Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Resumo

O foco do presente estudo é demonstrar a técnica de imunocoloração e visualização de toda a montagem como um método ideal para tratamento de imagens 3D do tecido adiposo celular e arquitetura de componente.

Resumo

Tecido adiposo é um órgão metabólico importante com alta plasticidade e é sensível ao status de nutrientes e estímulos ambientais. Como tal, desenvolveram-se várias técnicas para estudar a morfologia e biologia do tecido adiposo. No entanto, métodos de visualização convencionais limitam-se a estudar o tecido em seções 2D, falhando capturar a arquitetura 3D do órgão inteiro. Aqui nós apresentamos toda a montagem, um método de imuno-histoquímica que preserva a morfologia intacta tecido adiposo com etapas de processamento mínimo de coloração. Portanto, as estruturas de adipócitos e outros componentes celulares são mantidas sem distorção, alcançar a visualização em 3D mais representativa do tecido. Além disso, toda a montagem de coloração pode ser combinado com métodos de rastreamento de linhagem para determinar as decisões de destino de célula. No entanto, esta técnica tem algumas limitações para fornecer informações precisas sobre as partes mais profundas do tecido adiposo. Para contornar essa limitação, montagem de toda a mancha pode ainda ser combinada com tecido técnicas para remover a opacidade do tecido e permitir a completa visualização da anatomia de todo tecido adiposo usando microscopia fluorescente luz-folha de compensação. Portanto, uma maior resolução e uma representação mais precisa das estruturas de tecido adiposo podem ser capturados com a combinação dessas técnicas.

Introdução

Tecido adiposo é um órgão essencial para o armazenamento de energia e é caracterizado pela dinâmica de remodelação e expansão quase ilimitada¹. Além de homeostase de energia, o tecido adiposo também desempenha um papel essencial na secreção de hormônio de mais de 50 adipocinas para modular a função metabólica de corpo inteiro². Tecido adiposo tem uma arquitectura diversificada composta por vários tipos de células, incluindo os adipócitos maduros, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e de células progenitoras dos adipócitos³. Estudos recentes têm mostrado que a obesidade e outras disfunções metabólicas podem significativamente alterar função do tecido adiposo e seu microambiente, que inclui mas não está limitado ao alargamento dos adipócitos, infiltração de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos) e disfunção vascular³.

Técnicas morfológicas convencionais como histologia e cryosectioning demonstram várias limitações em estudar Biologia adiposa como etapas longas processamento químico, que pode levar ao tecido encolhimento e estrutura distorção^{3, 4}. Além disso, estas técnicas 2D são insuficientes para observar interações intercelulares exercidas pelos diferentes tipos de células, como as seções obtidas são limitadas a pequenas regiões do tecido inteiro³. Em comparação com os convencionais métodos de imagem fluorescente, manchando toda a montagem não requer etapas adicionais invasivas, tais como incorporação, corte e desidratação; assim, isto evita o problema de diminuir a especificidade do anticorpo. Como tal, é um método simples e eficiente para o tecido adiposo de imagem, com melhor preservação da morfologia dos adipócitos e de estrutura de tecido adiposo total⁵. Portanto, toda a montagem coloração como uma técnica rápida e barata immunolabeling foi estabelecida para preservar o tecido adiposo arquitetura 3D^1,6,7,8.

No entanto, apesar da preservação da morfologia do tecido adiposo, com uso de coloração toda a montagem, esta técnica é ainda incapaz de visualizar estruturas internas sob a superfície de lipídios do tecido. Vários estudos recentes^9,10 estabeleceram tecido limpando técnicas combinadas com toda a montagem immunolabeling^1,6 , para permitir a visualização 3D abrangente no tecido adiposo. Em particular, redes neurais e a vasculatura densas foram visualizadas em recentes estudos^9,10,11,12 com imagem de volume 3D. Com efeito, estudar a plasticidade neural e vascular do tecido adiposo em diferentes condições fisiológicas é essencial para o estudo de sua biologia. Habilitado para Immunolabeling imagem tridimensional da clareira de tecidos de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO +) é um processo composto de pré-tratamento de metanol, immunolabeling e limpeza de opacidade de tecido com reagentes químicos orgânicos diclorometano (DCM ) e dibenzyl de^13,de éter (DBE)¹⁴. O tecido adiposo, tornando totalmente transparente, uma representação mais precisa da anatomia dentro do tecido, tais como os vasos sanguíneos e fibras neurais pode ser obtida^9,10. IDISCO + tem vantagens em que é compatível com vários anticorpos e repórteres fluorescente^11,14, e tem demonstrado sucesso em vários órgãos e embriões até¹⁴. No entanto, sua principal limitação é um tempo de incubação longa, em que 18 a 20 dias são necessários para completar todo o experimento.

Outra aplicação importante da mancha toda a montagem é a visualização do destino de célula em combinação com um sistema de rastreamento de linhagem. Rastreamento de linhagem é a rotulagem de um gene/marcador específico em uma célula que pode ser transmitida a todas as células da filha e é conservada ao longo do tempo,¹⁵. Como tal, é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para determinar o destino de progênie^{15 de uma célula}. Desde a década de 1990, o sistema de recombinação de Cre-LoxP tornou-se uma poderosa abordagem para rastreamento de linhagem em vida organismos¹⁵. Quando uma linha de rato que expressa Cre, uma enzima recombinase de DNA, é cruzada com uma outra linha de rato, expressando uma repórter que é adjacente a uma sequência de loxP-STOP-loxP, a proteína de repórter é expressa¹⁵.

Para a coloração de toda a montagem, o uso de repórteres multicoloridos fluorescentes é apropriado para a imagem do tecido adiposo, porque permite a mínima interferência com atividades intracelulares do adipócito¹⁶. No entanto, repórteres tradicionais normalmente mancham o citoplasma, tornando difícil traçar a linhagem dos adipócitos brancos, que têm limitado a conteúdo citoplasmático¹⁷. Para superar este problema, o uso do marcador de repórter eGFP (mT/mG) membrana-limite tdTomato fluorescente/membrana é uma ferramenta ideal. TdTomato membrana-alvo é expressa em células de Cre-negativo¹⁸. Após excisão de Cre, ocorre um interruptor para a expressão da membrana-alvo eGFP, tornando este repórter adequado para rastreamento da linhagem do adipócito progenitores^17,18 (Complementar a figura 1).

O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para montagem em toda a coloração e mostrar como ele pode ser combinado com outras técnicas para estudar o desenvolvimento e a fisiologia do tecido adiposo. Dois exemplos de aplicativos descritos no presente protocolo são seu uso com linhas de rato 1) multicolor repórter para identificar várias origens de adipócitos e 2) tecido de compensação para visualizar mais a arborização neural no tecido adiposo branco (WAT).

Protocolo

Todos os protocolos de animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do centro para Phenogenomics (TCP) em conformidade com as normas do Conselho canadense de cuidado Animal. Ratos foram mantidos em ciclos de 12 h claro/escuro e fornecidos com livre acesso à água e comida. 7 mês antiga C57BL/6J camundongos machos foram usados no experimento manchando toda a montagem.

Nota: As seções 1 e 2 estão em ordem cronológica, com seção 3 sendo uma etapa opcional logo após a seção 1. Secção 4 pode ser realizada para analisar a densidade de tamanho e dos vasos sanguíneos dos adipócitos após a conclusão da seção 2.

1. materiais preparação e isolamento de tecido

1. Prepare-se fresco 1% paraformaldeído (PFA), diluído em 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para fixação de tecidos. Preparar a 0,3% de surfactante não iônico diluído em PBS 1x (doravante referida como PBS-0.3T) para o tecido subsequente etapas de lavagem.
   Nota: Para cada tecido, preparar cerca de 1,5 mL de 1% PFA para garantir a imersão completa. Volume de fixação pode ser aumentado ou diminuído dependendo do tamanho do tecido.
   Atenção: Esta etapa é perigosa, como PFA é corrosivo e tóxico. Equipamento de proteção pessoal desgaste (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança) e o punho em uma coifa.
2. Eutanásia em animais de acordo com um procedimento aprovado (por exemplo, deslocamento cervical e/ou asfixia de dióxido de carbono). Sem demora, disse o tecido adiposo desejado depósitos (por exemplo, inguinal tecido adiposo branco ou tecido adiposo de perigonadal branco)¹⁸.
3. Com uma tesoura de dissecação, corte o tecido em um 100 x 15 mm² placa de Petri em pedaços de aproximadamente 0,5-1 cm de tamanho e mergulhe-os em tubos microcentrifuga preenchidos com 1% PFA. Manter-se no gelo.

2. montagem de toda a mancha do tecido adiposo branco

1. Após dissecação completa, mover as amostras de tecido em 1% PFA do gelo a temperatura (RT) por 1h e depois transferir os tecidos para uma placa de cultura de células de 12 ou 24-poços para lavar mais rápido.
2. Lave os tecidos com PBS-0.3T, 3 vezes por 5 min cada um em RT em um shaker inclinado em 22 °, com 20 a 25 inclina-se por min como a velocidade.
   Nota: Utilize esta inclinação e velocidade para todas as etapas subsequentes que envolvam o uso de um agitador.
   Nota: Se utilizar uma linha de rato multicolor repórter como mT/mG e adicionais mancha do anticorpo não é necessário, o tecido está pronto para microscopia após etapa 2.2.
3. Adicionar 0,5 – 1 mL de tampão de bloqueio (5% de soro animal diluído em PBS-0.3T). Colocar a placa no agitador e incubar durante 1 h em RT
4. Aspirar a solução de bloqueio e adicionar os anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com 1% de soro de animais.
5. Lugar a placa num agitador a 4 ° C durante a noite.
6. No dia seguinte, lave os tecidos com PBS-0.3T 3 vezes por 5 minutos cada em RT
7. Use o apropriado anticorpos secundários diluídos em PBS-0.3T. Adicionar 0,5 – 1 soluções de anticorpo secundário mL para cada poço. Embrulhe a placa em folha de alumínio e incube-lo num agitador durante 1 hora a RT
   Nota: Dilua o anticorpo secundário no escuro para evitar fotobranqueamento.
8. Após a incubação do anticorpo secundário, lave com PBS-0.3T duas vezes por 5 min, cada um em RT. as amostras de imagem se uma mancha de lipídios neutros não é desejada. Se a visualização das gotículas lipídicas é necessário usar o lipídio neutro mancha, lave com PBS 1x (sem tensoativo não-iônico) duas vezes, por 5 min cada.
9. Após as etapas de lavagem, incubar com a mancha de lipídio neutro diluída com factor de diluição de 1:1500 em PBS 1x por 30 min em RT Os tecidos estão agora prontos para microscopia. Para futura geração de imagens, os tecidos podem ser armazenados nesta solução em 4 ° C.
   Nota: Qualidade de imagem diminui ao longo do tempo; Portanto, a melhor época para a imagem latente é dentro de 1 ou 2 dias.
10. Usando a pinça, coloque o tecido sobre uma lamela de vidro 24 x 60 mm ² e colocá-lo em um sistema de microscópio invertido do laser confocal.
11. Se a coloração dos núcleos com DAPI é desejada, adicione 1 a 2 gotas de meio de montagem contendo DAPI para imergir o tecido completamente e evitar a sua secagem.
12. Para obter imagens de toda a montagem manchado tecidos em múltiplos planos focais, execute Z-pilhas de 100 – 150 μm em profundidade com 4 – 6 μm-tamanho passo a ampliação desejada.

3. tecido clareira e Immunolabeling usando iDISCO +

Nota: Este protocolo é baseado em procedimentos previamente publicado^9,10,19.

1. Fixação e pré-tratamento de metanol
   1. Incube os tecidos em 4% PFA diluído em PBS 1x a 4° C durante a noite em tubos de microcentrifuga de 2 mL.
      Nota: Deixe os tecidos em tubos de 2 mL para todos os tratamentos seguintes até imagens.
   2. No dia seguinte, lave os tecidos em 1X PBS três vezes, durante 1 hora num agitador no RT
      Nota: Este passo pode ser um pausa na ponto de deixar a amostra a noite no RT ou 4 ° C.
   3. Desidrata os tecidos em RT em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, por 1h cada. Desidratar em metanol 100% em RT por 1 hora, em seguida, transferir os tecidos para fresco 100% de metanol e incubar a 4 C por 1h.
      Nota: Metanol diluído em água destilada. Durante a incubação de metanol, não há nenhuma necessidade de colocar amostras em uma coqueteleira, enquanto as amostras de tecido são imersos.
      Atenção: Esta etapa é perigosa, como o metanol é tóxico. É altamente inflamável em chamas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa. Armazene o metanol de ignição e numa câmara de segurança inflamável.
   4. Branquear os tecidos com 5% de peróxido de hidrogênio (H₂O₂; 1 volume de 30% H₂O₂ diluído em 5 volumes de 100% metanol) durante a noite a 4 ° C.
      Atenção: 30% de peróxido de hidrogênio é muito perigosa sobre a pele e olhos. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa.
   5. Hidratar os tecidos em RT em 80%, 60%, 40% e 20% de metanol e 1X PBS, posteriormente, por 1 hora cada.
   6. Lavar com 0,2% de surfactante não iônico diluído em 1X PBS duas vezes, por 1h cada um agitador no RT
2. Immunolabeling
   Nota: Encha os tubos de 2 mL contendo o tecido para o topo do tubo com a solução usada em cada etapa para evitar a oxidação do tecido, assim como immunolabeling começa, até que seja concluída a clareira.
   1. Permeabilize os tecidos incubando-os em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e glicina de 0,3 M a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias.
      Nota: O tempo de incubação máximo para etapa de permeabilização de 37 ° C é de 2 dias.
   2. Bloquear os tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% de tensoativo não iônico, 10% DMSO, soro de burro de 5% e 1% Fc bloco a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 2 dias.
      Nota: O tempo de incubação máximo para a etapa de bloqueio é de 2 dias.
   3. Incubar os tecidos em anticorpos primários de interesse em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina, 5% DMSO e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop incubado por 4 dias.
   4. Lavar com 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador na RT cinco vezes, cada uma por 1h.
      Nota: Este passo pode ser um ponto de pausa para deixar amostras durante a noite em RT
   5. Incubar os tecidos com anticorpo secundário em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20, 10 µ g/mL heparina e 5% de soro de burro a 37 ° C em um agitador orbital do tabletop por 4 dias.
      Nota: De passo 3.2.5, todas as amostras precisam ser embrulhado com papel de alumínio para evitar fotobranqueamento de anticorpo secundário.
   6. Lave tecidos em uma solução de 1X PBS, 0,2% polissorbato 20 e 10 µ g/mL heparina, um agitador em RT cinco vezes, de 2h cada.
      Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar as amostras durante a noite no RT
3. Clearing de tecido adiposo branco e imagens de volume de tecido
   1. Desidrata os tecidos contidos em tubos de 2 mL incubando em 20%, 40%, 60% e 80% de metanol, posteriormente, cada uma por 1 hora em RT Em seguida, desidrata-se as amostras em metanol 100% duas vezes na RT
      Nota: Este passo pode ser um ponto pausando para deixar suas amostras em metanol 100% durante a noite no RT
   2. Incube os tecidos com uma mistura de 2 volumes de DCM para 1 volume de metanol para 3h no RT em uma coqueteleira.
      Nota: O DCM é volátil. Certifique-se que os tubos são hermeticamente fechados para evitar a evaporação.
      Atenção: Esta etapa é perigosa. DCM é tóxico após inalação. Exposição prolongada pode causar queimaduras químicas. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas de nitrilo, jaleco, calçados, óculos de segurança). Use uma coifa.
   3. Incubar os tecidos em 100% DCM duas vezes, durante 15 min cada um agitador no RT
   4. Incubar em 100% DBE em RT até imagem e para o armazenamento de amostra. Antes de imagem, inverta os tubos várias vezes para misturar as soluções.
      Nota: Preencha completamente os tubos com DBE para evitar a oxidação, que pode resultar em tecido sem êxito de compensação. Não agite os tubos durante incubação DBE.
      Atenção: Esta etapa é perigosa. DBE é tóxico. Pode causar irritação dos olhos e pele. Utilize equipamento de protecção pessoal (por exemplo, luvas Nitrílicas, jaleco, óculos de segurança) e identificador de uma coifa.
   5. Imagem da amostra de tecido inteiro com um microscópio de luz que coincide com o índice de refração do DBE solvente orgânico. Execute o Z-empilhamento em uma ampliação desejada e tamanho da etapa para o tecido todo.

4. exemplos de análise de dados de toda a montagem manchada tecido imagens usando o ImageJ

Nota: Consulte https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para obter instruções de download e instalação.

1. Quantificação da densidade de vasos sanguíneos (Supplementary Figura 2)
   1. Importe as imagens salvas do canal apenas com vasos sanguíneos imunocoloração para ImageJ.
      Nota: As imagens para quantificação devem ser consistentes em termos de procedimento de coloração e condição de aquisição de imagem. Reagentes idênticos devem ser usados. O tempo de exposição, intensidade e ampliação devem também ser equivalente ao de imagem do processo²⁰.
   2. Converta a cor da imagem em preto e branco para quantificação de densidade de vasos sanguíneos. Para fazer isso, sob a aba "Imagem" , selecione o comando "Ajustar" , então a opção de "limiar de cores" . Na "cor do limite" Exibir caixa, escolha "Fundo escuro"²⁰ e selecione "B & W" sob "cor do limite".
   3. Para medir a porcentagem da área do vaso sanguíneo sinal de contexto, selecione a guia "Analisar" , então o comando "analisar partículas" . Sob a exibição de "partículas analisadas", selecione as opções "resultados claros" e "Resumir" . Clique em "Okey".
   4. Copie e cole o valor da área sob a guia de Resumo de porcentagem em uma planilha para análise. A porcentagem de área indicará a densidade de vasos sanguíneos. Repita as etapas 4.3.1–4.3.4 para cada imagem individual.
2. Quantificação do adipócito tamanho²¹ (suplementar a Figura 3)
   1. Importe as imagens salvas dos adipócitos no ImageJ.
   2. Para definir a escala da imagem, meça o comprimento da escala em pixels, traçando uma linha para a escala com uma distância conhecida na imagem usando a ferramenta seleção em linha reta. Na aba "Analisar" , selecione o comando "definir escala" . A distância da linha que foi traçada antes será automaticamente calculada em pixels.
   3. Aparecerá a caixa de exibir "definir escala" . Insira a unidade de comprimento e distância conhecida. Selecione "Global" para aplicar a configuração para todas as imagens importadas de escala e clique em "Okey".
   4. Para escolher a área como o método de medição, sob a aba "Analisar" selecione o comando "definir medições" . Irá aparecer uma lista de opções diferentes para as medições. Selecione a opção "Área" e clique em "Okey".
   5. Usando a ferramenta de seleção à mão livre, traçar o perímetro de cada adipócito de interesse. Na aba "Analisar" , selecione o comando "Medida (Ctrl + M)" , e a área do adipócito aparecerá. Repita este procedimento para outros adipócitos na imagem.
      Nota: Para garantir que as medidas exatas, utilize várias imagens para quantificação.
   6. Copie e cole as medições da área em uma planilha para análise de dados adicional.

Resultados

Devido a fragilidade do tecido adiposo, métodos que envolvem várias etapas de processamento e corte podem levar à desfiguração do tecido adiposo morfologia³ (figura 1A). No entanto, toda a montagem de coloração pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo a exata interpretação dos resultados (figura 1B).

Fixação do excesso de tecido adiposo leva a autofluorescência induzida pelo fixador. ...

Discussão

Embora as técnicas convencionais como histologia e cryosection oferecem benefícios para observar a estrutura intracelular, manchando toda a montagem fornece uma perspectiva diferente na investigação de tecido adiposo, que permite a visualização 3D de celulares arquitetura do tecido minimamente processado.

Para com êxito executar toda a montagem de coloração, as sugestões a seguir devem ser tida em conta. Depósitos de diferentes de tecido adiposo podem produzir vários resultados de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)