Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Özet

Yağ dokusu mimarisi ve hücresel bileşeni 3D görüntüleme için ideal bir yöntem olarak bütün Dağı immunostaining ve görselleştirme tekniği göstermek için çalışmanın odak noktasıdır.

Özet

Yağ dokusu yüksek plastisite ile önemli bir metabolik organ ve çevresel uyaranlara ve besin durum duyarlı. Bu nedenle, Morfoloji ve yağ dokusu biyoloji çalışmaya çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri 3D Mimarlık bütün organ yakalamak başarısız doku, 2D bölümlerde eğitim için sınırlıdır. Burada bütün-mount mevcut boyama, en az işlem adımları ile olduğu gibi yağ dokusu morfoloji korur bir immünhistokimya yöntemi. Bu nedenle, adipositler ve diğer hücresel bileşenleri yapılar dokusunun en iyi temsil eden 3 boyutlu görselleştirme elde bozulma korunur. Buna ek olarak, Bütün Dağı boyama hücre kader kararlar belirlemek için soy izleme yöntemleri ile birleştirilebilir. Ancak, bu teknik daha derin bölgelerinde yağ dokusu ile ilgili doğru bilgi sağlayan bazı sınırlamalar vardır. Bu sınırlamayı aşmak için bütün Dağı boyama daha fazla doku doku solukluk kaldırmak ve tüm yağ dokusu anatomi ışık sayfalık floresan mikroskopisi kullanılarak tam görselleştirme için izin vermek için teknikleri temizlenmesi ile kombine edilebilir. Bu nedenle, bir daha yüksek çözünürlük ve yağ dokusu yapıları daha doğru bir şekilde temsil bu tekniklerin birleşimi ile yakalanabilir.

Giriş

Yağ dokusu enerji depolama için önemli bir organdır ve dinamik remodeling ve neredeyse sınırsız genişleme¹ile karakterizedir. Enerji homeostazı yanı sıra yağ dokusu da tüm vücut metabolik fonksiyon²modüle için 50'den fazla adipokines hormon salgısı önemli bir rol oynar. Yağ dokusundan oluşan çeşitli mimari olgun adipositler, fibroblastlar, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri ve adipocyte progenitör hücrelerin³de dahil olmak üzere hücre türleri vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda obezite ve diğer metabolik fonksiyon bozukluğu önemli ölçüde yağ dokusu işlev ve hangi içerir ancak adipositler, iltihabi hücre infiltrasyonu genişleme için sınırlı değildir onun microenvironment değiştirebilirsiniz göstermiştir (Örneğin, makrofajlar) ve vasküler disfonksiyon³.

Histoloji ve cryosectioning gibi geleneksel morfolojik teknikleri gibi doku büzülme ve yapısı bozulma³' e^{yol açabilir uzun kimyasal işleme adımlarını adipose biyoloji okuyan bazı sınırlamaları göstermek, 4}. Ayrıca, bu 2D teknikler elde edilen bölümler tüm doku³daha küçük bölgelere sınırlı olarak hücreler arası etkileşimler tarafından farklı hücre tipleri, sarf gözlemlemek yetersizdir. Floresan görüntüleme kıyasla geleneksel yöntemleri, Bütün Dağı boyama katıştırma, kesit ve su kaybı gibi ek invaziv adımları gerektirmez; Böylece, bu antikor özgüllük azalan sorunu önler. Bu nedenle, adipocyte Morfoloji ve genel yağ doku yapısı⁵daha iyi korunması ile görüntüleme yağ dokusu için basit ve etkili bir yöntem olduğunu. Bu nedenle, bütün bir hızlı ve ucuz immunolabeling Teknik yağ dokusu 3D Mimarlık^1,6,7,8korumak için belirlenen boyama monteli.

Ancak, Bütün Dağı boyama kullanımı ile yağ dokusu morfoloji korunması rağmen bu teknik dokusunun lipid yüzeyin altında iç yapıları görselleştirmek hala değiştiremiyor. Birkaç son çalışmalar^9,10 yağ dokusu içinde kapsamlı 3D görüntüleme için izin vermek için bütün-mount immunolabeling^1,6 ile birlikte teknikleri takas doku kurduk. Özellikle, yoğun nöral ve damarlara ağları son çalışmalar^9,10,11,12 ile 3B cilt görüntüleme görüntülenir. Nitekim, Yağ dokusundan farklı fizyolojik koşullar altında sinir ve damar plastisite eğitim onun biyoloji çalışma için gerekli olduğunu. Immunolabeling etkin üç boyutlu görüntüleme solvent temizlenmiş organlar (iDISCO +) doku Temizleme metanol öncesi tedavisi, immunolabeling, oluşan ve organik kimyasal reaktifler diklorometan (DCM ile doku solukluk, takas bir süreçtir ) ve dibenzyl eter (DBE)^13,14. Yağ dokusu tamamen saydam yaparak, kan damarları ve sinir lifleri gibi doku içinde anatomi daha doğru bir temsil^9,10elde edilebilir. IDISCO + çeşitli antikor ve floresan gazetecilere^11,14ile uyumlu ve birden fazla organ ve hatta embryoes¹⁴başarı göstermiş olduğu avantajları vardır. Ancak, onun ana sınırlama 18-20 gün tüm deney tamamlamak için gerekli olan bir uzun bir kuluçka zamanı geldi.

Bütün Dağı boyama başka bir önemli hücre kaderi bir soy izleme sistemi ile birlikte görselleştirme bir uygulamadır. Soy izleme tüm kızı hücrelere geçişini sağlamak ve zaman¹⁵korunmuş bir hücreye belirli bir gen/işaretleyici etiketleme olduğunu. Bu nedenle, bu bir hücrenin Döl¹⁵kaderini belirlemek için kullanılan güçlü bir araçtır. 1990'lardan beri Cre-LoxP rekombinant sistem soy izleme yaşam için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir organizmalar¹⁵. Ne zaman bir loxP-STOP-loxP dizisine bitişik bir muhabir ifade başka bir fare çizgi ile Cre, bir DNA recombinase enzim ifade eden fare haddini aştı, ifade¹⁵muhabir proteindir.

Bütün Dağı boyama için floresan çok renkli gazetecilere kullanımı adipocyte¹⁶hücre içi faaliyetleri ile minimal girişim için izin verdiği için yağ dokusunun görüntüleme için uygundur. Ancak, geleneksel gazeteciler genellikle sitoplazmik içerik¹⁷sınırlı beyaz adiposit soyundan izini zorlaştırır sitoplazma, leke. Bu sorunu çözmek için floresan tdTomato membran/membran bağlı eGFP (mT/mG) muhabir işaret kullanımını ideal bir araçtır. TdTomato membran hedefli Cre-negatif hücreleri¹⁸' ifade edilir. CRE eksizyon membran hedefli eGFP ifade için bir geçiş oluşur, bu muhabir adipocyte ataları^17,18 (Ek şekil 1) soy izleme için uygun yapma.

Bütün Dağı boyama için detaylı bir protokol sağlar ve geliştirme ve yağ dokusu fizyolojisi çalışmaya diğer teknikleri ile birleştirilmesi göstermek için bu kağıt amacı budur. İki uygulamalar bu iletişim kuralında tanımlanan kullanımı adiposit ve 2) doku daha fazla beyaz Yağ dokusundan (WAT) sinir arborization görselleştirmek için takas çeşitli kökenleri tanımlamak için 1) çok renkli muhabir fare çizgili örnekleridir.

Protokol

Phenogenomics (TCP) Hayvan Bakımı Kanada Konseyi standartlarına standartlarla uyumlu için tüm deneysel hayvan iletişim kuralları Center hayvan bakımı Komitesi tarafından kabul edildi. Fare 12-h açık/koyu döngüleri muhafaza ve ücretsiz erişim su ve yemek için sağladı. 7 ay bütün Dağı boyama deneyde eski C57BL/6J erkek fareler kullanıldı.

Not: Bölüm 1-2 Bölüm şu Bölüm 1 sonra isteğe bağlı bir adım olmanın 3 ile kronolojik sırayla vardır. Bölüm 4 bölümü 2 tamamlanmasından sonra adipocyte boyut ve damar yoğunluğu çözümlenecek gerçekleştirilebilir.

1. malzeme hazırlama ve doku yalıtım

1. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) doku fiksasyon için x seyreltilmiş taze %1 paraformaldehyde (PFA) hazırlayın. 1 x PBS içinde seyreltilmiş % 0,3 Nonyonik yüzey aktif hazırlamak (bundan sonra PBS anılacaktır-0.3T) sonraki doku adımları yıkama için.
   Not: her doku için yaklaşık 1,5 mL % 1'lik hazırlamak PFA komple daldırma emin olmak için. Fiksasyon birim artırılması veya doku boyutuna bağlı olarak azaltılması.
   Dikkat: PFA aşındırıcı ve zehirli olduğu gibi bu adım, zararlıdır. Aşınma kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, Ayakkabı, koruyucu gözlük) ve tanıtıcı bir duman Hood.
2. Hayvanlar (Örneğin, servikal çıkık ve/veya karbon dioksit boğulma) onaylı bir yordam göre ötenazi. Gecikme olmadan istenen yağ dokusu depoları (Örneğin, kasık beyaz yağ dokusu veya perigonadal beyaz yağ dokusu)¹⁸incelemek.
3. Diseksiyon makasla doku parçaları yaklaşık 0,5-1 cm boyutunda bir 100 x 15 mm² Petri kabına oyulmuş ve onları %1 ile dolu microcentrifuge tüpler bırakın PFA. Buz üstünde tutun.

2. bütün monte beyaz yağ dokusunun boyama

1. Diseksiyon tamamlandıktan sonra doku örnekleri % 1'hareket sıcaklık (RT) 1 h için oda ve 12 veya 24 iyi hücre kültür plaka daha hızlı yıkama için belgili tanımlık doku aktarmak için İngiltere'de yılın buz.
2. PBS kurcalayarak yıkama-5 dk her bir shaker üzerinde RT 20 – 25 Eğer min hızı olarak başı ile 22 ° eğik için 3 kez 0.3T.
   Not: Bu Full tilt ve hız bir shaker kullanımını içeren tüm izleyen adımları için kullanın.
   Not: Eğer bir çok renkli muhabir fare çizgi gibi mT/mG ve ek kullanarak antikor boyama gerekli değildir, doku-den sonra adım 2.2 Mikroskopi için hazırdır.
3. 0.5-1 ekleyin mL engelleme arabellek (%5 hayvan serum PBS içinde seyreltilmiş-0.3T). Shaker üzerinde plaka koymak ve RT. 1 h için kuluçkaya
4. Engelleme çözüm Aspire edin ve birincil antikorlar PBS içinde seyreltilmiş eklemek-% 1 hayvan serum ile 0.3T.
5. Yer plaka üzerinde bir shaker 4 ° C'de bir gecede.
6. Ertesi gün, PBS kurcalayarak yıkama-0.3T 3 kez için 5 dakika her RT.
7. PBS içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar kullanın-0.3T. Eklemek 0.5-1 mL ikincil antikor çözümler her şey için. Alüminyum folyo plaka sarın ve RT. 1 saat bir shaker üzerinde kuluçkaya
   Not: photobleaching önlemek için karanlıkta ikincil antikor sulandırmak.
8. İkincil antikor kuluçka sonra PBS ile yıkama-0.3T 5 dk, her dik için iki kez resim örnekleri tarafsız lipid leke değil isterseniz. Görselleştirme lipid damlacıkları ise tarafsız lipid kullanarak leke, 1 x PBS (olmadan iyonik olmayan yüzey aktif) ile iki kez, 5 min her yıkayın.
9. Çamaşır adımları sonra 1:1500 seyreltme faktörü 1 x PBS için 30 dk içinde RT. ile seyreltilmiş tarafsız lipid leke ile kuluçkaya Dokular Mikroskopi için hazırsınız. Gelecekte görüntüleme için belgili tanımlık doku 4 ° c Bu çözümde saklanabilir
   Not: kalite Imaging zaman içinde azalır; Bu nedenle, en iyi görüntüleme için 1 veya 2 gün içinde zamanı.
10. Forseps kullanarak, doku düz bir 24 x 60 mm ² cam coverslip yatıyordu ve bir ters confocal lazer mikroskop sistemde yerleştirin.
11. Çekirdeği ile DAPI, boyama isterseniz, DAPI tamamen doku daldırın ve kurumasını önlemek için içeren montaj orta 1-2 damla ekleyin.
12. Bütün Dağı dokuları birden çok odak düzlem, lekeli görüntüler elde etmek için Z-100-150 mikron yığınları ile 4-6 mikron adım-büyüklük istenen büyütmede derinlemesine gerçekleştirin.

3. doku takas ve Immunolabeling kullanarak iDISCO +

Not: Bu protokolü daha önce yayımlanmış yordamlar^9,10,19tarihinde dayanır.

1. Fiksasyon ve metanol ön arıtma
   1. %4 1 x PBS gecede 2 mL microcentrifuge tüpler içinde 4 ° C'de PFA seyreltilmiş dokularda kuluçkaya.
      Not: belgili tanımlık doku 2 mL tüpler aşağıdaki tedaviler için görüntüleme kadar bırakın.
   2. Ertesi gün, 1 x PBS dokularda için 1 saat her bir shaker RT., üç kez, yıkama
      Not: Bu adımı örneği RT veya 4 ° c'gecede bırakmak duraklatma bir noktası olabilir
   3. % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol, RT, dokularda daha sonra 1 h her kurutmak. RT, % 100 metanol içinde 1 saattir kurutmak sonra dokular için taze % 100 metanol aktarmak ve 4 c 1 h için kuluçkaya.
      Not: metanol distile su oranında seyreltin. Metanol kuluçka sırasında doku örnekleri daldırılır sürece bir shaker örnekleri koymak gerek yoktur.
      Dikkat: metanol zehirli olduğu gibi bu adım, zararlıdır. Açık alevler çok kolay alevlenebilir. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu. Metanol ateşleme mesafede ve yanıcı bir emanet dolabında saklayın.
   4. %5 hidrojen peroksit (H₂O₂; %5 100 metanol cilt olarak seyreltilmiş % 30 H₂O₂ 1 hacmi) kurcalayarak gecede 4 ° C'de çamaşır suyu
      Dikkat: %30 hidrojen peroksit cilt ve göz teması çok tehlikeli. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu.
   5. %80, % 60, % 40 ve % 20 metanol ve 1 x PBS, RT, dokularda daha sonra her biri 1 saat için suyla temasa.
   6. 1 x PBS içinde iki kez, 1 h her bir shaker RT. adlı için seyreltilmiş % 0,2 Nonyonik yüzey aktif yıkayın
2. Immunolabeling
   Not: takas tamamlanıncaya kadar immunolabeling başlar başlamaz doku oksidasyonu önlemek için her adımda kullanılan solüsyon ile doku tüpün üst içeren 2 mL tüpler doldurmak.
   1. Dokuları onları 1 x PBS, % 0,2 Nonyonik yüzey aktif, % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ve 0,3 M glisin inkübe bir masa üstü orbital çalkalayıcı olarak 37 ° C'de bir çözümde iki gündür kuluçka tarafından permeabilize.
      Not: 2 gün 37 ° C permeabilization adımın maksimum kuluçka zamanı geldi.
   2. Bir çözüm 1 x PBS, % 0,2 Nonyonik yüzey aktif, % 10 DMSO, % 5 eşek serum ve % 1 Fc blok üzerinde bir inkübe masa üstü orbital çalkalayıcı 37 ° C'de ve dokularda 2 gündür engelleyin.
      Not: Maksimum kuluçka engelleme adım 2 gün zamanı.
   3. 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20, bir çözümde ilgi birincil antikorlar dokularda kuluçkaya 10 µg/mL heparin, %5 DMSO ve 4 gün boyunca inkübe masa üstü orbital çalkalayıcı olarak 37 ° C'de % 5 eşek serum.
   4. 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20 ve 10 µg/mL heparin vermeye bir shaker RT beş kez, her biri için 1 h, yıkayın.
      Not: Bu adım bir duraklama noktası örnekleri gece RT. içinde bırakın olabilir
   5. 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20, bir çözümde ikincil antikor kurcalayarak kuluçkaya 10 µg/mL heparin ve 4 gün için bir masa üstü orbital çalkalayıcı üzerinde 37 ° C'de % 5 eşek serum.
      Not: 3.2.5 adımından tüm örnekleri ikincil antikor photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış olması gerekiyor.
   6. Bir çözüm 1 x PBS, % 0,2 polysorbate 20 ve 10 µg/mL heparin vermeye bir shaker RT dokularda 2 h her beş kere yıkayın.
      Not: Bu adımı örnekleri gece RT. bırakın için duraklatma bir noktası olabilir
3. Doku takas beyaz yağ dokusu ve birim görüntüleme
   1. % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol, daha sonra her 1 saatte RT. için kuluçka tarafından 2 mL tüpler içinde bulunan doku kurutmak O zaman, % 100 metanol RT. adlı iki kez örneklerinde kurutmak
      Not: Bu adım'da % 100 metanol RT. adlı gecede örneklerinizi ayrılmasına izin duraklatma bir noktası olabilir
   2. DCM 2 Cilt 1 metanol RT bir shaker tarih itibariyle 3 h için hacmiyle karışımı kurcalayarak kuluçkaya.
      Not: DCM kırılgandır. Tüpler buharlaşma önlemek için sıkı kapalı emin olun.
      Dikkat: Bu tehlikeli adımdır. DCM inhalasyon zehirlidir. Uzun süre maruz potansiyel olarak kimyasal yanıklara neden. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, Ayakkabı, koruyucu gözlük) giymek. Bir duman başlığı kullan.
   3. % 100 DCM ve dokularda iki kez 15 dakika her bir shaker RT., üzerinde kuluçkaya.
   4. % 100 kuluçkaya DBE RT kadar görüntüleme ve örnek depolama için. Görüntüleme önce tüpler çözümleri karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin.
      Not: Tüpler DBE temizlenmesi başarısız dokusunda neden olabilir oksidasyonu önlemek için ile eksiksiz doldurunuz. Tüpler DBE kuluçka sırasında sallama.
      Dikkat: Bu tehlikeli adımdır. DBE zehirlidir. Gözleri ve cildi tahrişe neden olabilir. Kişisel koruyucu donanım (Örneğin, nitril eldiven, önlük, gözlük) giymek ve duman mahallede kolu.
   5. Bütün doku örneği organik çözücü DBE kırılma indisini eşleşen ışık mikroskopla görüntü. Z-istifleme istediğiniz büyütme ve adım-boyu bütün doku için gerçekleştirin.

4. bütün-mount gelen veri analizi örnekleri ImageJ kullanarak doku görüntüleri lekeli

Not: https://imageJ.nih.gov/ij/download.html indirme ve yükleme yönergeleri için bkz.

1. Miktar damar yoğunluğu (ek Şekil 2)
   1. Sadece kanal ile damar immunostaining ImageJ üzerine kaydedilmiş görüntüleri içe.
      Not: Miktar görüntülerde boyama prosedürü ve görüntü alma durumu açısından tutarlı olması gerekir. Aynı reaktifler kullanılmalıdır. Pozlama süresi, şiddeti ve büyütme da görüntüleme işlemi²⁰dakikaya eşdeğer olmalıdır.
   2. Resmin rengini siyah-beyaz kan damarı yoğunluğu miktar için dönüştürün. "Görüntü" sekmesi altında bunun için "Ayarlama" komutu, sonra "renk eşiği" seçeneğini seçin. İçinde "eşik renk" kutusunu görüntülemek, "Koyu arka plan"²⁰ ve "Siyah-beyaz" altında "eşik renk"seçebilirsiniz.
   3. Kan damarı sinyal alanı yüzdesini arka planı ölçmek için "Çözümlemek" etiket, o zaman "parçacıklar analiz" komutunu seçin. Parçacıkların "analiz"görüntüle'nin altında "net sonuçlar" ve "Özetleme" seçeneklerini seçin. "Tamam"düğmesini tıklatın.
   4. Kopyalayabilir ve Özet sekmesinin altındaki yüzde alan değerini analiz için bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz. Damar yoğunluğu alanı yüzdesini belirtir. Adımları 4.3.1–4.3.4 bireysel her görüntü için tekrarlayın.
2. Miktar adipocyte boyutu²¹ (ek Şekil 3)
   1. Adiposit ImageJ üzerine kaydedilmiş görüntüleri içe.
   2. Görüntü ölçeğini ayarlamak için normal amortisman seçim aracıyla görüntüde bilinen uzaktan ölçeğiyle hattına izini sürerek ölçeğin piksel cinsinden uzunluğunu ölçmek. "Analiz" sekmesinde, "Ölçeği Ayarla" komutunu seçin. Daha önce takip ettiler satırı mesafesi otomatik olarak piksel cinsinden hesaplanır.
   3. "Ölçeği Ayarla" ekran kutu-ecek gözükmek. Bilinen uzaklık ve uzunluk birimi girin. Ölçeğin tüm içe aktarılan görüntüler için ayarlama uygulamak ve tıkırtı "OK"için "Global" seçin.
   4. "Analiz" sekmesi altında ölçüm yöntemi olarak alan seçmek için "ayarla ölçümleri" komutunu seçin. Ölçümler için farklı seçenekler listesi görüntülenir. "Alan" seçeneğini seçin ve "Tamam"ı tıklatın.
   5. Serbest seçim aracını kullanarak, her adipocyte ilgi çevre izleme. "Analiz" sekmesi altında "Ölçü (Ctrl + M)" komutunu seçin ve adipocyte alanında görüntülenecek. Resimdeki diğer adiposit için bu yordamı yineleyin.
      Not: doğru ölçümler sağlamak için miktar için birden çok görüntüyü kullanın.
   6. Kopyalayın ve alan ölçüleri daha fazla veri analiz için bir elektronik tabloya yapıştırın.

Sonuçlar

Yağ dokusu kırılganlık nedeniyle, birden çok işlem adımları içeren ve kesit yöntemleri yağ dokusu morfoloji³ (resim 1A) şekil bozukluğu için yol açabilir. Ancak, Bütün Dağı boyama sonuçları (Şekil 1B) doğru yorumlanması sağlanması adipositler, morfoloji koruyabilirsiniz.

Aşırı yağ dokusu fiksasyonu sabitleştirici kaynaklı autofluorescence yol açar. Şekil 2A...

Tartışmalar

Histoloji ve cryosection gibi geleneksel teknikleri hücre içi yapısı gözlemlemek için avantajlar, Bütün Dağı boyama cep 3D görselleştirme sağlar yağ dokusu araştırma farklı bir bakış açısı sağlar minimal işlenmiş doku mimarisi.

Bütün Dağı boyama başarıyla gerçekleştirmek için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. Farklı yağ dokusu depoları çeşitli immunostaining sonuçlar olabilir; Bu nedenle, kullanılan yağ dokusu depo türünü ilk tespit ed...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LipidTox	Life Technologies	H34477
PECAM-1 primary antibody	Millipore	MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody	Millipore	AB152, AB1542
DAPI stain	BD Pharmingen	564907
Nikon A1R confocal microscope	Nikon		Confocal microscope
Ultramicroscope I	LaVision BioTec		Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies	Jackson ImmunoResearch		Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BioSciences	553141
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dibenzyl-ether	Sigma-Aldrich	33630
Methanol	Fisher Chemical	A452-1
30% Hydrogen Peroxide	BIO BASIC CANADA INC	HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Glycine	Sigma-Aldrich	J7126
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled	VECTOR LABORATORIES	FLK-2100
F4/80	Bio-Rad	MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	VECTOR LABORATORIES	H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)