compensation. Ne pas secouer les tubes durant l’incubation DBE.
      ATTENTION : Cette étape est dangereuse. DBE est toxique. Il peut causer une irritation des yeux et des muqueuses. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte.
   5. L’image de l’échantillon de tissu ensemble avec un microscope optique qui correspond à l’indice de réfraction de la deb solvant organique. Effectuer un empilement Z à un grossissement désiré et étape-taille pour le tissu tout.

4. exemples d’analyse de données d’entier-Montez teint tissu Images à l’aide de ImageJ

Remarque : Consultez https://imageJ.nih.gov/ij/download.html pour obtenir des instructions de téléchargement et d’installation.

1. Quantification de la densité des vaisseaux sanguins (supplémentaire Figure 2)
   1. Importer les images enregistrées de seul le canal avec des vaisseaux sanguins immunomarquage sur ImageJ.
      Remarque : Les images de quantification doivent être cohérentes en ce qui concerne la procédure de marquage et de la condition d’acquisition image. Réactifs identiques doivent être utilisés. Le temps d’exposition, l’intensité et grossissement devraient également être équivalentes dans l' imagerie du processus²⁰.
   2. Convertir l’image couleur en noir et blanc pour la quantification de la densité des vaisseaux sanguins. Pour ce faire, sous l’onglet « Image » , sélectionnez la commande « Adjust » , puis l’option « seuil de couleur » . Dans la « couleur de seuil » présentoir, choisissez « Fond sombre »²⁰ et sélectionnez « B & W » sous le « seuil de couleur ».
   3. Pour mesurer le pourcentage de la surface du vaisseau sanguin signal sur toile de fond, sélectionnez l’onglet « Analyse » , puis la commande « analyser les particules » . Sous l’affichage de « particules analysées », sélectionnez les options « des résultats clairs » et « Résumer » . Cliquez sur « OK ».
   4. Copiez et collez la valeur de la zone de pourcentage sous l’onglet Résumé dans une feuille de calcul pour l’analyse. Le pourcentage de surface indique la densité des vaisseaux sanguins. Répétez les étapes 4.3.1–4.3.4 pour chaque image.
2. Quantification des adipocytes taille²¹ (supplémentaire Figure 3)
   1. Importer les images enregistrées des adipocytes sur ImageJ.
   2. Pour définir l’échelle de l’image, mesurez la longueur de l’échelle en pixels en traçant une ligne à l’échelle avec une distance connue sur l’image à l’aide de l’outil de sélection linéaire. Sous l’onglet « Analyse » , sélectionnez la commande « Définir échelle » . La distance de la ligne qui a été tracée avant sera automatiquement calculée en pixels.
   3. La boîte d’affichage de « Set Echelle » apparaîtra. Entrez la distance connue et l’unité de longueur. Sélectionnez « Global » à appliquer le barème fixant pour toutes les images importées, puis cliquez sur « OK ».
   4. Pour choisir la zone comme la méthode de mesure, sous l’onglet « Analyse » sélectionnez la commande « définir des mesures » . Une liste des différentes options pour les mesures apparaîtra. Sélectionnez l’option « Domaine » et cliquez sur « OK ».
   5. À l’aide de l’outil de sélection à main levée, trace le périmètre de chaque adipocyte d’intérêt. Sous l’onglet « Analyse » , sélectionnez la commande « Mesure (Ctrl + M) » , et la zone de l’adipocyte apparaîtra. Répétez cette procédure pour les autres adipocytes dans l’image.
      Remarque : Pour assurer des mesures exactes, utilisez plusieurs images pour la quantification.
   6. Copiez et collez les mesures de surface dans une feuille de calcul pour une analyse ultérieure des données.

Résultats

En raison de la fragilité du tissu adipeux, méthodes impliquant plusieurs étapes de traitement et de sectionnement peuvent conduire à la défiguration de tissu adipeux morphologie³ (Figure 1 a). Cependant, l’entier-Montez la souillure peut préserver la morphologie des adipocytes, assurer une interprétation précise des résultats (Figure 1 b).

La fixation excessive du tissu adipeux mène à autofluoresc...

Discussion

Bien que les techniques classiques telles que l’histologie et cryosection offrent des avantages pour l’observation de la structure intracellulaire, entier-Montez la souillure offre une perspective différente dans la recherche de tissu adipeux, qui permet de visualiser en 3D des cellulaires architecture du tissu minimalement transformé.

Afin de réaliser avec succès entier-Montez la souillure, les suggestions suivantes devraient prendre en considération. Dépôts adipeux différents peu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)