إنشاء ملامسة Colonic في الفئران

Summary

تسرب أناستوموتيك أو انهيار بعد الجراحة سبب رئيسي للوفيات والمراضة بعد العملية الجراحية. لدينا الجراحة لخلق ملامسة colonic طريقة موثوقة واستنساخه لدراسة آليات الشفاء من أناستوموسيس.

Abstract

أناستوموسيس المعوية تتم عادة في العمليات الانتخابية والناشئة على حد سواء. وحتى مع ذلك، تسرب أناستوموتيك مضاعفات شديدة يخشى العمليات الجراحية colonic ويمكن أن يحدث في تصل إلى 26% أناستوموسيس الجراحية، مع معدل الوفيات التي تصل إلى 39 في المائة للمرضى الذين يعانون من تسرب من هذا القبيل. حاليا، لا يزال هناك ندرة في البيانات تفاصيل الآليات الخلوية للشفاء أناستوموتيك. وضع استراتيجيات وقائية وأساليب العلاج لتسرب أناستوموتيك يمكن أن تكون إلى حد كبير بوتينتياتيد بفهم أفضل للشفاء أناستوموتيك المناسبة.

مورين نموذج مثالي كما أظهرت الدراسات السابقة أن ملامسة مورين هو الأكثر سريرياً مماثلة للحالة البشرية مقارنة بنماذج حيوانية أخرى. نحن نقدم نموذجا مورين استنساخه بسهولة من ملامسة colonic في الفئران التي ستسمح لمزيد التوضيح للشفاء أناستوموتيك.

Introduction

مضاعفات شديدة يخشى من ملامسة الجراحية من الأمعاء هو انهيار أناستوموتيك أو تسرب. تسرب أناستوموتيك، الذي يسبب تسرب محتويات إينترالومينال في تجويف البطن، وهو يهدد الحياة ويمكن أن تؤدي بسرعة إلى الانتان داخل البطن؛ صدمة أسعار تتفاوت من 0.3% إلى 5.5% بعد أناستوموسيس الأمعاء، وترتفع إلى بين 0.5% و 26%^1،أناستوموسيس colonic². يمكن أن تكون معدلات الوفيات بعد تسرب يصل إلى 39% بسبب بداية سريعة للانتان والتقدم السريع للموت بعد تلوث إينترابدومينال³. حاليا تستند استراتيجيات وقائية وطرائق العلاج الفيزيولوجيا المرضية التي ليست مفهومة تماما.

حاليا، شفاء أناستوموتيك هو غالباً مقارنة بشفاء الجروح الجلدية درس على نطاق واسع، مما يبرهن على أنه رسالة بفاكس فقيرة نسبيا. الشفاء يحدث في سلسلة من المراحل المتداخلة، بدءاً بالمرحلة الأولى متخلفة. خلال أيام 0-4 بعد إنشاء مفاغره معوية، يعرف استجابة التهابات حادة أن يزيل جرح الحطام الخلوية مرحلة انتقالية. المقبل، على مدى أيام 3-4، يجسد انتشار الليفية وإنتاج الكولاجين في مرحلة فيبروفاسيا. وأخيراً، بعد يوم 10، المعروف فترة طويلة من إعادة عرض الكولاجين مرحلة النضج. من المهم أن نلاحظ أن قوة أناستوموتيك منخفضة جداً، ويعتمد على دعم خارجية من دبابيس توضع جراحيا أو خياطة حتى الكولاجين هو المودعة⁴. فهم الدور وتوقيت كل طبقة جدار الأمعاء يلعب في التئام الجروح أناستوموتيك والمشاركة في أنواع الخلايا الملتهبة بوساطة مثل الضامة، فضلا عن توضيح علامات بديلة للتنبؤ بالفشل أناستوموتيك أو يمكن النجاح يقلل كثيرا من الاعتلال والوفيات، ونفقات الرعاية الصحية في أعقاب عمليات القولون⁵.

نموذج مورين ثبت في دراسات سابقة مفيدة في محاكاة ملامسة الإنسان⁶. وفي حين توجد أمثلة شعبية ومجربة ومدروسة من طراز أناستوموتيك colonic مورين، ولا سيما الطريقة الموضحة كومن et al. ⁷، لصالح هذه النماذج اللفائفيه أو تصاعدي كولوكولونيك تقنيات أناستوموتيك⁸. وقد أثبتت الدراسات السابقة للمرضى البشر اختلاف كبير في معدلات التسرب بين اللفائفيه وكولوكولونيك وأناستوموسيس القولون والمستقيم، تسليط الضوء على الحاجة إلى المزيد من النماذج التجريبية في مختلف المواقع التشريحية. أساليب إضافية، وتستخدم شعبيا تهدف إلى تطوير نموذج الذي يقوم عمدا تسرب أناستوموتيك بدلاً من توضيح الآليات الخلوية اللازمة للجرح أناستوموتيك الطبيعي شفاء⁹. نماذج الفئران حاولت في الماضي ولكن لديها معدلات ديهيسسينسي أناستوموتيك و/أو علامات تسرب (أي تشكيل الخراج) أقل بكثير من البشر والفئران^6،7. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر خطوط تجريبية أكثر وراثيا في الفئران من الفئران. وهذا يجعل من نموذج الفئران أقل فائدة لطراز أناستوموتيك. وبالإضافة إلى ذلك، كان الخنزير والكلاب نماذج التحقيق السريرية أقل من^6،النموذجي موريني⁷.

ونحن نقترح إجراء آمنة وبسيطة من الناحية التقنية، واستنساخه بسهولة وسرعة لإنشاء أناستوموسيس colonic في نموذج مورين ينبغي تسهيل التحقيق في إليه التبليغ من الجرح أناستوموتيك الشفاء¹⁰ .

Protocol

البروتوكول التالية قد تم بموافقة جامعة أوكلاهوما العلوم المركز المؤسسي الحيوان الرعاية الصحية واستخدام اللجنة (IACUC) ويتوافق مع جميع المبادئ التوجيهية الأخلاقية المؤسسية فيما يتعلق باستخدام الحيوانات في البحوث. بالإضافة إلى ذلك، أجريت جميع التجارب وفقا للأنظمة المؤسسية والدولة الاتحادية فيما يتعلق بالبحوث الحيوانية التجريبية.

ملاحظة: لهذا البروتوكول، استخدمنا الفئران C57BL6/ي ولدت في كونجينيك الذكور والإناث في 12 إلى 72 أسبوعا عمر. وأبقى جميع الفئران المستخدمة لهذا الإجراء في منشآتنا غير الحاجز لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل العملية للتكيف مع المنطقة الأحيائية المحلية. سمح للحيوانات بالأعلاف لوقت العملية وقمنا باستخدام إعداد الأمعاء الميكانيكية عن طريق الفم لا بيغ المستقيم قبل الإجراء.

1) إنشاء أناستوموسيس

1. اﻷوتوكﻻف الحارة الحل الري المالحة الأدوات الجراحية، ودقة تنظيف جميع الأسطح المنطوق مع الإيثانول 70%.
2. للحث على التخدير، ضع الماوس في مربع توجيهي المتصل المبخر. تسليم إيسوفلوراني 2-3% في 1-2 لتر في الدقيقة حتى يتم مخدراً الفئران.
3. مكان الحيوان على جهاز الاحترار، مثل وسادة تدفئة، للحيلولة دون انخفاض درجة حرارة الجسم.
4. حقن تحت الجلد جرعة مرة من البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ (ميكروغرام 3 ماوس 30 جرام) للمسكنات بعد العملية الجراحية، ومرة واحدة جرعة 10 مغ/كغ من انروفلوكساسين للاتقاء بالمضادات الحيوية قبل الجراحة.
   ملاحظة: على الرغم من المضادات الحيوية قبل وبعد الجراحة ليست مطلوبة من أجل هذه العملية، المبادئ التوجيهية المؤسسية والحيوان الرعاية واستخدام اللجنة في مؤسستنا يوصي باستعمالها في منشآتنا.
5. ضع مخروط الآنف مخدر حول الآنف الماوس. طوال العملية، ورصد معدل التنفس للحيوان بعناية وضبط معدل تدفق مخدر حسب الحاجة. المحافظة على معدل التنفس في 30-40 الأنفاس في الدقيقة الواحدة.
6. استخدام ماكينة قص شعر يليه عامل مزيل الشعر لإزالة الشعر من سطح الجلد كله البطن. دقة إزالة عامل مزيل الشعر مع الشاش تبلل بالماء أو 70 في المائة من الإيثانول. دقة الجاف للحيوان.
7. قبل الاستعداد البطن، الشريط أطرافه الماوس إلى لوحة تدفئة أو السطح المنطوق في نهاية كل ساق للحيلولة دون تحول أثناء الجراحة الماوس. تطهير البطن مع الكلورهيكسيدين. وتشمل منطقة حلق بأكملها، فضلا عن الشعر على حواف منطقة حلق. ضع ثني عقيمة على الماوس (الشكل 1A).
   1. قبل اللف، قطع نافذة صغيرة مستطيلة أو مغزليا في ثني لفضح البطن بريبيد.
      ملاحظة: ينبغي فضح البطن كامل الماوس الإطار لكن تغطي أطرافه والذيل والرأس والصدر. نحن قص نافذة² 4 × 3 سم لعملياتنا (الشكل 1B).
   2. جعل فتحه صغيرة على طول خط الوسط ثني، من الحافة السفلية نحو النافذة مغزليا أو مستطيلة، للسماح بالوصول إلى المستقيم أثناء الإجراء (الشكل 1).
8. جعل شق جلد. ابدأ على طول خط الوسط من أسفل البطن وجدا الجلد مع مقص عمودياً إلى الرهابه. جداً فقط الجلد وتجنب قص عضلات جدار البطن (الشكل 2A).
9. فهم خط الوسط جدار البطن بالملقط ورفع بعيداً عن محتويات البطن. مع الحرص على عدم إيذاء الهياكل إينترابدومينال، جداً طول لفافة البطن خط الوسط عمودياً مع مقص حاد. تمديد فترة شق الجلد (الشكل 2).
10. عندما تتعرض الأمعاء، حدد موقع الأعور والأمعاء، وتدوير الأحشاء من جانب اليسار ميديالى لكشف تنازلي والقولون السيني. معطف نصيحة مسبار حادة مع التشحيم هلام وتقدم التحقيق بعناية في المستقيم للمساعدة في التعرف على القولون تنازلي/سينية (الشكل 3).
    ملاحظة: على خلاف البشر، الأعور الماوس هو عموما وجدت في الربع العلوي الأيمن من البطن. الحرص على عدم ثقب في جدار الأمعاء بالتحقيق في هذه الخطوة. إذا كان هو ثقب جدار الأمعاء، إنهاء الإجراء و euthanize الماوس.
    1. تجنب تتشبث الأعور مع ملقط مسنن أو حادة. بدلاً من ذلك استخدام الملقط أتروماتيك، والقطن قضيب مقلوب، أو التلاعب بأصبع لطيف لتدوير الأحشاء.
    2. استخدام درجة حرارة المحلول الملحي العقيمة كفالة إبقاء الأمعاء المكشوفة رطبة طوال فترة الإجراءات.
    3. القولون سيكون على الجهة اليسرى من خط الوسط، وتعلق على ريتروبيريتونيوم عبر في مساريق. بعد تحديد الهوية، سحب التحقيق كليلة جزئيا لتسهيل كولوتومي.
11. أداء كولوتومي عرضية من القولون السيني.
    1. فهم بلطف القولون السيني متفوقة إلى مدخل الحوض مع الملقط أتراوماتيك (الشكل 4 أ).
    2. باستخدام مقص صغيرة حادة، جعل قطع عبر القولون السيني عمودي على اتجاه القولون وتوسيع نطاق عرض القولون في 80-90%. هذا سيساعد على منع سحب واحدة من نهاية القولون خارج الحقل الجراحي، وتسهيل إصلاح (الشكل 4 باء).
    3. إذا هو إصابة الأوعية الدموية المساريقي العلوي أثناء الدوران الحشوي أو كولوتومي، اضغط بلطف الضغط ليصل إلى 2 دقيقة مع شاش أو قضيب القطن ذات الرؤوس. إذا استمر النزيف بعد هذا الوقت، ضع رقم من ثمانية 8-0 شعيرات خياطة حول هذه النقطة من النزيف.
       ملاحظة: إذا كانت الأمعاء يظهر علامات نخر أو الإصابة بعد هذا، إنهاء الإجراء و euthanize الماوس باستخدام طريقة إنسانية وافقت عليها اللجنة الخاصة بك استخدام الحيوان المؤسسية.
12. إصلاح كولوتومي سينية.
    1. استخدام برنامج تشغيل إبرة كاستروفيجو، مكان توقف بسيطة 8-0 5-6 غرز البوليبروبيلين نونابسوربابل لإصلاح كولوستومي. وضع خياطة الجروح 1 ملم بعيداً عن بعضها البعض مع لدغات 0.5 مم.
       1. الحرص على تجنب المتداول حواف الأمعاء إلى الإصلاح بأخذ serosa أكثر قليلاً من الغشاء المخاطي مع كل غرزة. ترك ذيول طويلة 5 ملم. العناية لا بقصد الصيد الأمعاء المحيطة إلى الخياطة (الشكل 4).
          ملاحظة: أنه من المفيد أن يبدأ خياطة في بالقرب من الحدود المساريقي العلوي من كولوتومي، حفظ الجزء المضادة بعد معظم ميسينتيريك من كولوتومي لآخر.
       2. كما تقدم إصلاح، مقدما عبر الشرج مقلوب بلانت التشريح مسبار تمتد الإصلاح قبل أن يتم وضع خيوط النهائية. هذا سيساعد على منع ضيقة للغاية إصلاح وانخفاض معدلات تضيق أناستوموتيك.
13. باستخدام حقنه 10 مل مليئة بحرارة المياه المالحة، ري البطن عدة مرات. إذا كان السطح أسفل الماوس يصبح غارقة، جاف الماوس أو تحريك الماوس لسطح جاف لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم.
    1. استخدام شاش معقم على الشق لامتصاص فائض الري.
    2. في الري النهائي، ملء البطن مع المالحة العقيمة. تقدم أنجيوكاثيتير ز 18 مشحم في المستقيم بعناية وتضخيم مع 0.5-1 سم³ من الهواء. وهذا سيثبت أي تسرب في ملامسة مما يمكن إصلاحه بخياطة البوليبروبيلين توقف آخر باستخدام مسبار معقم لتمتد ملامسة.
    3. انتفاخ القولون باستخدام أنجيوكاثيتير قبل إزالة.
14. تأكد من أنه لا يوجد أي نزيف نشط. إذا لم يكن هناك، تطبيق ضغط لطيف مباشرة على النقطة من النزيف للحد الأدنى 1-2 مكان خياطة مرقئ كما هو موضح أعلاه في حالة استمرار النزيف.
15. العودة بلطف الأحشاء ميدياليزيد إلى موضعه التشريحية العادي (الشكل 5A).
16. إغلاق شق البطن (الشكل 5 (ب)).
    1. استخدام خيوط مجدول قابلة للامتصاص 4-0، ضع خياطة قيد تشغيل على طول الطبقة العضلية بدءاً من الجزء العلوي من الشق والتشطيب في الجانب السفلي للشق جدار البطن. تثبيت تعادل وقص خياطة ترك ذيول 5 ملم.
       ملاحظة: لا تتضمن عرضاً الأمعاء في إغلاق جدار البطن.
    2. كرر مع خياطة شعيرات 4-0 لإغلاق الجلد (الشكل 5).
17. تأكد من أن الحيوان كامل الحارة والجافة، لمنع انخفاض حرارة الجسم بعد العملية الجراحية.
18. مراقبة الحيوانات بعناية كما أنه يتعافى من التخدير. إدارة البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ كل ح 72 لمدة 2-3 أيام بعد العملية للسيطرة على الألم.  خلال فترة الانتعاش، الفئران وينبغي دراسة دقيقة يوميا لعلامات الخراج أو الانتان الصفاقى.  وينبغي أن تشمل المراقبة اللاحقة للعمليات الجراحية للألم والكرب: تقييد الحركة بما في ذلك هونتشينج نوع من الموقف، وعدم الأكل أو الشرب، والاستمالة لا السليم، التهاب المفرط حول الجرح، الافتقار إلى شفاء طبيعية في موقع شق، أو تداخل غير طبيعي.  يجب أن يكون الحيوان أي إثبات أي من هذه السلوكيات euthanized فورا CO₂ خنقاً لحد أدنى من 10 دقيقة تليها thoracotomy الثنائية ب.
19. مزيج 0.1 مغ/مل انروفلوكساسين مع الماوس لمياه الشرب لمدة 7 أيام بعد الجراحة لمنع العدوى داخل البطن أو الانتان بسبب تلوث البراز المرتبطة بالعملية.

2) حصاد الأنسجة أناستوموتيك

1. قبل استئصال الأنسجة أناستوموتيك، euthanize الماوس باستخدام طريقة إنسانية وافقت عليها اللجنة استخدام الحيوان المؤسسية.
   ملاحظة: تستند سياسة مؤسسية، ونحن euthanize حيواناتنا بوضعها في دائرة ثاني أكسيد الكربون مع 100% ضخ غاز ثاني أكسيد الكربون في 2 لتر في الدقيقة لمدة 5 دقائق قبل تنفيذ thoracotomy الثنائية.
2. تعقيم البطن مع الكلورهيكسيدين تليها إيثانول 70%.
3. جداً إعادة شق خط الوسط الأصلي مع مقص حاد. بدء تشغيل في القطب السفلي لشق السابقة وتوسيع هذا الخفض ﻷسلحته على الرهابه (الشكل 6A).
4. باستخدام مقص، قطع في طبقة العضلات، وبعد دخول الفضاء البريتوني، تمديد الخفض إلى أعلى وأسفل للشق. الحرص على تجنب إصابة الأمعاء عند دخول البطن أو الإخلال ملامسة، كما قد يكون هناك الأمعاء انضمت إلى شق أو موقع أناستوموتيك.
5. بدقة تنفيذ تناوب الحشوي الآنسي الأيسر فضح القولون السيني إصلاحه (الشكل 6B). هناك سيكون على الأرجح الأمعاء للامعاء الالتصاقات المحيطة بالإصلاح. بلطف وصراحة تشريح هذه الالتصاقات بعيداً عن موقع إصلاح. الحرص على عدم الإخلال ملامسة.
   1. تحديد موقع الإصلاح عن طريق تحديد موقع الذيول لخياطة البوليبروبيلين المستخدمة للإصلاح. استخدام مقص، وابتداء من 1 سم الدانية للإصلاح قطاع العرض عن طريق القولون تنازلي. كرر هذه الخطوة القاصي 1 سم لموقع ملامسة.
6. إزالة الجزء سيجمويدال بشدة تشريح القولون من مساريق المرفقة على طول الحدود الخلفي من القولون مع غرامة المقص (الشكل 7).
7. تحديد الحدود المساريقي العلوي للعينة القولون واستخدام مقص جيد لقص على طول الحدود المساريقي العلوي بطريقة طولية. هذا سوف إنشاء مقطع مربعة أو مستطيلة من القولون من العينة الاسطوانية إزالته من قبل (الشكل 8).
8. استخدام قلم وسم لترسيم الحدود لمكافحة المساريقي العلوي القولون قبل إزالة الجزء المتعلق القولون. بعد الإزالة، جعل قطع طولية بطول القولون مقابل الوسم. إصلاح ودمج وقطع الأنسجة عينة حسب الحاجة لعلم الأنسجة و/أو إيمونوستينينج.

النتائج

في 7 أيام بعد الجراحة، وينبغي أن تلتئم ملامسة جيدا. يمكن أن تحصد ملامسة النقاط الزمنية قبل وبعد سبعة أيام لأفضل توضيح مراحل الشفاء أناستوموتيك. في الشكل 9، يبين التحليل النسيجي تليفية (الكولاجين تصور تلطيخ trichrome) توسط استجابة العضلات الملساء ألفا-أكتين ميو...

Discussion

وهناك العديد من الخطوات الرئيسية لضمان النجاح والحد من معدلات الاعتلال/الوفيات المرتبطة بهذا الإجراء. أولاً، ضمان المعالجة الدقيقة للأنسجة المعوية والعناية لمنع الإصابة الجر عند الدورية الأحشاء لفضح القولون. التوتر لا مبرر له في الأمعاء أو مساريق يمكن الإصابة نخر الأمعاء الأمعاء أو الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H