쥐에 있는 저 승 문 합의 창조

요약

Anastomotic 누설 또는 수술 후 고장 수술 후 병 적 상태와 사망률의 주요 원인입니다. 저 승 문 합을 만들기 위한 우리의 수술 anastomoses의 치유 메커니즘을 공부에 대 한 안정적이 고 재현 가능한 방법입니다.

초록

장 anastomoses 선택 및 응급 작업에서 일반적으로 수행 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, anastomotic 누수 저 승 수술의 높은 무서운된 합병증 이며 같은 누출 환자에 대 한 최대 39% 사망률과 수술 anastomoses의 최대 26%에서 발생할 수 있습니다. 현재, anastomotic 치유의 세포 메커니즘을 자세히 설명 하는 데이터의 소수 남아 있습니다. 예방 전략 및 anastomotic 누출에 대 한 치료 modalities 고안 적절 한 anastomotic 치유의 더 나은 이해에 의해 크게 potentiated 될 수 있습니다.

Murine 모델 이전 연구 murine 문 합은 가장 임상적으로 유사한 다른 동물 모델에 비해 인간의 경우에 이상적입니다. 쉽게 재현할 murine 모델 쥐에 대 한 추가 설명을 anastomotic 치유 수 있도록 저 승 문 합을 제공 합니다.

서문

내장의 수술 문 합의 높은 무서운된 합병증이입니다 anastomotic 고장 또는 누출. Anastomotic 누수를 복 부 구멍으로 intraluminal 내용의 흘림을 발생, 생명을 위협 하 고 수 있습니다 신속 하 게 리드 복 부 내 패 혈 증; 충격 속도 다음 작은 창 자 anastomoses, 5.5%로 0.3%에서 변화 하 고 0.5%와 26% 저 승 anastomoses^1,2사이 상승. 누수를 따라 사망률 때문에 패 혈 증과 죽음 intraabdominal 오염³다음에 빠른 진행의 신속 개시 39%로 높은 수 있습니다. 예방 전략 및 치료 modalities 현재 기준으로 완전히 이해 되지 않습니다 이상 합니다.

현재, anastomotic 치료는 종종에 비해 더 넓게 공부 피부 상처 치유는 상대적으로 가난한 팩스 것을 입증 하는. 치유 하는 것은 일련의 시작 초기 지연 위상으로 겹치는 단계에서 발생 합니다. 장 문 합의 창조 후 0-4 일 동안 지연 위상 세포질 파편의 상처를 지우고 하는 급성 염증 반응에 의해 정의 됩니다. 다음, 3-4 일 동안 fibroblastic 증식과 콜라겐의 생산에 fibrophasia 단계 대표. 마지막으로, 10 일 후 개장 하는 콜라겐의 장기간 성숙 단계로 알려져 있다. 그것은 anastomotic 강도 매우 낮은 이며 수술 배치 스테이플의 외부 지원에 따라 달라 집니다 또는 콜라겐은 입금된⁴까지 봉합 해야 합니다. 역할을 이해 하 고 타이밍 각 창 자 벽의 층 anastomotic 상처 치유 및 중재 염증 세포 종류 elucidating 대리 표식으로 대 식 세포, anastomotic 실패 예측에 관련 재생 하거나 성공 수 있습니다. 사망률, 사망, 및 다음 콜론 작업⁵의료 비용을 크게 줄일.

Murine 모델 이전 연구에서 인간의 문 합⁶을 흉내 낸에 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그러나 거기에 murine 저 승 anastomotic 모델의 코 멘 외. 에 의해 설명 하는 방법 특히 인기 입증 하 고 잘 공부 예 ⁷을 이러한 모델 부탁 ileocecal 또는 colocolonic anastomotic 기법⁸오름차순. 인간의 환자의 이전 연구 ileocecal, colocolonic 및 해 부 위치를 다양 한 추가 실험 모델에 대 한 필요성을 강조 하는 대 장 anastomoses 사이의 누출 속도에 큰 차이 설명 했다. 추가, 널리 사용 방법 보다는 의도적으로 만드는 anastomotic 누출 모델을 개발 하는 겨냥 정상적인 anastomotic 부상⁹치료에 필요한 세포 메커니즘을 명료 하 게. 쥐 모델 과거에 시도 하지만 anastomotic dehiscence의 속도 또는 누출 (즉, 농 양 형성) 인간과 쥐^6,7보다 훨씬 낮은의 흔적. 또한, 더 많은 유전자 변형된 실험 라인 쥐 쥐 보다 사용할 수 있습니다. 이것은 쥐 모델 anastomotic 모델에 대 한 보다 적게 유용 하다. 또한, 돼지 및 개 모델 murine 모델^6,7보다 적은 임상 조사를 했다.

우리 anastomotic 상처 치유^{10의 underreported 메커니즘으로 추가 조사를 촉진 해야 하는 murine 모델에서 저 승 anastomoses의 창조에 대 한 안전, 기술적으로 간단 하 고 쉽고 빠르게 재현할 수 절차 제안} .

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프로토콜

다음 프로토콜 오클라호마 대학 건강 과학 센터 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다 고 연구 동물의 사용에 관한 모든 기관 윤리 지침을 준수. 또한, 모든 실험 실험 동물 연구에 관한 제도, 주 및 연방 규정에 따라 수행 했다.

참고:이 프로토콜 사용 했습니다 여성 및 남성 congenic C57BL6/J 쥐에 자란 나이의 12 ~ 72 주에. 이 절차에 사용 되는 모든 마우스 작업 지역 biome에 적응을 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 우리의 비 장벽 시설에서 유지 했다. 작업의 시간에 먹이 동물 허용 되었다 고 우리 구두 기계적 대 장 준비도 절차 이전 직장 홍 사용.

Anastomoses의 창조 1)

1. 압력솥 수술 도구, 염 분 관개 솔루션 따뜻하고 철저 하 게 70% 에탄올과 모든 요원 표면 청소.
2. 마 취를 유도 하는 기화 기에 연결 된 유도 상자에 마우스를 놓습니다. 마우스는 진정 될 때까지 1-2 L/분 2-3 %isoflurane 제공 합니다.
3. 저체온증을 방지 하기 위해가 열 패드와 같이 지구 온난화 장치에 동물을 놓습니다.
4. 피하 주사 한 0.1 mg/kg buprenorphine (30 g 마우스에 대 한 3 µ g) 수술 후 진통의 시간 투여 및 한 번의 수술 전 항생제 예방을 위한 enrofloxacin 10 mg/kg의 복용량.
   참고: 사전 및 수술 후 항생제는이 작업에 필요 하지 않습니다, 비록 기관 지침 및 동물 조심 하 고 위원회를 사용 하 여 우리의 시설에서 그들의 사용을 권장 하는 우리의 교육 기관에서.
5. 마우스의 주 둥이 주위 마 취 코 콘을 놓습니다. 작업을 통해 신중 하 게 동물의 호흡 속도 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 유량을 조정. 분당 30-40 호흡에서 호흡 속도 유지 합니다.
6. Depilatory 에이전트 다음 머리 깎기를 사용 하 여 복 부의 전체 피부 표면에서 제거. 철저 하 게 물 또는 70% 에탄올과 젖는 거 즈와 depilatory 에이전트를 제거 합니다. 철저 하 게 건조 한 동물.
7. 복 부를 준비 하기 전에 마우스의 사지가 열 패드 또는 마우스 수술 하는 동안 이동 하지 않도록 하려면 각 다리의 끝에 요원 표면에 테이프. 액체와 함께 복 부를 소독. 머리의 면도 영역 가장자리에 뿐만 아니라 전체 면도 영역에 포함 됩니다. 마우스 (그림 1A) 위에 무 균 드 레이프를 놓습니다.
   1. 이전에 draping, 작은 난 형 또는 직사각형 창 준비 복 부를 노출 하는 드 레이프 잘라 놓습니다.
      참고: 창 마우스의 전체 복 부를 노출 하지만 팔 다리, 꼬리, 머리와 가슴을 커버 한다. 우리는 우리의 작업 (그림 1B)에 대 한 4 x 3 cm² 창 잘라.
   2. 드 레이프 중간으로 난 형 또는 직사각형 창 절차 (그림 1C) 동안 직장에 대 한 액세스를 허용 하도록 아래쪽 가장자리에서 따라 작은 슬릿을 확인 합니다.
8. 피부 절 개를 확인 합니다. 낮은 복 부의 중간에 따라 시작 하 고는 칼을 수직으로 위로 피부를 incise. 피부만을 incise 하 고 복 벽 근육 (그림 2A)를 절단 하지 않도록.
9. 복 부 내용에서 리프트를 집게와 복 부 벽의 중간을 잡고. 하지 돌보는 손상 intraabdominal 구조, 날카로운가 위를 세로로 중간 복 부 근 막의 길이 incise. 피부 절 개 (그림 2B)의 길이 확장 합니다.
10. 내장 노출 되 면 맹 그리고 작은 창 자, 찾아서 medially 내림차순와 sigmoid 콜론을 왼쪽 면 내장을 회전 합니다. 윤 활 젤리와 무딘 프로브 팁 코트 하 고 신중 하 게 하강/sigmoid 콜론 (그림 3)의 식별에 도움이 직장에 프로브를 사전.
    참고: 인간과 달리 마우스 맹은 일반적으로 발견은 복 부의 왼쪽된 상단 사분면에. 이 단계에서 프로브와 창 자 벽을 꿰뚫기 위하여 하지 주의. 창 자 벽을 천공 하는 경우 프로시저를 종료 하 고 마우스를 안락사.
    1. 맹 톱니 또는 날카로운 집게로 잡고 하지 마십시오. 대신 atraumatic 집게를 사용 하 여, 면 밀고 주걱 또는 내장 회전 부드러운 손가락 조작.
    2. 사용 노출된 장 절차에 걸쳐 촉촉한 유지 되도록 하 멸 균 식 염 수를 따뜻하게 합니다.
    3. 콜론은 midline의 왼쪽에 있을 것입니다 고 통해 retroperitoneum는 mesentery 됩니다. 식별, 후 colotomy를 촉진 하기 위하여 부분적으로 무딘 프로브를 철회 한다.
11. 가로 colotomy sigmoid 콜론의 수행 합니다.
    1. 부드럽게 atraumatic 집게 (그림 4A)와 골반 입구에 우수한 sigmoid 콜론을 파악.
    2. 날카로운 마이크로-가 위를 사용 하 여 확인 한 컷 sigmoid 콜론에 걸쳐 콜론과 콜론의 폭 80-90%에 걸쳐 확장의 방향에 수직 합니다. 이 수술 필드 콜론의 한쪽 끝의 수 축력을 방지 하 고 수리 (그림 4B)를 용이 하 게 도울 것 이다.
    3. Mesenteric 혈관 내장 회전 또는 colotomy의 과정 동안, 부상 하는 경우 부드럽게 거 즈와 솜 밀고 주걱 최대 2 분에 대 한 압력을 개최. 출혈이 지속 되 면이 시간 후, 숫자의 8 8-0 monofilament 봉합 출혈 점을 배치 합니다.
       참고: 창 괴 사 또는이 후에 상해의 흔적을 보여줍니다, 경우 절차를 종료 하 고 제도 동물성 사용 위원회가 승인 인간적 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사.
12. 시그모이드 colotomy를 복구 합니다.
    1. Castroviejo 바늘 드라이버를 사용 하 여 5-6 간단한 중단된 8-0 nonabsorbable 폴 리 프로필 렌 스티치는 인공 복구를 놓습니다. 봉합 0.5 m m 물기와 함께 서로 1 mm를 놓습니다.
       1. 각 스티치와 점 막 보다 약간 더 serosa 취 함으로써 복구에 창 자의 가장자리를 압 연 하지 않도록 주의 하십시오. 꼬리 길이가 5 mm을 둡니다. 알아서 하지 실수로 캐치 주변 장 봉합 (그림 4C)에.
          참고: 그것은 시작에 봉합 하는 데 도움이 마지막에 대 한 colotomy의 안티 mesenteric 가장 부분을 저장 하는 colotomy의 mesenteric 테두리 근처.
       2. 으로 복구 진행, 사전 트랜스 항문 블런트 밀고 절 개 프로브는 마지막 봉합 하기 전에 수리를 스팬 됩니다. 이것은 너무 좁은 복구를 방지 하 고 anastomotic만의 속도 감소 도움이 됩니다.
13. 예 열된 염 분 가득한 10 mL 주사기를 사용 하 여, 관개 복 부 여러 번. 마우스 아래 표면 젖 게 되 면, 마우스를 건조 하거나 저체온증을 피하기 위해 건조 표면에 마우스를 이동 합니다.
    1. 멸 균 거 즈 위에 절 개를 사용 하 여 과잉 관개를 흡수.
    2. 최종 관개에 멸 균 식 염 수로 복 부를 채우십시오. 조심 스럽게 윤 활된 18 G angiocatheter 항문에 고 팽창 0.5-1 c m³ 의 공기. 이 문 합에 걸쳐 불 임 프로브를 사용 하 여 다른 중단된 폴 리 프로필 렌 봉합으로 고쳐질 수 있다 보다는 문 합에 어떤 누출 든 지를 보여줄 것입니다.
    3. 제거 하기 전에 angiocatheter를 사용 하 여 콜론 폐
14. 없는 활성 출혈은 다는 것을 확인 하십시오. 경우, 계속 출혈 하는 경우 위에서 설명한 대로 1-2 분 장소 hemostatic 봉합에 대 한 출혈의 지점에 직접 부드러운 압력을 적용.
15. 부드럽게 위치로 그것의 정상적인 해부학 (그림 5A) medialized 내장을 반환 합니다.
16. 복 부 절 개 (그림 5B)를 닫습니다.
    1. 4-0 흡수 꼰된 봉합을 사용 하 여 실행 중인 봉합 절 개의 상단에서 시작 하 고 절 개의 열 등 한 측면에서 마무리 복 부 벽의 근육 층에 따라 배치 합니다. 넥타이 설치 하 고 5mm 꼬리를 떠나 봉합을 잘라.
       참고: 실수로 복 벽 마감에 소장을 통합 하지 마십시오.
    2. 피부 (그림 5C)을 4-0 monofilament 봉합으로 반복 합니다.
17. 온난 하 고 건조, 수술 후 저체온증을 방지 하기 위해 전체 동물 인지 확인 합니다.
18. 마 취에서 회복으로 신중 하 게 동물을 모니터링 합니다. 통증 제어를 위한 수술 후 2-3 일 동안 0.1 mg/kg buprenorphine 모든 72 h를 관리 합니다.  복구 기간 동안 마우스 시험 되어야 한다 신중 하 게 매일 농 양 또는 복 막 패 혈 증의 징후에 대 한.  통증과 고통에 대 한 수술 후 관찰을 포함 한다: hunching 유형의 자세, 식사 또는 술, 하지 적절 한 손질, 상처, 절 개의 사이트에서 정상적인 치유의 부족 주위 과도 한 염증의 부족을 포함 하 여 움직임의 제한 또는 안 정상 중첩입니다.  이러한 동작 중 하나를 시연 하는 어떤 동물 든 지 양자 thoracotomy 뒤 10 분의 최소 CO₂ 질에 의해 즉시 안락사 되어야 한다.
19. 복 부 내 감염 또는 작업과 관련 된 분 변 오염으로 인해 패 혈 증을 방지 하기 위해 수술 후 7 일 동안 마우스의 식 수와 enrofloxacin의 0.1 mg/mL를 혼합.

2) 수확 Anastomotic 조직

1. Anastomotic 조직의 절 개의 바로 전에 제도 동물성 사용 위원회가 승인 인간적 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사.
   양자 thoracotomy를 수행 하기 전에 5 분 동안 2 L/분 100% 이산화탄소 가스 주입 이산화탄소 챔버에 배치 하 여 우리의 동물을 안락사 참고: 기관 정책에 따라, 우리.
2. 70% 에탄올 뒤 액체와 복 부를 소독.
3. 날카로운가 위를 원래 중간 절 개를 다시 incise. 이전 절 개의 낮은 극에서 시작 하 고 위에 칼 (그림 6A) 하이 컷을 확장.
4. 근육 층으로 잘라가 위를 사용 하 여 복 막 공간을 입력 한 후, 위쪽 및 아래쪽의 절 개를 잘라. 장 절 개 또는 anastomotic 사이트에 붙어 있을 수 있으므로 복 부를 입력할 때 창 부상 또는 문 합을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
5. 조심 스럽게 수리 sigmoid 콜론 (그림 6B) 노출 왼쪽된 중간 내장 회전을 수행 합니다. 수리를 둘러싼 대 장 대 장 유착 가능성이 됩니다. 부드럽게 하 고 퉁 명 스럽게 수리의 사이트에서 이러한 유착 해 부. 문 합을 방해 하는 하지 상당한 주의 해 라.
   1. 수리를 위해 사용 하는 폴 리 프로필 렌 봉합의 꼬리를 찾아서 복구 사이트를 확인 합니다. 가 위를 사용 하 여 및 수리, 근 위 1 ㎝ 시작 transversely 내림차순 콜론 통해 transect. 문 합의 사이트에 1 cm 원심이 단계를 반복 합니다.
6. 급격히 콜론 콜론의 후부 국경 연결 된 mesentery에서 좋은 (그림 7) 위 해 부하 여 자형 세그먼트를 제거 합니다.
7. 콜론 샘플의 mesenteric 경계를 식별 하 고 좋은 위를 사용 하 여 경도 방식 mesenteric 국경의 길이 따라 잘라. 이것은 이전 제거는 원통형 시료 (그림 8)에서 콜론의 정사각형 또는 직사각형 섹션을 만듭니다.
8. 마킹 펜을 사용 하 여 콜론 세그먼트의 제거 전에 콜론의 안티 mesenteric 국경 경계선. 제거 후, 마크 반대 콜론의 길이 따라 세로 컷을 확인 합니다. 수정, 포함 및 조직학 및 immunostaining에 대 한 필요에 따라 샘플 티슈를 잘라.

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결과

수술 후 7 일에는 문 합 잘 치유 될 해야 합니다. 문 합 하기 전에 시간 지점에서 하 고 anastomotic 치유의 단계를 설명 하는 더 나은 7 일 후에 수확 될 수 있습니다. 그림 9에서 조직학 분석 보여줍니다 거리 (콜라겐 trichrome 얼룩에 의해 시각) 응답 중재 평활 근 알파 걸 긍정적인 myofibroblasts. 그러나, 우리는 조직학 분석 결과 마우스, 특히 다시 epithelializat...

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토론

이 절차와 관련 된 병 적/사망률을 최소화 하 고의 성공을 보장 하기 위해 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 장 조직의 주의 깊은 취급을 확인 하 고 부상을 방지 하기 위해 견인 때 결 노출 내장 회전 돌. 창 자 또는 mesentery에 과도 한 긴장에 부상을 창 자 또는 맥 관 구조와 원인 장 괴 사 문 합의 사이트에서 할 수 있다. 또한, 날카로운 집게 나 이빨으로 겸 해야 사용할 수 없습니다 창 처리 하.<...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6/J mice	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined Sterile Field, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Cut a rectangular hole
Isothesia isoflurane	Henry Schein	50033
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair depilatory cream	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorphine  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 cc insulin syringe, 27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Shampoo	Medline	APL82287
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
BioGel PI surgical gloves	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps with teeth	Roboz	RS-5150
Fine scissors- sharp	Fine Science Tools	14060-09
Straight serrated forceps	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo needle driver	Fine Science Tools	12565-14
0.9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	Warm to 37 °C prior to use
10 ml syringe	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl absorbable braided suture, 18", PS-2 needle	Henry Schein	6546037
Blue monofilament suture 24” BV-1 needle	Henry Schein	8305H	Usually comes double-armed. Cut the suture at the midway point to generate two usable sutures.
Cole-Parmer Microscissors, Standard Grade, Straight, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Sterile lubricating jelly	Medline	MDS032273H