Criação de uma anastomose colônica em ratos

Resumo

Fuga anastomótica ou avaria após a cirurgia é das principais causas de mortalidade e morbidade pós-operatória. A cirurgia para a criação de uma anastomose colônica é um método confiável e reprodutível para estudar os mecanismos de cicatrização de anastomoses.

Resumo

Anastomose intestinal é comumente realizada em operações eletivas e emergentes. Mesmo assim, anastomótica vazamentos são um altamente temida complicações de cirurgias do cólon e podem ocorrer em até 26% de anastomose cirúrgica, com mortalidade sendo até 39% para pacientes com tal um vazamento. Atualmente, ainda há uma escassez de dados, detalhando os mecanismos celulares de cura anastomótica. Elaboração de estratégias preventivas e modalidades de tratamento para fuga anastomótica poderia ser grandemente potencializado por uma melhor compreensão da cura anastomótica apropriado.

Um modelo murino é ideal como estudos anteriores mostraram que a anastomose murino é o mais clìnica semelhante ao caso humano em comparação com outros modelos animais. Oferecemos um modelo murino facilmente reproduzível de anastomose colônica em ratos que permitirá mais exemplo de cura anastomótica.

Introdução

Uma altamente temida complicação da anastomose cirúrgica do intestino é anastomótica avaria ou vazamento. Fuga anastomótica, o que provoca o derrame do conteúdo intraluminal na cavidade abdominal, é fatal e pode levar rapidamente a sepse abdominal; taxas de choque variam de 0,3% para 5,5% após a anastomose de intestino e subir para entre 0,5% e 26% para anastomose colônica^1,2. Taxas de mortalidade após vazamentos podem ser tão elevadas como 39% devido ao rápido início da sepse e rápida progressão para morte seguindo intraabdominal contaminação³. Estratégias preventivas e as modalidades de tratamento baseiam-se atualmente na fisiopatologia que não é totalmente compreendida.

Atualmente, anastomótica cura é muitas vezes comparada com a cicatrização de feridas cutâneas mais amplamente estudados, que está provando para ser um fac-símile relativamente pobre. Cicatrização ocorre em uma série de fases sobrepostas, começando com a fase de retardo inicial. Durante dias 0-4 após a criação da anastomose intestinal, a fase de retardo é definida por uma resposta inflamatória aguda que limpa a ferida de restos celulares. Em seguida, nos dias 3-4, proliferação fibroblástica e produção de colágeno tipifica a fase fibrophasia. Finalmente, dia 10, depois de um período prolongado de remodelação do colágeno é conhecido como a fase de maturação. É importante notar que força anastomótica é baixa e depende do apoio extrínseco de grampos colocados cirurgicamente ou sutura até que o colágeno é depositado⁴. Compreender o papel e sincronismo cada camada da parede intestinal desempenha na cicatrização de feridas anastomótica e o envolvimento em tipos de células inflamatória mediada como macrófagos, bem como elucidar marcadores de substituto para prever anastomótica falha ou sucesso poderia reduza significativamente a morbilidade, mortalidade e despesas de saúde do cólon operações⁵a seguir.

O modelo murino tem demonstrado em estudos anteriores para ser útil em imitando anastomose humana⁶. Enquanto existem exemplos populares, comprovados e bem estudados o modelo murino Colônico anastomótica, particularmente o método descrito por Komen et al ⁷, estes modelos favorecem ileocecal ou ascendente colocolonic anastomótica técnicas⁸. Estudos anteriores de pacientes humanos demonstraram diferença significativa nas taxas de vazamento entre ileocecal, colocolonic e anastomose colorretal, destacando a necessidade de mais modelos experimentais em diferentes localizações anatômicas. Métodos adicionais, popularmente usados visam desenvolver um modelo que intencionalmente cria uma fuga anastomótica, ao invés de elucidar os mecanismos celulares necessários para normal anastomótica ferida cura⁹. Modelos do rato tem sido tentados no passado, mas têm taxas de deiscência anastomótica e/ou sinais de vazamento (ou seja, formação de abscesso) significativamente mais baixo do que os seres humanos e ratos^6,7. Além disso, linhas experimentais mais geneticamente modificadas estão disponíveis em ratos do que ratos. Isto torna o modelo de rato menos útil para um modelo anastomótica. Além disso, suínos e caninos modelos tiveram investigação clínica menos do que o modelo murino^6,7.

Propomos um procedimento seguro, tecnicamente simples e rapidamente e facilmente reproduzível para a criação de uma anastomose colônica em um modelo murino que deveria facilitar mais investigação sobre o mecanismo underreported de ferida anastomótica cura¹⁰ .

Protocolo

O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade de Oklahoma Ciências centro institucional Animal cuidados de saúde e Comissão usar (IACUC) e está em conformidade com todas as orientações éticas institucionais relativas à utilização de animais de pesquisa. Além disso, todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos institucionais, estaduais e federais sobre pesquisas com animais experimentais.

Nota: Para este protocolo, usamos congenic feminino e masculino na raça camundongos C57BL6/J em 12 a 72 semanas de idade. Todos os mouses utilizados para este procedimento foram mantidos nas nossas instalações não-barreira para pelo menos uma semana antes da operação para adaptar-se ao bioma local. Animais foram autorizados para alimentar ao tempo de operação e usamos preparação intestinal mecânica oral nem lavagem retal antes do procedimento.

1) criação de Anastomoses

1. Autoclave os instrumentos cirúrgicos, aquecer a solução de irrigação salina e limpe todas as superfícies operativas com etanol a 70%.
2. Para induzir anestesia, posicione o mouse em uma caixa de indução que é conectada a um vaporizador. Entrega 2-3% de isoflurano em 1-2 L/min até ratos estão sedados.
3. Coloque o animal em um dispositivo de aquecimento, como uma almofada de aquecimento, para evitar a hipotermia.
4. Por via subcutânea injetar uma dose de tempo de 0,1 mg/kg de buprenorfina (3 µ g para um rato de 30 g) para analgesia pós-operatória e uma vez a dose de 10 mg/kg de enrofloxacina para profilaxia antibiótica no pré-operatório.
   Nota: Apesar de pré e pós-operatório de antibióticos não são necessários para esta operação, as orientações institucionais e o animal conta e usam o Comitê em nossa instituição recomendada seu uso em nossas instalações.
5. Coloque o cone de nariz anestésico ao redor do focinho do rato. Durante toda a operação, cuidadosamente monitorar a frequência respiratória do animal e ajustar a taxa de fluxo anestésico conforme necessário. Manter uma taxa respiratória em 30-40 respirações por minuto.
6. Use um aparador de cabelo, seguido por um agente depilatório para remover o cabelo da superfície inteira de pele do abdômen. Remova completamente o agente depilatório com gaze molhada com água ou 70% de etanol. Seque cuidadosamente o animal.
7. Antes de preparar o abdômen, fita os membros do rato para a almofada de aquecimento ou superfície operativa na extremidade de cada perna para impedir que o mouse deslocando durante a cirurgia. Desinfecte o abdômen com clorexidina. Inclua toda a área depilada, bem como o cabelo nas bordas da área raspada. Coloque um pano estéril sobre o mouse (figura 1A).
   1. Antes de drapejar, cortar a cortina para expor o abdome preparado uma pequena janela retangular ou ovoide.
      Nota: A janela deve expor o abdome inteiro do mouse mas cobrir a membros, cauda, cabeça e tórax. Cortamos uma janela de² a 3 x 4 cm para nossas operações (figura 1B).
   2. Faça um pequeno corte ao longo da linha mediana drape, desde a borda inferior em direção a janela retangular ou ovoide, para permitir o acesso do reto durante o procedimento (Figura 1).
8. Faça uma incisão de pele. Começar ao longo da linha mediana da parte inferior do abdome e faça uma incisão da pele com uma tesoura na vertical para o xifoide. Incise apenas a pele e evitar cortar a musculatura da parede abdominal (Figura 2A).
9. Segure a linha média da parede abdominal com fórceps e levante longe o conteúdo abdominal. Tendo o cuidado para não ferir as estruturas intra-abdominais, entalha o comprimento da fáscia abdominal mediana verticalmente com uma tesoura afiada. Estenda o comprimento da incisão da pele (Figura 2B).
10. Quando os intestinos são expostos, localize o ceco e intestino e girar as vísceras lado esquerdo medialmente para expor o descendente e o cólon sigmoide. Cubra a ponta romba com gel lubrificante e Avance cuidadosamente a sonda no recto para auxiliar na identificação do cólon descendente/sigmoide (Figura 3).
    Nota: Ao contrário dos humanos, o ceco rato é encontrado geralmente no quadrante superior esquerdo do abdômen. Tome cuidado para não perfurar a parede do intestino com a sonda nesta etapa. Se a parede do intestino é perfurada, encerrar o procedimento e eutanásia o mouse.
    1. Evite agarrar o ceco com pinça dentada ou cortantes. Em vez disso, use Pinças atraumáticas, aplicador com ponta, ou dedo suave manipulação para girar as vísceras de algodão.
    2. Uso aquecido solução salina estéril para garantir que o intestino exposto é mantido úmido durante todo o procedimento.
    3. Os dois pontos serão no lado esquerdo da linha mediana e anexado para o retroperitônio através do mesentério. Após a identificação, retire a sonda sem corte parcialmente para facilitar colotomy.
11. Execute colotomy transversal do cólon sigmoide.
    1. Segure cuidadosamente o cólon sigmoide superior a entrada pélvica com Pinças atraumáticas (Figura 4A).
    2. Usando microtesoura afiada, fazer um corte em todo o cólon sigmoide perpendicular à direção de cólon e estendendo-se através de 80-90% da largura do cólon. Isto ajudará a prevenir a retração de uma das extremidades do cólon para fora do campo cirúrgico e facilitar o reparo (Figura 4B).
    3. Se uma veia mesentérica é ferida durante o curso da rotação visceral ou colotomy, pressione cuidadosamente a pressão para até 2 min com gaze ou um cotonete. Se a hemorragia persistir após este tempo, coloque um figura de oito sutura de monofilamento de 8-0 em torno do ponto de sangramento.
       Nota: Se o intestino mostra sinais de necrose ou lesão após isto, encerrar o procedimento e eutanásia o mouse usando um método humano aprovado pelo seu Comité de uso institucional de animais.
12. Repare o colotomy sigmoide.
    1. Usando um driver de agulha Castroviejo, coloque 5-6 simples interrompida 8-0 inabsorvíveis polipropileno pontos para reparar a colostomia. Coloque as suturas 1mm afastados uns dos outros com mordidas de 0,5 mm.
       1. Tome cuidado para evitar as bordas do intestino de rolamento para o reparo tomando serosa ligeiramente mais do que a mucosa com cada ponto. Deixe as caudas de 5 mm de comprimento. Tenha cuidado para não acidentalmente captura circundante do intestino para a sutura (Figura 4).
          Nota: É útil começar a sutura na perto de borda mesentérica de colotomy, salvando o mesenteric-mais parte o colotomy para o final.
       2. No decorrer do reparo, sonda de dissecação ponta romba de avanço a trans-anal para abranger o reparo antes que as suturas finais. Isto ajudará a impedir um reparo muito estreito e diminuir taxas de estenose anastomótica.
13. Utilizando uma seringa de 10 mL, preenchida com solução salina aquecida, irriga o abdômen várias vezes. Se a superfície sob o mouse fica encharcada, seque o mouse ou mover o mouse para uma superfície seca, a fim de evitar a hipotermia.
    1. Use uma gaze estéril colocada sobre a incisão para absorver o excesso irrigação.
    2. Para a irrigação final, encha o abdômen com soro fisiológico estéril. Cuidadosamente, avançar uma angiocatheter de 18 G lubrificado no reto e inflar com 0,5-1 cm³ de ar. Isso irá demonstrar qualquer vazamento na anastomose do que pode ser reparado com outra sutura de polipropileno interrompida usando a sonda estéril para abranger a anastomose.
    3. Esvazie o cólon usando o angiocatheter antes da remoção.
14. Certifique-se de que não há nenhum sangramento ativo. Se houver, exerça uma ligeira pressão diretamente sobre o ponto de sangramento por 1-2 min. sutura hemostática de lugar conforme descrito acima, se o sangramento continua.
15. Retorne suavemente as vísceras medializadas à sua posição anatômica normal (Figura 5A).
16. Feche a incisão abdominal (Figura 5B).
    1. Usando o 4-0 reabsorvível trançada, coloque uma sutura correndo ao longo da camada muscular da parede abdominal, começando na parte superior da incisão e acabamento na face inferior da incisão. Instalar uma gravata e cortar a sutura deixando 5mm caudas.
       Nota: Não incorpore acidentalmente intestino no fechamento da parede abdominal.
    2. Repita com sutura de monofilamento de 4-0 para fechar a pele (Figura 5).
17. Certifique-se de que o animal inteiro é quente e seco, para evitar a hipotermia pós-operatória.
18. Monitore cuidadosamente o animal enquanto ele se recupera da anestesia. Administre a buprenorfina 0,1 mg/kg cada 72 h para 2-3 dias após o procedimento para controle da dor.  Durante o período de recuperação, os ratos devem ser cuidadosamente examinados diariamente para sinais de abscesso ou sepse peritoneal.  Deve incluir a observação pós-operatória para a dor e o sofrimento: restrição de movimento, incluindo curvar tipo de postura, falta de comer ou beber, aliciamento não adequada, excessiva inflamação ao redor da ferida, a falta de cicatrização normal no local da incisão, ou Não é normal fazer o ninho.  Qualquer animal demonstrando qualquer um destes comportamentos deve ser imediatamente sacrificado por CO₂ asfixia por um período mínimo de 10 min, seguido por toracotomia bilateral.
19. Misture 0,1 mg/mL de enrofloxacina com água potável do rato durante 7 dias após a cirurgia para prevenir a infecção abdominal ou sepse devido à contaminação fecal, associada com a operação.

2) colheita anastomótica tecido

1. Pouco antes da excisão de tecido anastomótica, eutanásia o mouse usando um método humano, aprovado pelo Comité de uso institucional de animais.
   Nota: Com base na política institucional, nós eutanásia em nossos animais, colocando-os em uma câmara de dióxido de carbono, com 100% infusão de gás de dióxido de carbono em 2 L/min para 5 min antes de executar a toracotomia bilateral.
2. Esterilize o abdômen com clorexidina seguida de etanol a 70%.
3. Re-entalha a incisão original com uma tesoura afiada. Começar no polo inferior da incisão anterior e estender este corte superiormente ao xifoide (figura 6A).
4. Usando a tesoura, corte na camada muscular e depois de entrar no espaço peritoneal, estender o corte a parte superior e inferior da incisão. Tome cuidado para evitar ferir o intestino, ao entrar no abdômen ou interromper a anastomose, como pode haver intestinal aderida à incisão ou anastomótico.
5. Cuidadosamente, execute uma rotação visceral medial esquerda expondo o cólon sigmoide reparado (Figura 6B). Provavelmente vai haver aderências do intestino para intestino circundantes a reparação. Suavemente e sem rodeios disse estas aderências longe do local de reparo. Tome muito cuidado para não perturbar a anastomose.
   1. Identifique o local de reparação, localizando as caudas da sutura de polipropileno usada para a reparação. Usando uma tesoura e começando a 1 cm proximal ao reparo, transecto transversalmente através do cólon descendente. Repita este passo 1cm distal ao local da anastomose.
6. Remova o segmento sigmoidal agudamente dissecando o cólon do mesentério anexado na borda posterior do cólon com tesoura fina (Figura 7).
7. Identificar a borda mesentérica do espécime do cólon e use tesoura fina para cortar ao longo do comprimento da borda mesentérica de forma longitudinal. Isto irá criar uma seção quadrada ou retangular do cólon do provete cilíndrico retirado anteriormente (Figura 8).
8. Use uma caneta para demarcar a fronteira antimesentérica do cólon antes da remoção do segmento do cólon. Após a remoção, fazer um corte longitudinal ao longo do comprimento do cólon em frente à marcação. Corrigir, incorporar e cortar o tecido da amostra conforme necessário para histologia e/ou immunostaining.

Resultados

7 dias após a cirurgia, a anastomose deve ser bem curada. A anastomose pode ser colhida em pontos de tempo antes e depois de sete dias para melhor ilustrar as fases da cicatrização anastomótica. Na Figura 9, a análise histológica mostra um fibrótico (colágeno visualizado pela coloração tricromo) resposta mediada por músculo liso alfa-actina myofibroblasts positivo. No entanto, achamos que os resultados das análises histológicas variar entre ratos...

Discussão

Existem várias etapas-chave para assegurar o sucesso e minimizar a morbidade/mortalidade associada com este procedimento. Primeiro, certifique-se de tratamento cuidadoso do tecido intestinal e tome cuidado para evitar lesão de tração quando as vísceras para expor os dois pontos de giro. Uma tensão indevida sobre o intestino ou mesentério podem lesão a necrose intestinal intestino ou vasculatura e causa longe do local da anastomose. Além disso, Pinças afiadas ou fórceps com dentes não deve ser usado para lidar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H