Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Riepilogo

L'obiettivo del presente studio è di dimostrare la tecnica immunostaining e visualizzazione di intero-monta come un metodo ideale per l'imaging 3D della componente cellulare e architettura del tessuto adiposo.

Abstract

Tessuto adiposo è un organo metabolico importante con alta plasticità ed è sensible a reagire agli stimoli ambientali e stato nutrizionale. Come tale, le varie tecniche sono state sviluppate per studiare la morfologia e la biologia del tessuto adiposo. Tuttavia, metodi di visualizzazione convenzionale sono limitati a studiare il tessuto nelle sezioni 2D, non riuscendo a catturare l'architettura 3D dell'intero organo. Qui presentiamo intero-monta la macchiatura, un metodo di immunohistochemistry che conserva intatto il tessuto adiposo morfologia con passaggi di elaborazione minima. Quindi, le strutture di adipociti e altri componenti cellulari sono mantenute senza distorsione, ottenendo la visualizzazione 3D più rappresentativo del tessuto. Inoltre, intero-monta la macchiatura combinabile con metodi di analisi di lignaggio per determinare le decisioni di destino delle cellule. Tuttavia, questa tecnica ha alcune limitazioni a fornire informazioni accurate per quanto riguarda le parti più profonde del tessuto adiposo. Per ovviare a questa limitazione, intero-monta la macchiatura possa essere ulteriormente combinata con tessuto tecniche per rimuovere l'opacità del tessuto e consentire la visualizzazione completa dell'intero tessuto adiposo anatomia usando microscopia fluorescente luce-foglio di compensazione. Di conseguenza, una maggiore risoluzione e più accurata rappresentazione delle strutture di tessuto adiposo può essere catturati con la combinazione di queste tecniche.

Introduzione

Tessuto adiposo è un organo essenziale per la conservazione di energia ed è caratterizzato da dinamiche di rimodellamento e quasi illimitata espansione¹. Oltre l'omeostasi energetica, tessuto adiposo inoltre svolge un ruolo essenziale nella secrezione dell'ormone di adipochine oltre 50 di modulare la funzione metabolica del corpo intero². Tessuto adiposo ha una diversa architettura composta da vari tipi cellulari tra cui adipocytes maturi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e di cellule progenitrici del adipocyte³. Recenti studi hanno dimostrato che l'obesità e altre disfunzioni metaboliche possono alterare significativamente funzione del tessuto adiposo e suo microambiente, che include ma non è limitato all'allargamento degli adipociti, infiltrazione di cellule infiammatorie (per esempio, macrofagi) e disfunzione vascolare³.

Tecniche convenzionali morfologiche come l'istologia e cryosectioning dimostrano diverse limitazioni nello studiare biologia adiposo come passaggi di elaborazione chimica di lunga durata, che può portare a tessuto restringimento e struttura distorsione^{3, 4}. Inoltre, queste tecniche 2D sono insufficienti per osservare interazioni intercellulari esercitate da diversi tipi di cellule, come le sezioni ottenute sono limitate a regioni più piccole dell' intero tessuto³. Rispetto ai convenzionali metodi di imaging fluorescente, intero-monta la macchiatura non richiede ulteriori misure invasive, quali l'incorporamento, sezionamento e disidratazione; così, questo evita il problema della specificità dell'anticorpo in diminuzione. Come tale, è un metodo semplice ed efficace per formazione immagine del tessuto adiposo, con migliore conservazione della morfologia degli adipociti e complessiva del tessuto adiposo struttura⁵. Di conseguenza, intero-monta colorazione come una tecnica di immunolabeling veloce e poco costoso è stata istituita per preservare il tessuto adiposo 3D architettura^1,6,7,8.

Tuttavia, nonostante la conservazione della morfologia del tessuto adiposo con uso di intero-monta la macchiatura, questa tecnica è ancora in grado di visualizzare le strutture interne sotto la superficie del lipido del tessuto. Diversi recenti studi^9,10 hanno stabilito del tessuto tecniche combinate con intero-monta immunolabeling^1,6 per consentire per la completa visualizzazione 3D all'interno del tessuto adiposo di compensazione. In particolare, sono state visualizzate fitte reti neurali e sistema vascolare in recenti studi^9,10,11,12 con imaging con volumi 3D. Infatti, studiando la plasticità neurale e vascolare del tessuto adiposo in differenti condizioni fisiologiche è essenziale per studiare la biologia. Imaging tridimensionale abilitati su immunolabeling di schiarimento del tessuto ha eliminato solvente organi (iDISCO +) è un processo composto da pre-trattamento di metanolo, immunolabeling e di compensazione di opacità del tessuto con reagenti chimici organici diclorometano (DCM ) e dibenzyl ether (DBE)^13,14. Il tessuto adiposo rendendo completamente trasparente, una rappresentazione più accurata dell'anatomia all'interno del tessuto come vasi sanguigni e fibre nervose possa essere ottenuta^9,10. IDISCO + ha vantaggi in quanto è compatibile con vari anticorpi e reporter fluorescenti^11,14, ed è dimostrato successo in molteplici organi e ritrovati anche¹⁴. Tuttavia, il suo limite principale è un tempo di incubazione lungo, in cui 18 a 20 giorni sono necessari per completare l'intero esperimento.

Un'altra importante applicazione della intero-monta la macchiatura è la visualizzazione di destino delle cellule in combinazione con un sistema di tracciatura di lignaggio. Lignaggio traccia è l'etichettatura di un gene/indicatore specifico in una cella può essere passato a tutte le cellule della figlia, che è conservato nel tempo¹⁵. Come tale, è un potente strumento che può essere utilizzato per determinare il destino di progenie^{15 di una cellula}. Dal 1990, il sistema ricombinante di Cre-LoxP è diventato un potente approccio per l'analisi di lignaggio in vita organismi¹⁵. Quando una linea di topo che esprime Cre, un enzima recombinase di DNA, è attraversata con un'altra linea di mouse che esprimono un reporter che è adiacente a una sequenza di loxP-STOP-loxP, la proteina reporter è espresso¹⁵.

Per intero-monta la colorazione, l'uso di reporter fluorescenti multicolor è adatto per formazione immagine del tessuto adiposo perché permette per la minima interferenza con attività intracellulare del adipocyte¹⁶. Tuttavia, reporter tradizionale in genere macchia il citoplasma, rendendo difficile rintracciare la discendenza di adipociti bianchi, che hanno limitato contenuto citoplasmico¹⁷. Per ovviare a questo problema, l'uso di marker di membrana-limitano fluorescente tdTomato/membrana eGFP (mT/mG) reporter è uno strumento ideale. Targeting per membrana tdTomato è espresso in Cre-negativo cellule¹⁸. Sull'asportazione di Cre, si verifica un interruttore per l'espressione di eGFP membrana-mirati, rendendo questo reporter adatto per rintracciare il lignaggio del adipocyte progenitori^17,18 (Complementare figura 1).

Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo dettagliato per intero-monta la macchiatura e mostrare come può essere combinato con altre tecniche per studiare lo sviluppo e la fisiologia del tessuto adiposo. Due esempi di applicazioni descritte in questo protocollo sono suo uso con linee del mouse 1) multicolor reporter per identificare origini diverse di adipociti e 2) tessuto di compensazione per visualizzare ulteriormente il arborization neurale nel tessuto adiposo bianco (WAT).

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di cura animale del centro per Phenogenomics (TCP) conformi agli standard del Consiglio canadese su Animal Care. Topi sono stati mantenuti su cicli di luce/buio di 12 h e forniti con libero accesso all'acqua e cibo. 7 mese vecchio topo maschio C57BL/6J sono stati usati nell'esperimento colorazione intero-monta.

Nota: Sezioni 1 e 2 sono in ordine cronologico, con la sezione 3 è un passaggio facoltativo subito dopo la sezione 1. Sezione 4 possono essere eseguite per analizzare la densità di dimensione e dei vasi sanguigni del adipocyte dopo il completamento della sezione 2.

1. i materiali preparazione e l'isolamento del tessuto

1. Preparare fresco 1% paraformaldeide (PFA) diluito in 1x tamponato fosfato salino (PBS) per fissaggio del tessuto. Preparare il tensioattivo non ionico 0,3%, diluito in PBS 1X (appresso denominato PBS-0.3T) per il tessuto successivo fasi di lavaggio.
   Nota: Per ogni tessuto, preparare circa 1,5 mL di 1% PFA per garantire completa immersione. Volume di fissazione può essere aumentata o diminuita a seconda delle dimensioni del tessuto.
   Attenzione: Questo passaggio è pericoloso, come PFA è corrosivo e tossico. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., guanti in nitrile, camice, scarpe, occhiali di sicurezza) e maniglia in una cappa aspirante.
2. Eutanasia animali secondo una procedura approvata (ad es., la dislocazione cervicale o asfissia di biossido di carbonio). Senza indugio, sezionare il tessuto adiposo desiderato depositi (ad es., tessuto adiposo bianco inguinale o tessuto adiposo bianco perigonadal)¹⁸.
3. Con le forbici di dissezione, tagliare il tessuto in 100 x 15 mm² piastra di Petri in pezzi circa 0,5 – 1 cm nel formato e immergerli nella microcentrifuga riempito con 1% PFA. Tenere il ghiaccio.

2. intero-monta la macchiatura del tessuto adiposo bianco

1. Dopo la dissezione è completa, è possibile spostare i campioni di tessuto in 1% PFA dal ghiaccio a temperatura ambiente (RT) per 1 h e poi trasferire i tessuti di una piastra di coltura cellulare di 12 o 24 pozzetti lavaggio più comodo.
2. Lavare i tessuti con PBS-0.3T, 3 volte per 5 min ciascuno in RT su un agitatore inclinato a 22 °, con inclinazioni di 20 – 25 al minuto come la velocità.
   Nota: Utilizzare questa inclinazione e velocità per tutti i passaggi successivi che comportano l'uso di uno shaker.
   Nota: Se si utilizza una linea di topo reporter multicolor come mT/mG e ulteriori macchiatura dell'anticorpo non è necessaria, il tessuto è pronto per microscopia dopo passo 2.2.
3. Aggiungere 0,5 – 1 mL di tampone bloccante (5% di siero animale diluito in PBS-0.3T). Mettere la piastra sull'agitatore e incubare per 1 h di RT.
4. Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere gli anticorpi primari diluiti in PBS-0.3T con 1% di siero animale.
5. Posizionare la piastra su un agitatore a 4 ° C durante la notte.
6. Il giorno dopo, lavare i tessuti con PBS-0.3T 3 volte per 5 minuti ciascuno di RT.
7. Utilizzare appropriati anticorpi secondari diluiti in PBS-0.3T. Aggiungere 0,5 – 1 mL anticorpo secondario soluzioni a ciascun pozzetto. Avvolgere la piastra in alluminio e incubare su un agitatore per 1 h a TA.
   Nota: Diluire l'anticorpo secondario al buio per evitare photobleaching.
8. Dopo l'incubazione anticorpo secondario, lavare con PBS-0.3T due volte per 5 min, ciascuno in RT. i campioni di immagine se non si desidera una macchia di lipidi neutri. Se la visualizzazione di goccioline lipidiche è necessario utilizzando il lipido neutro macchia, lavare con PBS 1X (senza tensioattivi non ionici) due volte, per 5 minuti ciascuno.
9. Dopo i passaggi di lavaggio, incubare con la macchia di lipido neutro diluita con fattore di diluizione di 1: 1500 in 1X PBS per 30 min in RT. I tessuti sono ora pronti per microscopia. Per l'imaging di futuro, i tessuti possono essere memorizzati in questa soluzione a 4 ° C.
   Nota: Qualità dell'immagine diminuisce nel tempo; quindi, il momento migliore per l'imaging è entro 1 o 2 giorni.
10. Usando il forcipe, appoggiare il tessuto sul vetrino coprioggetti 24 x 60 mm ² e posizionarlo su un sistema di microscopio invertito confocale laser.
11. Se si desidera la macchiatura dei nuclei con DAPI, aggiungere 1-2 gocce di mezzo di montaggio contenente DAPI per immergere il tessuto completamente e impediscono l'essiccazione.
12. Per ottenere immagini di intero-monta tinto tessuti a più piani focali, eseguire Z-pile di 100 – 150 μm in profondità con passaggio-dimensione: 4 – 6 μm presso l'ingrandimento desiderato.

3. tessuto schiarimento e Immunolabeling utilizzando iDISCO +

Nota: Questo protocollo è basato su procedure pubblicate in precedenza^9,10,19.

1. Fissazione e metanolo pre-trattamento
   1. Incubare i tessuti in 4% PFA diluito in PBS 1X a 4° C durante la notte in provette microcentrifuga da 2 mL.
      Nota: Lasciare i tessuti nei tubi da 2 mL per tutti i seguenti trattamenti fino a formazione immagine.
   2. Il giorno dopo, lavare i tessuti in PBS 1X tre volte, per 1 ora ciascuno su un agitatore a TA.
      Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione di lasciare il campione durante la notte a RT o 4 ° C.
   3. Disidratare i tessuti a RT a 20%, 40%, 60% e 80% metanolo, successivamente, per 1h ciascuna. Disidratare in metanolo al 100% a TA per 1 ora, poi trasferire i tessuti freschi 100% metanolo e incubare a 4 C per 1 h.
      Nota: Metanolo diluito in acqua distillata. Durante l'incubazione di metanolo, non c'è nessun bisogno di mettere i campioni su un agitatore, purché i campioni di tessuto sono immersi.
      Attenzione: Questo passaggio è pericoloso, come metanolo è tossico. È altamente infiammabile su fiamme libere. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante. Memorizzare il metanolo dalla accensione e in un armadietto di sicurezza infiammabile.
   4. Candeggiare i tessuti con 5% di perossido di idrogeno (H₂O₂; 1 volume del 30% H₂O₂ diluito in 5 volumi di 100% metanolo) durante la notte a 4 ° C.
      Attenzione: 30% di perossido di idrogeno è molto pericoloso su pelle e contatto con gli occhi. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante.
   5. Reidratare i tessuti a RT in 80%, 60%, 40% e 20% metanolo e 1x PBS, successivamente, per 1 ora ciascuna.
   6. Lavare con 0,2% di tensioattivo non ionico diluito in 1X PBS due volte, per 1h ciascuna su un agitatore a TA.
2. Immunolabeling
   Nota: Riempire i tubi di 2 mL contenente il tessuto alla parte superiore del tubo con la soluzione utilizzata in ogni passaggio per evitare l'ossidazione del tessuto appena immunolabeling comincia, fino a quando la compensazione è completato.
   1. Permeabilize tessuti incubando in una soluzione di 1X PBS, tensioattivo non ionico 0,2%, 20% di dimetilsolfossido (DMSO) e 0,3 M glicina a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 2 giorni.
      Nota: Il tempo massimo di incubazione per passaggio di permeabilizzazione di 37 ° C è 2 giorni.
   2. Bloccare i tessuti in una soluzione di 1X PBS, tensioattivo non ionico 0,2%, 10% DMSO, asino 5% siero e blocco Fc 1% a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 2 giorni.
      Nota: Il tempo massimo di incubazione per il passaggio di blocco è 2 giorni.
   3. Incubare i tessuti in anticorpi primari di interesse in una soluzione di PBS 1X, 0,2% polisorbato 20, 10 µ g/mL eparina, 5% DMSO e siero di asino di 5% a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 4 giorni.
   4. Lavare con 1x PBS, 0,2% polisorbato 20 e l'eparina 10 µ g/mL su un agitatore a RT cinque volte, ciascuno per 1 h.
      Nota: Questo passaggio può essere un punto di pausa per lasciare durante la notte campioni di RT.
   5. Incubare i tessuti con anticorpo secondario in una soluzione di PBS 1X, 0,2% polisorbato 20, 10 µ g/mL eparina e siero di asino di 5% a 37 ° C in un agitatore orbitale da tavolo per 4 giorni.
      Nota: Dal punto 3.2.5, tutti i campioni devono essere avvolti con carta stagnola per evitare che photobleaching di anticorpo secondario.
   6. Lavare tessuti in una soluzione di PBS, 0,2% polisorbato 20 e l'eparina 10 µ g/mL su un agitatore in RT: 1x cinque volte, per ogni 2h.
      Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione per lasciare i campioni durante la notte a TA.
3. Tessuto del tessuto adiposo bianco e imaging con volumi di compensazione
   1. Disidratare i tessuti contenuti in provette 2 mL incubando a 20%, 40%, 60% e 80% metanolo, successivamente, ciascuno per 1 ora a TA. Quindi, disidratare i campioni in metanolo al 100% due volte a TA.
      Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione di lasciare i vostri campioni in metanolo al 100% durante la notte a TA.
   2. Incubare i tessuti con una miscela di 2 volumi di DCM a 1 volume di metanolo per 3 h a RT su un agitatore.
      Nota: DCM è volatile. Assicurarsi che i tubi sono sigillati ermeticamente per evitare l'evaporazione.
      Attenzione: Questo passaggio è pericoloso. DCM è tossico su inalazione. L'esposizione prolungata può causare ustioni chimiche. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., guanti in nitrile, camice, scarpe, occhiali di sicurezza). Utilizzare una cappa aspirante.
   3. Incubare i tessuti in 100% DCM due volte, per 15 minuti ciascuno, su un agitatore a TA.
   4. Incubare in 100% DBE in RT fino a formazione immagine e per la conservazione dei campioni. Prima di formazione immagine, invertire i tubi più volte per mescolare le soluzioni.
      Nota: Riempire completamente i tubi con DBE per impedire l'ossidazione, che può portare nel tessuto infruttuoso di compensazione. Non agitare i tubi durante l'incubazione DBE.
      Attenzione: Questo passaggio è pericoloso. DBE è tossico. Può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante.
   5. Immagine per il campione di tessuto intero con un microscopio ottico che corrisponde l'indice di rifrazione del solvente organico DBE. Eseguire Z-stacking ad un ingrandimento desiderato e passo-size per l'intero tessuto.

4. esempi di analisi dei dati dall'intero-monta macchiato tessuto immagini usando ImageJ

Nota: Vedere https://imageJ.nih.gov/ij/download.html per le istruzioni di download e installazione.

1. Quantificazione della densità del vaso sanguigno (integrativa Figura 2)
   1. Importare le immagini salvate del solo canale con vaso sanguigno immunostaining su ImageJ.
      Nota: Le immagini per la quantificazione devono essere coerenti in termini di procedura di macchiatura e condizione di acquisizione immagine. Identici reagenti dovrebbero essere usati. Il tempo di esposizione, intensità e ingrandimento dovrebbe anche essere equivalente a imaging processo²⁰.
   2. Convertire l'immagine a colori in bianco e nero per la quantificazione di densità del vaso sanguigno. A tale scopo, sotto la scheda "Immagine" , selezionare il comando "Regola" , quindi l'opzione "soglia del colore" . La "soglia colore" visualizzare casella, scegliere "Dark Background"²⁰ e selezionare "B & W" sotto "soglia colore".
   3. Per misurare la percentuale di area del vaso sanguigno segnale sfondo, selezionare la scheda "Analizza" , quindi il comando di "analizzare particelle" . Sotto il display delle "particelle analizzati", selezionare le opzioni "risultati chiari" e "Summarize" . Fare clic su "OK".
   4. Copiare e incollare il valore dell'area percentuale sotto la scheda Riepilogo in un foglio di calcolo per l'analisi. La percentuale di area indicherà la densità del vaso sanguigno. Ripetere i passaggi 4.3.1–4.3.4 per ogni singola immagine.
2. Quantificazione dell'adipocita dimensioni²¹ (integrativa Figura 3)
   1. Importare le immagini salvate degli adipociti su ImageJ.
   2. Per impostare la scala dell'immagine, è necessario misurare la lunghezza della scala in pixel tracciando una linea alla scala con una distanza nota sull'immagine usando lo strumento selezione Straight-line. Sotto la scheda "Analizza" , selezionare il comando "Imposta scala" . La distanza della linea che è stata rintracciata prima viene calcolata automaticamente in pixel.
   3. Verrà visualizzata la finestra di visualizzazione di "Imposta scala" . Immettere la distanza nota e unità di lunghezza. Selezionare "Global" per applicare l'impostazione per tutte le immagini importate della scala e fare clic su "OK".
   4. Per scegliere la zona come il metodo di misurazione, sotto la scheda "Analizza" selezionare il comando "Set Measurements" . Verrà visualizzato un elenco di opzioni diverse per le misurazioni. Selezionare l'opzione "Area" e fare clic su "OK".
   5. Utilizzando lo strumento selezione a mano libera, tracciare il perimetro di ogni adipocita di interesse. Sotto la scheda "Analizza" , selezionare il comando "Misura (Ctrl + M)" e verrà visualizzata l'area dell'adipocita. Ripetere questa procedura per altri adipociti nell'immagine.
      Nota: Per garantire misure accurate, utilizzare più immagini per quantificazione.
   6. Copiare e incollare le misurazioni di zona in un foglio di calcolo per ulteriori analisi dei dati.

Risultati

A causa della fragilità del tessuto adiposo, metodi che coinvolgono più fasi di lavorazione e sezionamento possono condurre allo sfregio del tessuto adiposo morfologia³ (Figura 1A). Tuttavia, l'intero-monta la macchiatura può preservare la morfologia degli adipociti, assicurando la corretta interpretazione dei risultati (Figura 1B).

Sovra-fissazione del tessuto adiposo conduce ad autofluorescenza fissativo-i...

Discussione

Anche se le tecniche convenzionali come l'istologia e donatrici offrono benefici per osservando struttura intracellulare, intero-monta la macchiatura offre una prospettiva diversa nella ricerca del tessuto adiposo, che consente la visualizzazione in 3D del cellulare architettura del tessuto minimamente trasformato.

Per eseguire correttamente la macchiatura intero-monta, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Depositi di differenti del tessuto adiposo possono produrr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)